一种合成胸腺法新的方法

摘要

本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成胸腺法新的方法。本发明所述方法按照胸腺法新肽链C端至N端的氨基酸顺序，合成1-8、9-19和20-28片段，然后再将这3个多肽片段偶联得到胸腺法新，本发明多个片段合成同时进行，合成周期减少了2/3，中间体易纯化，成本低，最终产品纯度高，副产物少，产品收率高，利于胸腺法新的大规模生产。

权利要求

1.一种合成胸腺法新的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在Lys侧链上、Glu侧链上偶联有保护基且在C端偶联有树脂的多肽树脂1；

固相合成在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列N端、Ser侧链上、Glu侧链上、Thr侧链上、Lys侧链上、Asp侧链上偶联有保护基的多肽片段1； 固相合成在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列N端偶联有乙酰基、在Ser侧链上、Thr侧链上、Asp侧链上偶联有保护基的多肽片段2； 步骤2、将多肽片段1的C段与多肽树脂1的N端进行偶联反应获得多肽树脂2； 步骤3、脱去多肽树脂2的N端保护基并与多肽片段2的C段进行偶联反应获得多肽树脂3，加入裂解液去除多肽树脂3的树脂以及所有保护基得到胸腺法新粗品； 步骤4、胸腺法新粗品微滤、RP-HPLC纯化后获得胸腺法新纯品。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述固相合成多肽树脂1为： 步骤A1、Fmoc-β-Asp（OtBu）-OH在偶联体系作用下与氨基树脂进行偶联反应得到Fmoc-β-Asp（OtBu）-氨基树脂； 步骤A2、脱除Fmoc保护基得到H-β-Asp（OtBu）-氨基树脂，Fmoc-Glu（OtBu）-OH在偶联体系作用下与H-β-Asp（OtBu）-氨基树脂进行偶联反应得到Fmoc-Glu（OtBu）-β-Asp（OtBu）-氨基树脂； 步骤A3、按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将

Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH按照步骤A2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，最后脱除N端Fmoc保护基得到H-Lys（Boc）-Glu（OtBu）-Val-Val-Glu（OtBu）-Glu（OtBu）-Ala-Glu（OtBu）-β-Asp（OtBu）-氨基树脂，即多肽树脂1； 其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述OtBu、Boc为氨基酸侧链保护基。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述氨基树脂为0.2-1.0mmol/g的Rink amide树脂、Rink amide AM树脂或Rink amide MBHA树脂。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述固相合成多肽片段1为： 步骤B1、Fmoc-Lys（Boc）-OH在DIPEA作用下与2-CTC树脂进行偶联反应得到Fmoc-Lys（Boc）-CTC树脂； 步骤B2、脱除Fmoc保护基得到H-Lys（Boc）-CTC树脂，Fmoc-Glu（OtBu）-OH在偶联体系作用下与H-Lys（Boc）-CTC树脂进行偶联反应得到Fmoc-Glu（OtBu）-Lys（Boc）-CTC树脂； 步骤B3、按照SEQ ID NO:2所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH，按照步骤B2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Ser（tBu）-Glu（OtBu）-Ile-Thr（tBu）-Thr（tBu）-Lys（Boc）-Asp（OtBu）-Leu-Lys（Boc）-Glu（OtBu）-Lys（Boc）-CTC树脂，加入裂解液去除2-CTC树脂，获得Fmoc-Ser（tBu）-Glu（OtBu）-Ile-Thr（tBu）-Thr（tBu）-Lys（Boc）-Asp（OtBu）-Leu-Lys（Boc）-Glu（OtBu）-Lys（Boc）-OH，即为多肽片段1； 其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述OtBu、tBu、Boc为氨基酸侧链保护基。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述固相合成多肽片段2为： 步骤C1、Fmoc-Ser（tBu）-OH在DIPEA作用下与2-CTC树脂进行偶联反应得到Fmoc-Ser（tBu）-CTC树脂； 步骤C2、脱除Fmoc保护基得到H-Ser（tBu）-CTC树脂，Fmoc-Thr（tBu）-OH在偶联体系作用下与H-Ser（tBu）-CTC树脂进行偶联反应得到Fmoc-Thr（tBu）-Ser（tBu）-CTC树脂； 步骤C3、按照SEQ ID NO:3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH，按照步骤C2偶联方式进行 氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Ala-Ala-Val-Asp（OtBu）-Thr（tBu）-Ser（tBu）-CTC树脂，脱除N端Fmoc保护基后得到H-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Ala-Ala-Val-Asp（OtBu）-Thr（tBu）-Ser（tBu）-CTC树脂，然后在N端进行乙酰化反应得到Ac-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Ala-Ala-Val-Asp（OtBu）-Thr（tBu）-Ser（tBu）-CTC树脂，加入裂解液去除2-CTC树脂，获得Ac-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Ala-Ala-Val-Asp（OtBu）-Thr（tBu）-Ser（tBu）-OH，即为多肽片段2； 其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述OtBu、tBu为氨基酸侧链保护基。

