一种植物抗旱相关蛋白TaSnRK2.6及其编码基因和应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱相关蛋白TaSnRK2.6及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的抗旱相关蛋白及其编码基因对改良、增强拟南芥抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

权利要求

1.一种植物抗旱相关蛋白TaSnRK2.6，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种植物抗旱相关基因TaSnRK2.6，其特征在于，编码权利要求1所述的植物抗旱相关蛋白TaSnRK2.6。

3.如权利要求2所述的植物抗旱相关基因 TaSnRK2.6，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2或3所述植物抗旱相关基因 TaSnRK2.6的重组载体。

5.权利要求1所述植物抗旱相关蛋白TaSnRK2.6在提高小麦和拟南芥抗旱性方面的应用。

6.权利要求2或3所述植物抗旱相关基因TaSnRK2.6在提高小麦和拟南芥抗旱性方面的应用。

说明书

一种植物抗旱相关蛋白TaSnRK2.6及其编码基因和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱相关蛋白TaSnRK2.6及其编码基因和应用。

背景技术

[0002] 小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、盐碱等逆境胁迫条件对我国小麦造成的减产约800亿公斤，严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食安全。随着现代分子生物学的发展，利用基因工程技术从分子水平上深入研究植物与非生物逆境之间的关系，揭示植物对逆境胁迫信号传导及基因表达调控分子机理，为培育作物抗逆新种质提供了理论基础。

[0003] 近年来，通过蛋白激酶的结构与功能分析来鉴定、阐明各种条件下基因表达调控的机理得到了广泛关注。蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族(SnRKs)在植物的许多生理过程中起着重要的作用，例如激素信号传导、非生物胁迫和植物的生长发育等。SnRK蛋白激酶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶超级家族，由于基因序列的相似性和基因结构的不同，被分为三个亚家族分别是：SnRK1，SnRK2和SnRK3。SnRK蛋白激酶三个亚家族都有相似的结构特点，N-端都有一段能与其他蛋白相互作用的激酶结构域，并且结构在三个家族中是高度变化的，但是与其他蛋白激酶家族相比，这个结构域域都含有一个保守的苏氨酸。

[0004] 抗逆蛋白激酶SnRK2是一个植物特有并且家族成员数目较少的蛋白激酶家族。随着研究的深入，在植物中陆续鉴定出了多个SnRK2蛋白激酶家族基因。

[0005] 植物抗逆相关SnRK2家族基因主要参与非生物胁迫信号传导，Zheng等对大豆中的两个SnRK2蛋白激酶SPK-3和SPK-4研究发现，其都受到干旱和高盐胁迫诱导。Calliste研究水稻SnRK2家族的OsSAPK4基因发现，该基因诱导表达可以提高水稻在盐胁迫下种子的萌发率，同时，转基因植株的抗旱能力也得到增强。但是，SnRK2家族基因在功能上表现出差异性，例如，拟南芥的SnRK家族成员有9个基因被甘露醇、NaCl等高渗胁迫诱导，另外有5个基因被ABA诱导；并且这14个基因都不受冷胁迫诱导。小麦中SnRK2家族基因在功能上也表现出一定不同，实验表明，TaSnRK2.4基因在拟南芥中过表达可以明显增强植物的耐旱性；而TaSnRK2.7基因主要在增强光系统II的活性、糖代谢、促进植物生根及降低渗透势等新陈代谢过程中起重要作用；TaSnRK2.8基因在拟南芥中过表达对干旱、低温、高盐等胁迫均有一定耐性。

[0006] 综上所述，SnRK蛋白激酶在调节植物的逆境反应，提高植物的抗逆性中起着至关重要的作用，对抗逆育种和农业生产会产生巨大推动作用和经济效益。因此，利用抗逆相关SnRK蛋白激酶基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要应用前景。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种植物抗旱相关蛋白TaSnRK2.6。

