麦冬中原儿茶醛的提取方法及其用途

摘要

本发明公开了一种麦冬中原儿茶醛的提取方法及其用途。本发明还公开了从麦冬中提取的原儿茶醛对生菜、夏至草等11种受体植物幼苗胚根和胚轴的生长具有很强的抑制作用，它可用于直接开发植物源除草剂或作为先导化合物开发仿生除草剂。本发明提取分离该提取物的各阶段产物对受体植物幼苗的生长均具有很好的抑制作用，特别是最终提取的活性化合物原儿茶醛的除草活性更高，有效中浓度均很低，该提取物可用于直接开发植物源除草剂或作为先导化合物开发仿生除草剂。

权利要求

1.一种麦冬中原儿茶醛的提取方法，其特征是，其步骤如下：

(1)用体积比80％甲醇浸泡麦冬叶干粉，提取3次，3次时间分别为7d、5d和3d；合并提取液，过滤后将提取液减压浓缩，得甲醇提取浸膏；

(2)将甲醇提取浸膏加入10倍重量蒸馏水混悬后，依次分别用石油醚、乙酸乙酯进行萃取；

(3)取乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，依次用100:0～0:1体积比的石油醚/丙酮混合溶剂以及50:1～0:1体积比的丙酮/甲醇混合溶剂进行梯度洗脱得若干个馏分；

(4)对步骤3所得到的除草活性最高的馏分用100:1～0:100体积比的氯仿/甲醇混合溶剂进一步柱色谱分离，得到若干个馏分；

(5)对步骤4所得到的除草活性最高的馏分用100:1～5:1体积比的氯仿/甲醇混合溶剂进一步柱色谱分离得到若干个馏分；

(6)对步骤5所得到的除草活性最高的馏分进一步用50:1和25:1体积比的氯仿/甲醇混合溶剂柱色谱分离得到原儿茶醛；

测定除草活性的方法包括以下步骤：

琼脂法：将受体植物种子经0.2％次氯酸钠溶液浸泡15min后，用自来水冲洗数次并置流水下浸泡吸水3～5h，而后用蒸馏水洗涤数次，均匀摆放在带盖方盘内的吸水纸上，滴加蒸馏水至种子不漂浮，遮光置于全智能人工气候箱内发芽，全智能人工气候箱为HP1000GS-B型，武汉瑞华仪器设备有限责任公司，待胚根或种子根达3～5mm时移植至混有各阶段提取物的0.5％琼脂凝胶上，琼脂凝胶事先配制100mL，并均匀分注至3个小烧杯中，各提取物的浸膏需事先分别用0.5ml DMSO溶解后再加入至琼脂溶液中配制含毒基质，各处理含空白对照中DMSO最高浓度为0.5％，且在配置后待琼脂凝固后再进行处理，在该浓度下对受体植物的生长没有不良影响；以不含提取物的0.5％琼脂凝胶含0.5％DMSO为空白对照；移植时先用尖嘴镊子在已凝固的琼脂表面插5个小孔，之后分别夹取胚根长度基本一致的预萌发受体植物种子，将胚根或种子根垂直由小口轻轻植入琼脂凝胶中；每烧杯5粒，重复3次；为防止光照对化合物及植物幼根生长的影响，将各烧杯放入人工气候箱遮光培养2～4d；人工气候箱设置为14h，25℃和10h，20℃的自动循环，箱内相对湿度为60％；

待处理结束后，用电子游标卡尺分别测量受体植物幼苗胚根或种子根和胚轴或胚芽鞘的长度，以各植物胚根种子根和胚轴胚芽鞘的实际生长量计算有效中浓度EC50。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征是，步骤2中，依次用等量石油醚和乙酸乙酯萃取，然后取乙酸乙酯相进行四级柱色谱分离。

3.根据权利要求1所述的提取方法得到的原儿茶醛的用途，其特征是，所述提取化合物原儿茶醛用于除草。

说明书

麦冬中原儿茶醛的提取方法及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及化学与农业领域，具体来说是提供一种麦冬中原儿茶醛的提取方法及其用途。