6.根据权利要求2、4或5任意一项所述方法，其特征在于，所述偶联体系为HOBt/DIC双试剂偶联体系、PyBOP/HOBt双试剂偶联体系、HATU/HOAT双试剂偶联体系或TBTU/HOBt双试剂偶联体系。

7.根据权利要求1、2、4或5任意一项所述方法，其特征在于，所述偶联反应以DCM、NMP、DMF、DMSO中的一种或两种以上为溶剂。

8.根据权利要求4或5任意一项所述方法，其特征在于，所述裂解液为体积比TFE:DCM为1:4的混合裂解液。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2和步骤3所述偶联反应以HOBt/DIC双试剂偶联体系、PyBOP/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系或HBTU/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系进行偶联。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3所述裂解液为体积比TFA：苯酚：苯甲硫醚：乙二硫醇：水为80-85:1-5:1-5:1-5:1-5的混合裂解。

说明书

一种合成胸腺法新的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成胸腺法新的方法。

背景技术

[0002] 胸腺法新（Thymosinα1，也称胸腺肽α1）是胸腺素主要的生物活性成分，为体内重要的免疫调节物质，是N端乙酰化的28个氨基酸组成的多肽，其肽序如下：

[0003] Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH

[0004] 本品治疗慢性乙型肝炎和增强免疫系统反应性的作用机制虽尚未完全阐明，但多项体外试验显示，本品通过刺激外周血液淋巴细胞丝裂原来促进T淋巴细胞的成熟，增加抗原或丝裂原激活后T细胞分泌的干扰素α、干扰素γ以及白介素2、白介素3等淋巴因子水平，同时增加T细胞表面淋巴因子受体水平。本品还可通过对CD4细胞的激活，增强异体和自体的人类混合淋巴细胞反应。本品可能增加前NK细胞的聚集，而干扰素可使其细胞毒性增强。体内试验显示，本品可以提高经刀豆蛋白A激活后小鼠淋巴细胞白介素2受体的表达水平，同时提高白介素2的分泌水平。

[0005] 目前胸腺法新制备工艺有基因工程法（如CN1431311）和固相合成法（如CN102199205），其中基因工程法因工艺繁琐、三废多的不利因素不如固相合成法应用普遍。专利CN102199205公开了一种多肽胸腺法新的合成方法，其采用逐个偶联的合成方式。然而，用逐个偶联法在制备胸腺法新的过程中，合成周期长，杂质较多（在长肽的合成中容易产生缺省肽等杂质），大部分杂质和目的多肽相似导致后续的纯化难以进行，收率和纯度无法达到较高水平。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成胸腺法新的方法，使得本发明所述方法能够提高其纯度和合成重量收率。

[0007] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0008] 一种合成胸腺法新的方法，包括以下步骤：