[0008] 本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱相关蛋TaSnRK2.6的基因。

[0009] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

[0010] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。

[0011] 本发明的另一目的提供上述植物抗旱相关蛋白TaSnRK2.6的应用。

[0012] 本发明所提供的抗旱、耐盐相关蛋白TaSnRK2.6，来源于小麦，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0013] 本发明的蛋白激酶由353个氨基酸残基组成，是SnRK类蛋白激酶。自SEQ ID NO.1的氨基末端第11-33位氨基酸残基是ATP结合域，自SEQ ID NO.1的第124-135位氨基酸残基为丝氨酸/苏氨酸结合域。

[0014] SEQ ID NO.1

[0015] 1 MDKYELLKDI GSGNFGVARL

[0016] 21 MRNKETRELV AMKYIPRGLK

[0017] 41 IDENVAREII NHRSLRHSNI

[0018] 61 IRFKEVVLTP THLAIVMEYA

[0019] 81 AGGELFDRIC SAGRFSEDEA

[0020] 101 RYFFQQLICS VSYCHFMQIC

[0021] 121 HRDLKLGNTL LDGSPAPRLK

[0022] 141 ICDFGYSKSS LLHSKPKSTV

[0023] 161 GTPAYIAPEV LSRGEYDGKM

[0024] 181 ADVWSCGVTL YVMLVGAYPF

[0025] 201 EDPDDPKNFR KTIGRIVSIQ

[0026] 221 YQIPEFVHIS QDCRQLFSRI

[0027] 241 FVANPVKRIT IREIRNHPWF

[0028] 261 LKNLPRELTE AVQAKYYKKD

[0029] 281 NSAPTFSDQT VDEIMKIVEE

[0030] 301 ARTPPQLSTR VAGFGWAEED

[0031] 321 EQEDGKKPED EDQDGEEEEY

[0032] 341 DGEDEYDKQV KQV

[0033] 为了使蛋白TaSnRK2.6便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0034] 表1标签的序列

[0035]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0036] 根据本发明所公开的SEQ ID NO.1序列，本发明的转录因子TaSnRK2.6可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

[0037] 根据本发明的TaSnRK2.6编码基因具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

[0038] SEQ ID NO.2

[0039] 1 ATGGACAAGT ACGAGCTGCT CAAGGACATC GGCTCCGGCA ACTTCGGGGT GGCGCGGCTC[0040] 61 ATGCGGAACA AGGAGACCAG GGAGCTCGTC GCCATGAAGT ACATCCCCAG GGGGCTCAAG[0041] 121 ATTGACGAGA ATGTGGCGAG GGAGATCATA AACCACCGCT CGCTGCGGCA CTCCAACATC[0042] 181 ATCCGCTTCA AGGAGGTCGT GCTCACGCCC ACGCACCTCG CCATCGTCAT GGAGTACGCC[0043] 241 GCCGGCGGTG AGCTCTTCGA CCGGATCTGC AGCGCCGGCA GGTTCAGCGA GGATGAGGCG[0044] 301 CGGTATTTCT TCCAGCAGCT CATCTGCAGT GTCAGCTACT GCCACTTCAT GCAAATTTGC[0045] 361 CACCGGGACT TGAAGCTGGG GAACACGCTG CTGGATGGCA GCCCGGCGCC GCGCCTGAAG[0046] 421 ATCTGTGACT TTGGTTACTC CAAGTCATCA CTGCTGCACT CGAAGCCCAA GTCGACGGTC[0047] 481 GGAACTCCAG CGTACATTGC TCCAGAGGTG CTCTCACGTG GGGAATATGA CGGCAAGATG[0048] 541 GCAGATGTTT GGTCTTGTGG AGTGACTCTT TACGTGATGC TGGTTGGTGC ATACCCTTTT[0049] 601 GAGGACCCTG ATGATCCTAA GAATTTTAGA AAGACGATTG GGAGAATAGT GTCAATTCAA[0050] 661 TACCAAATAC CAGAGTTTGT ACACATATCC CAAGATTGCA GACAGCTCTT CTCTAGAATC[0051] 721 TTCGTTGCGA ATCCTGTGAA GAGAATAACG ATTAGGGAGA TTAGGAACCA CCCCTGGTTC[0052] 781 CTGAAGAACT TGCCCAGAGA GCTTACAGAA GCTGTGCAAG CGAAGTACTA CAAGAAGGAC[0053] 841 AATAGCGCCC CCACCTTCTC TGATCAAACT GTCGATGAGA TCATGAAGAT CGTTGAGGAG[0054] 901 GCCCGCACAC CACCCCAATT GTCTACTCGG GTGGCTGGTT TTGGTTGGGC TGAGGAAGAC[0055] 961 GAGCAAGAAG ATGGAAAGAA ACCCGAGGAT GAAGACCAGG ATGGGGAGGA GGAAGAATAT[0056] 1021 GATGGTGAGG ACGAGTACGA CAAGCAGGTG AAGCAAGTAC

