一种针对H2A.Z变体的纳米抗体、其编码序列及应用转让专利
申请号 : CN201310443530.9
文献号 : CN103497253A
文献日 : 2014-01-08
发明人 : 万亚坤 , 母亚雯 , 孙燕燕
申请人 : 东南大学
摘要 :
本发明为针对于一种针对H2A.Z变体的纳米抗体、其编码序列及应用，同时还公布了编码该纳米抗体的基因序列，制备所述纳米抗体的方法，表达或能够表达该纳米抗体的宿主细胞。一种针对组蛋白H2A.Z变体的纳米抗体VHH链，包括框架区和互补决定区；其中所述的框架区为4个，分别为FR1-FR4;所述的互补决定区为CDR1-CDR3的氨基酸序列，其中，CDR1:为SEQNO.16-SEQNO.18所示的氨基酸序列；CDR2:为SEQNO.19-SEQNO.21所示的氨基酸序列;CDR3:为SEQNO.22-SEQNO.24所示的氨基酸序列。该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，可应用于癌症相关蛋白高表达以及相关转录调控机制的研究。
权利要求 :
1.一种针对组蛋白H2A.Z变体的纳米抗体VHH链，包括框架区和互补决定区；其特征在于，其中所述的框架区为4个，分别为FR1-FR4，其中，FR1：为SEQ NO.4- SEQ NO.6所述的氨基酸序列; FR2：为SEQ NO.7- SEQ NO.9所示的氨基酸序列; FR3：为SEQ NO.10- SEQ NO.12所示的氨基酸序列; FR4：为SEQ NO.13- SEQ NO.15所示的氨基酸序列;所述的互补决定区为CDR1-CDR3的氨基酸序列，其中，CDR1:为SEQ NO.16- SEQ NO.18所示的氨基酸序列；CDR2: 为SEQ NO.19- SEQ NO.21所示的氨基酸序列;CDR3: 为SEQ NO.22- SEQ NO.24所示的氨基酸序列。
2.一种针对组蛋白 H2A.Z变体的纳米抗体，其特征在于，包括权利要求1所述的纳米抗体VHH链。
3.根据权利要求2所述的针对组蛋白H2A.Z变体的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体为H2A.Z#11，H2A.Z#74，H2A.Z#95，其中H2A.Z#11的氨基酸序列为SEQNO.1所示；H2A.Z#74的氨基酸序列为SEQNO.2所示，H2A.Z#95的氨基酸序列为SEQNO.3所示。
4.一种DNA分子，其特征在于，编码包含SEQNO.1-SEQNO.3任一所示的氨基酸序列。
5.一种编码权利要求2或3所述的针对组蛋白H2A.Z变体的纳米抗体的核酸序列，包括框架区和可变区，其特征在于，包含SEQNO.25- SEQ NO.27所示的氨基酸序列。
6.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2或3所述的针对组蛋白H2A.Z变体的纳米抗体的表达载体。
7.权利要求2或3所述的针对组蛋白H2A.Z变体的纳米抗体在制备肿瘤诊断试剂盒或工具中的应用。
说明书 :
一种针对H2A.Z变体的纳米抗体、其编码序列及应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明为针对一种组蛋白变体H2A.Z的抗原表位的纳米抗体(或称单域抗体片段，single domain antibody fragment)，同时还公布了编码该纳米抗体的氨基酸序列，制备所述纳米抗体的方法，表达或能够表达该纳米抗体的宿主细胞。该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，可应用于癌症相关蛋白高表达机制以及相关转录调控机制的研究。
背景技术
[0003] 真核生物的基因组在细胞中被高度地压缩形成染色质。染色质结构的基本单位是核小体，核小体是由4 种核心组蛋白 H2A，H2B，H3 和 H4形成的组蛋白八聚体构成，每一种组蛋白都由两个分子形成，约147bp左右的DNA缠绕在组蛋白八聚体上形成一个核小体单位，组蛋白H1结合在两个相邻核心组蛋白间，可以锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。而组蛋白变体是相对于染色体中常规组蛋白而言的，是特殊状态的染色体所需的组蛋白类型。处于不同状态的染色质需要相应的组蛋白变体维持其结构，以完成其生物学功能。在核心组蛋白中，组蛋白H2A最不保守，变体最多，其中对H2A.Z 变体的研究非常广泛，它和常规组蛋白H2A 在 N- 和 C- 末端具有不同的氨基酸组成。H2A.Z 对基因表达调控的影响最先在四膜虫细胞中被证实。随后的一些研究表明，H2A.Z普遍存在于真核生物细胞中，从酵母到哺乳类动物具有极强的进化保守性，它替代H2A整合到染色体上，与H2B形成的二聚体使DNA对核小体的缠绕相对比较松，保护常染色质，防止异染色质的形成，对基因的表达起着重要的调控作用。有文章报道指出：常染色质上活动和不活动的基因5’端均富含组蛋白变体H2A.Z。H2A.Z也与DNA甲基化有密切的联系。H2A.Z在胚胎干细胞的分化过程中也起着重要的作用。