[0009] 步骤1、固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在Lys侧链上、Glu侧链上偶联有保护基且在C端偶联有树脂的多肽树脂1；

[0010] 固相合成在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列N端、Ser侧链上、Glu侧链上、Thr侧链上、Lys侧链上、Asp侧链上偶联有保护基的多肽片段1；

[0011] 固相合成在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列N端偶联有乙酰基、在Ser侧链上、Thr侧链上、Asp侧链上偶联有保护基的多肽片段2；

[0012] 步骤2、将多肽片段1的C段与多肽树脂1的N端进行偶联反应获得多肽树脂2；

[0013] 步骤3、脱去多肽树脂2的N端保护基并与多肽片段2的C段进行偶联反应获得多肽树脂3，加入裂解液去除多肽树脂3的树脂以及所有保护基得到胸腺法新粗品；

[0014] 步骤4、胸腺法新粗品微滤、RP-HPLC纯化后获得胸腺法新纯品。

[0015] 其中，作为优选，步骤2和步骤3所述偶联反应以HOBt/DIC双试剂偶联体系、PyBOP/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系或HBTU/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系进行偶联。进一步优选地，步骤2所述偶联反应以HBTU/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系进行偶联，步骤3所述偶联反应以PyBOP/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系进行偶联；

[0016] 步骤2和步骤3所采用的偶联体系各偶联试剂之间的摩尔比优选为：

[0017] PyBOP:HOBt:DIPEA为1:1:2，HBTU:HOBt:DIPEA为1:1:2，HOBt:DIC为1:1。

[0018] 作为优选，步骤3所述裂解液为体积比TFA：苯酚：苯甲硫醚：乙二硫醇：水为80-85:1-5:1-5:1-5:1-5的混合裂解液。

[0019] 作为优选，步骤2和步骤3所述偶联反应以DCM、NMP、DMF、DMSO中的一种或两种以上为溶剂，其中，作为进一步优选方案，步骤2和步骤3均为体积比DMF：DMSO为1:1的混合溶剂。

[0020] 作为优选，步骤1所述固相合成多肽树脂1为：

[0021] 步骤A1、Fmoc-β-Asp（OtBu）-OH在偶联体系作用下与氨基树脂进行偶联反应得到Fmoc-β-Asp（OtBu）-氨基树脂；

[0022] 步骤A2、脱 除Fmoc保护基得 到H-β-Asp（OtBu）-氨基树 脂，Fmoc-Glu（OtBu）-OH在偶联体系作用下与H-β-Asp（OtBu）-氨基树脂进行偶联反应得到Fmoc-Glu（OtBu）-β-Asp（OtBu）-氨基树脂；

[0023] 步骤A3、按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH按照步骤A2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，最后脱除N端Fmoc保护基得到H-Lys（Boc）-Glu（OtBu）-Val-Val-Glu（OtBu）-Glu（OtBu）-Ala-Glu（OtBu）-β-Asp（OtBu）-氨基树脂，即多肽树脂1；

[0024] 其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述OtBu、Boc为氨基酸侧链保护基。

[0025] 在固相合成多肽树脂1的优选方案中，进一步优选地，所述氨基树脂为0.2-1.0mmol/g的Rink amide树脂、Rink amide AM树脂或Rink amide MBHA树脂；

[0026] 在固相合成多肽树脂1的优选方案中，进一步优选地，所述偶联体系为HOBt/DIC双试剂偶联体系、PyBOP/HOBt双试剂偶联体系、HATU/HOAT双试剂偶联体系或TBTU/HOBt双试剂偶联体系，所采用的偶联体系各偶联试剂之间的摩尔比优选为：

[0027] PyBOP:HOBt为1:1，TBTU:HOBt为1:1，HOBt:DIC为1:1，HATU：HOAT为1:1。

[0028] 在固相合成多肽树脂1的优选方案中，进一步优选地，所述偶联反应以DCM、NMP、DMF、DMSO中的一种或两种以上为溶剂，优选为体积比DCM：DMF为1:1的混合溶剂。