[0057] 含有TaSnRK2.6基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

[0058] 可用现有的植物表达载体构建含有TaSnRK2.6基因的重组表达载体。

[0059] 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

[0060] 使用TaSnRK2.6构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

[0061] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

[0062] 本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。

[0063] 本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有TaSnRK2.6基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。

[0064] 利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的SnRK蛋白激酶TaSnRK2.6基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：拟南芥、小麦、小麦、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

[0065] 所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对或盐胁迫的耐逆性。

[0066] 本发明以抗旱、耐盐性较强的小麦为实验材料，得到了抗逆相关的TaSnRK2.6蛋白及其编码基因，并将其导入拟南芥，显著提高了植物的抗旱、耐盐性。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强拟南芥抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

[0067] 下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

[0068] 图1 T1代TaSnRK2.6转基因拟南芥株系的筛选。图中A:Kana平板筛选；B:除草剂筛选；C:T1代植株提取DNA电泳检测，M为DNA Marker Plus2K，0为水对照，1-10为阳性苗。

[0069] 图2 T3代转TaSnRK2.6基因拟南芥株系根长分析。图中WT:野生型拟南芥，L4-L6：转TaSnRK2.6基因拟南芥独立株系。

[0070] 图3转基因拟南芥耐旱性鉴定及存活率统计分析。A.转基因拟南芥在旱胁迫下的表型；B.转基因拟南芥存活率的统计，WT是野生型拟南芥，L1-L6为6个独立的转TaSnRK2.6基因拟南芥株系。

具体实施方式

[0071] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

[0072] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

[0073] 实施例1：小麦抗旱、耐盐相关TaSnRK2.6基因的cDNA克隆

[0074] 对生长30天左右的小麦幼苗进行干旱处理5小时，用Trizol提取小麦总RNA。应用5’RACE试剂盒（5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit）(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058) 和 3’RACE 试 剂 盒 (3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit)(GIBCOBRL,CAT.NO.18373-019)获得TaSnRK2.6基因的全长序列1060bp。

[0075] 用Trizol提取小麦幼苗的总RNA，用superscript II（invitrogen）反转录酶反转录获得到cDNA。根据TaSnRK2.6基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：

[0076] P1：5’-ATGGACAAGTACGAGCTGC-3’，

[0077] P2：5’-TCATTTTATCAGGTGTTGAAAATCC-3’。

[0078] 对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1kb左右的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN）回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy（Promega）连接，参照Cohen等的方法（Proc Natl Acad Sci，69:2110），将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的TaSnRK2.6基因的开放阅读框(ORF)为SEQ ID No.2的自5’末端第1至1060位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。将含序列SEQ ID No.2所示TaSnRK2.6基因的重组载体命名为pTE-TaSnRK2.6。