[0004] 纳米抗体技术，是在传统抗体制备的基础上，运用分子生物学技术融合纳米粒子概念进行的抗体工程革命，从而研发出的最新、最小的抗体分子。普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而1993年 , Hamers-Casterman等报道从骆驼血液中发现的新型抗体天然缺失轻链,只有两条重链,即重链抗体 (HCAbs)。它具有独特的重链可变区 (VHH) ,一个铰链区和两个恒定区 (CH2和 CH3)。恒定区CH1是与轻链锚定的部位 , 存在于纳米抗体的基因组中, 但在mRNA形成中被剪切掉 , 所以纳米抗体缺乏轻链。因此，纳米抗体仅靠3个 CDRs就具备了特异的抗原结合能力和高亲合力 , 而普通抗体则需要 6个CDRs。这些“重链抗体”能像正常抗体一样与抗原等靶标紧紧结合，但不像单链抗体那样相互黏连聚集成块。克隆重链抗体的可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体称为 VHH抗体 ( variable domain of heavy chain of heavy chain antibody) 。其晶体结构直径
215 nm、长 4 nm，分子量只有普通抗体的1/10，化学性质很灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易、容易获得且容易偶联其他分子，并具有独特的识别构造表位，可作为肿瘤诊断的工具。因此制备与癌症和转录调控密切相关的H2A.Z的纳米抗体具有广阔的前景。
215 nm、长 4 nm，分子量只有普通抗体的1/10，化学性质很灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易、容易获得且容易偶联其他分子，并具有独特的识别构造表位，可作为肿瘤诊断的工具。因此制备与癌症和转录调控密切相关的H2A.Z的纳米抗体具有广阔的前景。
发明内容
[0005] 解决的技术问题：本发明的目的是提供一种针对H2A.Z变体的纳米抗体、其编码序列及应用，针对组蛋白H2A.Z表位的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及在制备用于肿瘤治疗药物中的应用。
[0006] 技术方案：一种针对组蛋白H2A.Z变体的纳米抗体VHH链，包括框架区和互补决定区；其中所述的框架区为4个，分别为FR1-FR4，其中，FR1：为SEQ NO.4- SEQ NO.6所述的氨基酸序列; FR2：为SEQ NO.7- SEQ NO.9所示的氨基酸序列; FR3：为SEQ NO.10- SEQ NO.12所示的氨基酸序列; FR4：为SEQ NO.13- SEQ NO.15所示的氨基酸序列;所述的互补决定区为CDR1-CDR3的氨基酸序列，其中，CDR1:为SEQ NO.16- SEQ NO.18所示的氨基酸序列；CDR2: 为SEQ NO.19- SEQ NO.21所示的氨基酸序列;CDR3: 为SEQ NO.22- SEQ NO.24所示的氨基酸序列。
[0007] 一种针对组蛋白 H2A.Z变体的纳米抗体，包括权利要求1所述的纳米抗体VHH链。
[0008] 所述的纳米抗体为H2A.Z#11，H2A.Z#74，H2A.Z#95，其中H2A.Z#11的氨基酸序列为SEQNO.1所示；H2A.Z#74的氨基酸序列为SEQNO.2所示，H2A.Z#95的氨基酸序列为SEQNO.3所示。
[0009] 一种DNA分子，编码包含SEQNO.1-SEQNO.3任一所示的氨基酸序列。
[0010] 一种编码所述的针对组蛋白H2A.Z变体的纳米抗体的核酸序列，包括框架区和可变区，包含SEQNO.25- SEQ NO.27所示的氨基酸序列。
[0011] 一种宿主细胞，包含所述的针对组蛋白H2A.Z变体的纳米抗体的表达载体。
[0012] 所述的针对组蛋白H2A.Z变体的纳米抗体在制备肿瘤诊断试剂盒或工具中的应用。
[0013] 有益效果：本发明首先表达人源组蛋白H2A.Z抗原，然后将其偶联在酶标板上，展示该蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），筛选得到H2A.Z特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
附图说明
[0014] 图1是H2A.Z抗原纯化SDS-聚丙烯凝胶电泳图，从左到右各蛋白带分别是：第一条为蛋白分子标准，第二条为纯化前的H2A.Z蛋白，第三条为纯化后的剩余的H2A.Z蛋白，第四至第十五为不同浓度洗脱液洗脱下来的H2A.Z蛋白。
[0015] 图2是纳米抗体的DNA电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为200bp的分子标记，其余孔道为PCR产物，PCR产物带约为500bp。
[0016] 图3是表达的H2A.Z的纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图，结果显示，H2A.Z的纳米抗体经过该纯化过程，可得到纯度较高的蛋白。