[0029] 作为优选，步骤1所述固相合成多肽片段1为：

[0030] 步骤B1、Fmoc-Lys（Boc）-OH在DIPEA作用下与2-CTC树脂进行偶联反应得到Fmoc-Lys（Boc）-CTC树脂；

[0031] 步骤B2、脱除Fmoc保护基得到H-Lys（Boc）-CTC树脂，Fmoc-Glu（OtBu）-OH在偶联体系作用下与H-Lys（Boc）-CTC树脂进行偶联反应得到Fmoc-Glu（OtBu）-Lys（Boc）-CTC树脂；

[0032] 步骤B3、按照SEQ ID NO:2所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH，按照步骤B2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Ser（tBu）-Glu（OtBu）-Ile-Thr（tBu）-Thr（tBu）-Lys（Boc）-Asp（OtBu）-Leu-Lys（Boc）-Glu（OtBu）-Lys（Boc）-CTC树脂，加入裂解液去除2-CTC树脂，获得Fmoc-Ser（tBu）-Glu（OtBu）-Ile-Thr（tBu）-Thr（tBu）-Lys（Boc）-Asp（OtBu）-Leu-Lys（Boc）-Glu（OtBu）-Lys（Boc）-OH，即为多肽片段1；

[0033] 其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述OtBu、tBu、Boc为氨基酸侧链保护基。

[0034] 在固相合成多肽片段1的优选方案中，进一步优选地，所述偶联体系为HOBt/DIC双试剂偶联体系、PyBOP/HOBt双试剂偶联体系、HATU/HOAT双试剂偶联体系或TBTU/HOBt双试剂偶联体系，所采用的偶联体系各偶联试剂之间的摩尔比优选为：

[0035] PyBOP:HOBt为1:1，TBTU:HOBt为1:1，HOBt:DIC为1:1，HATU：HOAT为1:1。

[0036] 在固相合成多肽片段1的优选方案中，进一步优选地，所述偶联反应以DCM、NMP、DMF、DMSO中的一种或两种以上为溶剂，优选为体积比DCM：DMF为1:1的混合溶剂。

[0037] 在固相合成多肽片段1的优选方案中，进一步优选地，所述裂解液为体积比TFE:DCM为1:4的混合裂解液。

[0038] 作为优选，步骤1所述固相合成多肽片段2为：

[0039] 步骤C1、Fmoc-Ser（tBu）-OH在DIPEA作用下与2-CTC树脂进行偶联反应得到Fmoc-Ser（tBu）-CTC树脂；

[0040] 步骤C2、脱除Fmoc保护基得到H-Ser（tBu）-CTC树脂，Fmoc-Thr（tBu）-OH在偶联体系作用下与H-Ser（tBu）-CTC树脂进行偶联反应得到Fmoc-Thr（tBu）-Ser（tBu）-CTC树脂；

[0041] 步骤C3、按照SEQ ID NO:3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH，按照步骤C2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Ala-Ala-Val-Asp（OtBu）-Thr（tBu）-Ser（tBu）-CTC树脂，脱除N端Fmoc保护基后得到H-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Ala-Ala-Val-Asp（OtBu）-Thr（tBu）-Ser（tBu）-CTC树脂，然后在N端进行乙酰化反应得到Ac-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Ala-Ala-Val-Asp（OtBu）-Thr（tBu）-Ser（tBu）-CTC树脂，加入裂解液去除2-CTC树脂，获得Ac-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Ala-Ala-Val-Asp（OtBu）-Thr（tBu）-Ser（tBu）-OH，即为多肽片段2；