[0079] TaSnRK2.6基因的序列在Genabnk上进行比对，该证明TaSnRK2.6基因是一个新的基因。

[0080] 实施例2：用TaSnRK2.6基因增强植物的耐旱性

[0081] 1、重组表达载体的构建

[0082] 1）35S-TaSnRK2.6重组表达载体的构建

[0083] 以小麦的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有EcoRI和HindIII接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后EcoRI和HindIII双酶切PCR产物回收，将酶切产物正向插入载体pBI121的CaMV35S启动子之后的EcoRI和HindIII酶切位点之间，得到重组载体p35S-TaSnRK2.6。

[0084] 引物序列如下：

[0085] TaSnRK2.6[EcoRI]5’-CCGGAATTCATGGACAAGTACGAGCTGC-3’

[0086] TaSnRK2.6[HindIII]5’-CCCAAGCTTTCATTTTATCAGGTGTTGAAAATCC-3’

[0087] 2、转基因拟南芥获得和功能鉴定

[0088] 1）转基因拟南芥的获得

[0089] 利用农杆菌介导法将该重组质粒转化到抽薹期的野生型拟南芥中，得到的T0代转基因拟南芥种子播到含有50mg/L Kan的MS培养基上和培养盒上喷洒除草剂，22℃正常培养7～10d，筛选出叶片深绿色并且长势正常的拟南芥植株（如图1）。将转化成功的拟南芥植株移栽到营养土中继续培养，收获转基因拟南芥T1代的种子，继续在含50mg/L Kan的MS培养基上筛选和除草剂筛选，绿色长势正常的拟南芥移栽到营养土中，收获T2代种子，进一步抗性筛选，最终获得了10个不同转基因拟南芥T3代株系。

[0090] 2）在ABA及PEG胁迫下转基因拟南芥萌发率统计分析

[0091] 如图2A，转TaSnRK2.6基因拟南芥和野生型拟南芥在MS培养基上培养约3周，发现培养基上拟南芥均能正常生长，其根均细长，说明TaSnRK2.6基因的转化没有影响拟南芥的根长生长。在50μM ABA培养基上，3个转基因拟南芥株系与野生型生长都较缓慢，在相同培养时间下几乎观察不到根，但观察记录种子萌发势发现转基因株系的萌发势强于野生型；在10%PEG的培养基上，与野生型拟南芥相比，转基因的拟南芥生根快，L4、L5和L63个株系明显比野生型的根长，转基因株系L5与L6的优势更明显；同时，还能观察到转基因拟南芥3个株系根较粗，根毛发达，根系雪白，说明这3个株系在幼苗期耐旱性较强。对拟南芥根长的数值统计结果如图2B所示，在胁迫培养基上转基因拟南芥和野生型根系均不能正常生长，但转基因拟南芥明显比野生型的根长。以上实验结果表明，TaSnRK2.6基因参与了逆境应答，提高了转化拟南芥的耐旱性。

[0092] 3）转基因拟南芥苗期耐旱性鉴定

[0093] 为进一步检测转基因拟南芥植株对干旱胁迫的耐性，对其在干旱胁迫下第0d、第10d、第24d和复水后第3d、7d的表型进行照相观察，干旱处理24d后，6个转基因株系中L3-L64个株系莲座叶叶片颜色加深，少数野生型和转基因植株出现死亡。在干旱处理的第25d开始复水，复水后第3d和7d观察照相记录表型。复水后7d野生型拟南芥及6个转基因株系的存活率分别约为18%（10/60)、40%（12/30)、70%（21/30)、37%（11/30）、57%（17/30）、43%（13/30）、47%（14/30）。6个转基因株系中L3的存活率较其他株系低，但转基因拟南芥的存活率明显高于野生型拟南芥(如图3A)。同时，分别在干旱处理后第0d和第9d对拟南芥叶片叶绿素含量进行了测定并统计。如图3B所示，干旱处理严重影响了野生型拟南芥叶片叶绿素增加，相比之下，转基因拟南芥的各株系叶绿素含量增加明显。综上实验结果说明，TaSnRK2.6基因在拟南芥中过表达提高了拟南芥幼苗的抗旱能力。