具体实施方式
[0017] 本发明应用针对H2A.Z偶联在酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，以此形式的抗原筛选免疫纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），获得能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
[0018] 一种H2A.Z纳米抗体VHH链，包括框架区和互补决定区；其中所述的框架区为4个，分别为FR1-FR4，其中，FR1：为SEQ NO.4- SEQ NO.6所示的氨基酸序列; FR2：为SEQ NO.7- SEQ NO.9所示的氨基酸序列; FR3：为SEQ NO.10- SEQ NO.12所示的氨基酸序列; FR4：为SEQ NO.13- SEQ NO.15所示的氨基酸序列;其中，互补决定区为CDR1-CDR3，其中，CDR1: 为SEQ NO.16- SEQ NO.18所示的氨基酸序列; CDR2: 为SEQ NO.19- SEQ NO.21所示的氨基酸序列; CDR3: 为SEQ NO.22- SEQ NO.24所述的氨基酸序列。本发明的框架区的序列与已知序列差别不大，但是也是经过试验得到的。不过本发明的重点是针对H2A.Z这种组蛋白的特异的纳米抗体，它的特异性主要存在于互补决定区也就是CDR区。这几种H2A.Z的纳米抗体的多样性，也就是H2A.Z不同纳米抗体之间的区别也在于互补决定区（CDR区）。互补决定区也是最重要的功能区。
[0019] 一种DNA分子，它编码选自SEQ NO.1- SEQ NO.3的氨基酸序列。
[0020] 本发明所述的纳米抗体针对H2A.Z#11，H2A.Z#74，H2A.Z#95；其中H2A.Z#11的氨基酸序列为SEQNO.1所示；H2A.Z#74的氨基酸序列为SEQNO.2所示，H2A.Z#95的氨基酸序列为SEQNO.3所示。
[0021] 在本发明的第三方面，提供了编码该纳米抗体的核酸序列，包括框架区和可变区。见SEQNO.25- SEQ NO.27;
第四方面提供了一种宿主细胞，其含本发明所述的表达载体。
第四方面提供了一种宿主细胞，其含本发明所述的表达载体。
[0022] 第五方面提供了本发明中H2A.Z纳米抗体在制备肿瘤诊断试剂盒或工具中的应用。比如H2A.Z在乳腺癌中高表达的机制研究以提供制备乳腺癌诊断试剂盒的研制，特别针对乳腺癌MCF-7细胞系。由于这种机制在很多癌症中都存在，所以并不局限于乳腺癌。
[0023] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0024] 实施例1针对组蛋白H2A.Z纳米抗体文库的构建：
（1）将1 mg H2A.Z与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰驼，每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；（2）7次免疫后，提取100 mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；（3）合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；（4）利用限制性内切酶PstI及NotI酶切20 ug pMECS载体及10 ug VHH并连接两个片段；（5）将连接产物转化至电转
8
感受态细胞TG1中，构建H2A.Z纳米抗体文库并测定库容，库容大小为1.15×10。
（1）将1 mg H2A.Z与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰驼，每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；（2）7次免疫后，提取100 mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；（3）合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；（4）利用限制性内切酶PstI及NotI酶切20 ug pMECS载体及10 ug VHH并连接两个片段；（5）将连接产物转化至电转
8
感受态细胞TG1中，构建H2A.Z纳米抗体文库并测定库容，库容大小为1.15×10。
[0025] 实施例2H2A.Z纳米抗体筛选过程：
（1）将溶解在100 mM NaHCO3（pH=8.2）中的20 ug H2A.Z偶联在NUNC酶标板上，
4 ℃放置过夜；（2）第二天加入100 uL 0.1%酪蛋白，室温封闭2 h；（3）加入100
11