[0042] 其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述OtBu、tBu为氨基酸侧链保护基。

[0043] 在固相合成多肽片段2的优选方案中，进一步优选地，所述偶联体系为HOBt/DIC双试剂偶联体系、PyBOP/HOBt双试剂偶联体系、HATU/HOAT双试剂偶联体系或TBTU/HOBt双试剂偶联体系，所采用的偶联体系各偶联试剂之间的摩尔比优选为：

[0044] PyBOP:HOBt为1:1，TBTU:HOBt为1:1，HOBt:DIC为1:1，HATU：HOAT为1:1。

[0045] 在固相合成多肽片段2的优选方案中，进一步优选地，所述偶联反应以DCM、NMP、DMF、DMSO中的一种或两种以上为溶剂，优选为体积比DCM：DMF为1:1的混合溶剂。

[0046] 在固相合成多肽片段2的优选方案中，进一步优选地，所述裂解液为体积比TFE:DCM为1:4的混合裂解液。

[0047] 在固相合成多肽片段2的优选方案中，进一步优选地，所述乙酰化反应通过乙酸酐在碱性条件下和N端氨基进行乙酰化反应。

[0048] 在本发明技术方案中，所述2-CTC树脂替代度优选为0.2-1.0mmol/g。在本发明步骤1优选的合成步骤中，除本发明所限定的保护基外，也可以采用其他合适的保护基对氨基酸N端和侧链加以保护。

[0049] 在步骤1优选的合成步骤中，延伸偶联的单个保护氨基酸与偶联体系中的偶联剂的摩尔比优选为1:1-1.2。

[0050] 作为优选，步骤2所述多肽片段1和多肽树脂1的摩尔比为2-5:1，步骤3所述多肽片段2和多肽树脂2的摩尔比为2-5:1。

[0051] 在本发明所述方法中，首先按照胸腺法新肽序合成1-8、9-19和20-28片段，然后再将这3个多肽片段偶联得到胸腺法新，以胸腺法新主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式：

[0052] Ac-Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val5-Asp6-Thr7-Ser8-Ser9-Glu10-Ile11-Thr12-Thr13-Lys1415 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
-Asp -Leu -Lys -Glu -Lys -Lys -Glu -Val -Val -Glu -Glu -Ala -Glu -Asn -OH[0053] SEQ ID NO:1所示氨基酸序列即为上式中编号20-28的多肽序列。本发明在步骤
1中固相合成的多肽树脂1是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上，在其Lys侧链上、Glu侧链上偶联有保护基且在C端偶联有树脂；SEQ ID NO:2所示氨基酸序列即为上式中编号
9-19的多肽序列，多肽片段1是在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列基础上，在其N端、Ser侧链上、Glu侧链上、Thr侧链上、Lys侧链上、Asp侧链上偶联有保护基；SEQ ID NO:3所示氨基酸序列即为上式中编号1-8的多肽序列，多肽片段2是在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列基础上，在其N端偶联有乙酰基、在Ser侧链上、Thr侧链上、Asp侧链上偶联有保护基；以上在本技术领域可以通过保护氨基酸合成原料进行合成。

[0054] 本发明所述保护基是在氨基酸合成领域中用以保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基、巯基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质。在本技术领域，对于氨基酸侧链需要保护的基团、侧链结构以及如何偶联保护基为本领域技术人员公知。本发明中对偶联有保护基的氨基酸表示形式也是本领域常用表示形式，为本领域技术人员所熟知，如Fmoc-Asp（OtBu）-OH，Fmoc为氨基酸N端保护基，括号里的OtBu为Asp侧链保护基，本发明其他保护氨基酸合成原料除非特殊说明均可参照此解释。

[0055] 特殊的情况，对于本发明在合成中采用的Fmoc-β-Asp（OtBu）-OH保护氨基酸，其具有两个羧基，即主链的α-COOH和侧链的β-COOH，Fmoc-β-Asp（OtBu）-OH中OtBu保护的是主链α-COOH，而侧链的β-COOH用于和氨基树脂偶联成酰胺键，在最后裂解除去氨基树脂时，裂解液并不是切除酰胺键，而是将氨基从氨基树脂上切下，如此便使Asp形成了Asn，和胸腺法新第28个氨基酸一致。

[0056] 本发明所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与树脂偶联后，剩余氨基酸按照各自序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应（主链氨基和羧基的缩合反应）进行偶联。在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端Fmoc保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识，本发明优选用DBLK（即20%哌啶的DMF溶液，体积比）脱除N端保护基。由于不断有氨基酸和树脂偶联，所合成的多肽片段树脂是不断变化的，作为优选，每个待偶联的保护氨基酸合成材料与之前已经合成的多肽片段树脂的摩尔比为2-3:1，此优选比例适用于本发明所有方案中。

[0057] 作为优选，所述RP-HPLC纯化具体为：

[0058] 将胸腺法新粗品用体积百分数为10%的乙腈水超声溶解后，采用RP-HPLC系统，波长214nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，常规0.1%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分得到胸腺法新纯品。

[0059] 在临床应用中，胸腺法新本身不太稳定，需要以醋酸盐形式存在，故本发明还包括将胸腺法新纯品用RP-HPLC系统转盐步骤，具体为：

[0060] 将胸腺法新纯品溶液采用RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到胸腺法新醋酸盐。

[0061] 由本发明所述方法合成的胸腺法新经RP-HPLC检测，粗品纯度为78.6%左右，合成重量收率为100%，纯化后纯品纯度大于99%，总收率为42%左右。而专利CN102199205中胸腺法新粗品纯度最高为69.6%，合成重量收率最高为63.7%，均明显低于本发明合成的胸腺法新。此外，本发明为了进一步验证只有适宜的片段合成方法才能够达到本发明的纯度以及收率，分别按照不同于本发明的片段数进行固相合成，结果显示，其合成的胸腺法新的纯度和总收率均低于本发明。

[0062] 由以上技术方案可知，本发明按照胸腺法新肽序合成1-8、9-19和20-28片段，然后再将这3个多肽片段偶联得到胸腺法新，本发明多个片段合成同时进行，合成周期减少了2/3，中间体易纯化，成本低，最终产品纯度高，副产物少，产品收率高，利于胸腺法新的大规模生产。

具体实施方式

[0063] 本发明公开了一种合成胸腺法新的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0064] 在本发明具体实施方式中，所有偶联由保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于吉尔生化有限公司，所用树脂购自于天津南开和成有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。

[0065] 表1英文缩写释义

[0066]

[0067]

[0068] 在本发明合成多肽片段1、多肽片段2的过程中，从滤液中沉淀出多肽片段1和2可采用正己烷和乙醚沉淀法实现，而胸腺法新粗品可直接用乙醚沉淀出。

[0069] 下面结合实施例，进一步阐述本发明。

[0070] 实施例1：多肽树脂1的制备

[0071] 1、Fmoc-β-Asp（OtBu）-Rink amide树脂制备

[0072] 取替代度sub=0.8mmol/g的Rink amide树脂（20g，16mmol），加入到反应柱中，用DMF溶涨30分钟以上，抽干DMF，用DBLK（含20%哌啶的DMF溶液）脱除树脂的氨基保护基Fmoc，每次脱脱除反应5分钟，共两次，脱除完毕后用DMF洗涤6次，抽干待投料。

[0073] 称取Fmoc-β-Asp（OtBu）-OH(6.6g，16mmol)、HOBt（2.6g，19.2mmol）用DMF（40ml）和DCM（40ml）溶解后冰浴条件下加DIC（2.4g，19.2mmol），活化5分钟后加入到反应柱中，60分钟后反应结束，树脂分别用DMF洗涤三次，加入封闭液（吡啶（20ml）和乙酸酐（22ml）），反应2小时后抽干，DMF洗涤6次。再用加入适量的甲醇洗涤3次，每次10分钟，减压干燥得到Fmoc-β-Asp（OtBu）-Rink amide Resin（22.5g），其替代度为0.18mmol/g。