uL噬菌体（5×10 tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库），室温作用1 h； (4）用0.05% PBS+Tween-20洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体；（5）用100 mM TEA（triethylamine）解离与H2A.Z特异性结合的噬菌体，感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1，37 ℃培养1 h，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮，逐步得到富集。
（1）将溶解在100 mM NaHCO3（pH=8.2）中的20 ug H2A.Z偶联在NUNC酶标板上，
4 ℃放置过夜；（2）第二天加入100 uL 0.1%酪蛋白，室温封闭2 h；（3）加入100
11
uL噬菌体（5×10 tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库），室温作用1 h； (4）用0.05% PBS+Tween-20洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体；（5）用100 mM TEA（triethylamine）解离与H2A.Z特异性结合的噬菌体，感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1，37 ℃培养1 h，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮，逐步得到富集。
[0026] 实施例3用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆：
（1）经过3-4轮筛选，从含有噬菌体的细胞培养平板中，挑选96个单菌落并接种于24孔细胞培养板中，生长至对数期后，加1 mM IPTG，28 ℃培养过夜；（2）利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，室温放置1 h；（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入mouse anti-HA tag antibody，室温放置1 h；（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse alkaline phosphatase conjugate，室温放置1 h；（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入显色液，于ELISA仪上，在405 nm波长，读取吸光值；（6）当样品孔OD值大于对照孔OD值2倍以上时，判为阳性克隆；（7）纯化阳性克隆的质粒并进行测序验证。
（1）经过3-4轮筛选，从含有噬菌体的细胞培养平板中，挑选96个单菌落并接种于24孔细胞培养板中，生长至对数期后，加1 mM IPTG，28 ℃培养过夜；（2）利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，室温放置1 h；（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入mouse anti-HA tag antibody，室温放置1 h；（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse alkaline phosphatase conjugate，室温放置1 h；（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入显色液，于ELISA仪上，在405 nm波长，读取吸光值；（6）当样品孔OD值大于对照孔OD值2倍以上时，判为阳性克隆；（7）纯化阳性克隆的质粒并进行测序验证。
[0027] 依据各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，其序列不同的株视为不同克隆株。
[0028] 实施例4纳米抗体在大肠杆菌中表达、纯化：
（1）将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有氨苄青霉素和葡萄糖的LA+GLU板上，37 ℃培养过夜；（2）挑选单菌落接种在5 mL LA培养液中，37 ℃摇床培养过夜；（3）接种1 mL的过夜菌种至330 mL TB培养液中，37 ℃摇床培养，培养到OD值达到0.6~1时，加入1M IPTG，28 ℃诱导过夜；（4）离心，收菌；（5）利用渗透法，获得抗体粗提液；（6）经镍柱离子亲和层析可制备纯度较高的蛋白。
（1）将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有氨苄青霉素和葡萄糖的LA+GLU板上，37 ℃培养过夜；（2）挑选单菌落接种在5 mL LA培养液中，37 ℃摇床培养过夜；（3）接种1 mL的过夜菌种至330 mL TB培养液中，37 ℃摇床培养，培养到OD值达到0.6~1时，加入1M IPTG，28 ℃诱导过夜；（4）离心，收菌；（5）利用渗透法，获得抗体粗提液；（6）经镍柱离子亲和层析可制备纯度较高的蛋白。