[0074] 2、多肽树脂1的制备

[0075] 称取替代度为0.18mmol/g的Fmoc-β-Asp（OtBu）-Rink amide树脂（22.5g，4mmol），加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将Fmoc-Glu（OtBu）-OH（5.1g，12mmol）、HOBt（1.8g，13.2mmol），溶于体积比为1:1的DCM（30ml）和DMF（30ml）混合溶液，冰浴条件下加入DIC（1.7g，
13.2mmol），活化5分钟后将溶液加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH进行氨基酸延伸偶联，最后用DBLK脱除Fmoc保护，得到H-Lys（Boc）-Glu（OtBu）-Val-Val-Glu（OtBu）-Glu（OtBu）-Ala-Glu（OtBu）-β-Asp（OtBu）-氨基树脂，即多肽树脂1。

[0076] 实施例2：多肽片段1的制备

[0077] 称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂（40g，20mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取Fmoc-Lys(Boc)-OH(28.1g,60mmol)溶于体积比为1:1的DCM（30ml）和DMF（30ml）混合溶液，冰浴条件下加入DIPEA（15.5g，120mmol），活化5分钟后将溶液加入固相反应柱中，室温反应2h，反应结束后用封闭液（DIPEA：甲醇：DCM=1:2:17v:v）封闭三次，每次3min。封闭液体体积按4.0ml/克树脂计算。再用加入适量的甲醇洗涤3次，每次10分钟,用DMF洗涤6次。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。

[0078] 将Fmoc-Glu（OtBu）-OH（25.5g，60mmol）、HOBt（8g，60mmol），溶于体积比为1:1的DCM（60ml）和DMF（60ml）混合溶液，冰浴条件下加入DIC（7.6g，60mmol），活化5分钟后将溶液加入固相反应柱中，室温反应2h,（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照SEQ ID NO:2所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH，进行氨基酸延伸偶联，结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-Ser（tBu）-Glu（OtBu）-Ile-Thr（tBu）-Thr（tBu）-Lys（Boc）-Asp（OtBu）-Leu-Lys（Boc）-Glu（OtBu）-Lys（Boc）-CTC树脂95.6g；

[0079] 将上述Fmoc-Ser（tBu）-Glu（OtBu）-Ile-Thr（tBu）-Thr（tBu）-Lys（Boc）-Asp（OtBu）-Leu-Lys（Boc）-Glu（OtBu）-Lys（Boc）-CTC树脂，加入至2L烧瓶中。配置裂解试剂1000ml（体积比，TFE：DCM=1:4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应3h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸至400ml左右，滴加至4000ml沉淀试剂中（体积比，正己烷：乙醚=1:4），离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到Fmoc-Ser（tBu）-Glu（OtBu）-Ile-Thr（tBu）-Thr（tBu）-Lys（Boc）-Asp（OtBu）-Leu-Lys（Boc）-Glu（OtBu）-Lys（Boc）-OH，即为多肽片段1，将粗品溶于水后冻干，得42.0g多肽片段1，纯度90%。

[0080] 实施例3：多肽片段2的制备

[0081] 称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂（40g，20mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取Fmoc-Ser（tBu）-OH(23.0g,60mmol)溶于体积比为1:1的DCM（30ml）和DMF（30ml）混合溶液，冰浴条件下加入DIPEA（15.5g，120mmol），活化5分钟后将溶液加入固相反应柱中，室温反应2h,反应结束后用封闭液（DIPEA：甲醇：DCM=1:2:17v:v）封闭三次，每次3min。封闭液体体积按4.0ml/克树脂计算。再用加入适量的甲醇洗涤3次，每次10分钟，用DMF洗涤6次。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。

[0082] 将Fmoc-Thr（tBu）-OH（23.8g，60mmol）、HOBt（8g，60mmol），溶于体积比为1:1的DCM（60ml）和DMF（60ml）混合溶液，冰浴条件下加入DIC（7.6g，60mmol），活化5分钟后将溶液加入固相反应柱中，室温反应2h,（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照SEQ ID NO:3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH，进行氨基酸延伸偶联，偶联后DBLK脱除Fmoc保护基，加入吡啶（23.7g，200mmol）和乙酸酐（20.4g，200mmol），乙酰化反应3小时，反应结束后，DMF洗涤6次，用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Ac-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Ala-Ala-Val-Asp（OtBu）-Thr（tBu）-Ser（tBu）-CTC树脂65.5g。

[0083] 称取上述Ac-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Ala-Ala-Val-Asp（OtBu）-Thr（tBu）-Ser（tBu）-CTC树脂65.5g，加入至1L烧瓶中。配置裂解试剂700ml（体积比，TFE：DCM=1:4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应3h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸至200ml左右，滴加至2000ml沉淀试剂中（体积比，正己烷：乙醚=1:4），离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到Ac-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Ala-Ala-Val-Asp（OtBu）-Thr（tBu）-Ser（tBu）-OH，即为多肽片段2，将粗品溶于水后冻干，得23.1g多肽片段2，纯度92%。

[0084] 实施例4：多肽树脂2的制备

[0085] 称取实施例2合成的多肽片段1(42g，20mmol)、HBTU（7.6g，20mmol）、HOBt（2.7g，20mmol），用DMF和DMSO为1:1的混合液溶解后加入冰浴条件下加入DIPEA（5.2g，40mmol），混合液加入实施例1合成的多肽树脂1的固相反应柱中（4mmol），室温反应3h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）得到多肽树脂2。

[0086] 实施例5：多肽树脂3的制备

[0087] 用DBLK脱除多肽树脂2的N端Fmoc保护基，然后用DMF洗涤6次；

[0088] 称取实施例3合成的多肽片段2(23.1g，20mmol)、PyBOP（10.4）、HOBt（2.7g，20mmol），用DMF和DMSO为1:1的混合液溶解后加入冰浴条件下加入DIPEA（5.2g，40mmol），混合液加入实施例4合成的多肽树脂2的固相反应柱中，室温反应3h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。
然后用DMF洗涤6次，甲醇缩干得到42.5g多肽树脂3。

[0089] 实施例6：多肽树脂3裂解得到胸腺法新粗品

[0090] 将实施例5中的42.5g多肽树脂3加入到1000ml烧瓶中，配置裂解试剂500ml（体积比，TFA:DET:PHSH:PHOH:H2O=80:5:5:5:5），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应3小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。滴加至5000ml乙醚试剂中，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到14.2g粗品胸腺法新，纯度78.6%，合成重量收率100%。

[0091] 实施例7：粗品胸腺法新经纯化得到产品胸腺法新

[0092] 将实施例6中的胸腺法新粗品水溶液用0.45um微孔滤膜过滤。采用Waters2545RP-HPLC系统，波长214nm，色谱柱为50×250mm反相C8柱，常规0.1%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于99%纯品。

[0093] 将胸腺法新纯品溶液采用RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到胸腺法新醋酸盐5.2g，HPLC纯度99.4%，总收率42.0%。

[0094] 实施例8：不同片段合成试验

[0095] 为了进一步验证只有适宜的片段合成方法才能够达到本发明的纯度以及收率，分别按照不同于本发明的片段数进行固相合成，合成方法与本发明相同，结果见表2。

[0096] 表2不同合成方案的胸腺法新纯度和收率

[0097]

[0098] 由表2可知，未按照本发明合成方案合成的胸腺法新（方法1-3），其粗品纯度以及总收率均不如本发明的合成方案（方法4），由此表明，按照不同片段数进行合成对胸腺法新的纯度以及收率具有很大影响，只有按照合适的合成方案方可达到本发明的目的。

[0099] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。