背景技术

[0002] 麦冬(Ophiopgon japonicus)为又名沿阶草、书带草、麦门冬，是百合科沿阶草属多年生常绿草本植物，为传统中草药之一，其干燥块根味甘、微苦，性微寒，归心、肺、胃经，具有养阴润肺、益胃生津、清心除烦等功效（国家药典委员会.中国药典（一部）[S].化学工业出版社,2005:106-107），现代药理学研究表明麦冬能够改善心肌收缩力和心脏泵功能，保护心血管系统，调节或提高免疫功能，调节或降低血糖，抗疲劳和抗衰老等（陈屏,徐东铭,雷军.长春中医学院学报,2004,20(1):35-36），临床常用于治疗肺燥干咳、阴虚痨嗽、喉痹咽痛、津伤口渴、内热消渴、心烦失眠、肠燥便秘等症状（余伯阳,徐国钧.中草药,1995,26(4):205-210）。除了药用价值外，还发现麦冬块根70%甲醇提取物能明显抑制稻瘟病菌小种菌株（MAFF305480和MAFF101002）、水稻纹枯病菌、桃缩叶病以及鬼芋根腐病菌的菌丝生长，并显著降低接种诱发稻瘟病的水稻幼苗发病级数（林冬枝,董彦君,续荣治.中国农学通报,2009,25(9):220-223.）；而其地下部分和地上部分水浸提液对黄瓜和萝卜种子的萌发及莴苣和萝卜主根的生长具有较强的抑制（徐莹梅,田胜尼.安徽林业科技,2011,37(4):14-17.）。

[0003] 本发明人在对麦冬叶中有效成分的进一步研究中，首次从中分离到原儿茶醛(protocatechuicaldehyde)，并首次发现其具有高除草活性，从而完成了本发明。尽管此前，原儿茶醛已经从丹参（张英锋,王燕革,马子川,等.化学 世 界,2009,10:638-640,635）、乌 蕨（龚 晓 莉,罗 娅 君 ,史 东 林,等 .绵 阳师 范 学 院 学 报,2009,11:41-44.）、四 季 青（吴 佩 颖, 张 彤,陶 建 生 ,等. 中成 药,2006,28(3):339-341.）、桂 枝（杨 琳 ,赵 庆 春 ,谭 菁 菁 , 等. 实 用 药物 与 临 床 ,2010,13(3):183-185）、紫 花 列 当（赵 军 ,闫 明 ,黄 毅, 等. 中 药材,2007,30(10):1255-1257）、金毛狗脊（吴琦,杨秀伟,杨世海,等.天然产物研究与开发,2007,19:240-243,302）、仙鹤草（刘红霞,刘召喜,姜清华,等.沈阳药科大学学报,2010,27(4):286-289,298）、大叶金花草（罗娅君,肖新峰,王照丽.中草药,2009,40(2):190-192）、山石榴（高广春,漆淑华,张偲,等.中草药,2009,40(7):1031-1033）、阔苞菊（谭红胜,沈征武,林文翰,等.上海中医药大学学报,2010,24(4):83-86）、老头草（赵全成,吕景田,徐东铭.老头草有效成分的研究[J].中药通报,1984,9(6):31-32）、留兰香（陈广通,高慧媛,郑健,等.中国中药杂志,2006,31(7):560-562）等多种植物中被分离到，并主要用于治疗心血管疾病、肾炎等，但尚未见其农用除草活性的任何报道。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种麦冬中原儿茶醛的提取方法。本发明的另一个目的是提供所述化合物的农药用途，更进一步的是提供该化合物的除草用途。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 一种麦冬中原儿茶醛的提取方法，其步骤如下：

[0007] （1）用体积比80%甲醇浸泡麦冬叶干粉，提取3次，3次时间分别为7d、5d和3d；合并提取液，过滤后将提取液减压浓缩，得甲醇提取浸膏；

[0008] （2）将甲醇提取浸膏加入10倍重量蒸馏水混悬后，依次分别用石油醚、乙酸乙酯进行萃取；

[0009] （3）取乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，依次用100:0～0:1体积比的石油醚/丙酮混合溶剂以及50:1～0:1体积比的丙酮/甲醇混合溶剂进行梯度洗脱得若干个馏分；

[0010] （4）对步骤3所得到的活性较高的馏分用100:1～0:100体积比的氯仿/甲醇混合溶剂进一步柱色谱分离，得到若干个馏分；

[0011] （5）对步骤4所得到的活性最高的馏分用100:1～5:1体积比的氯仿/甲醇混合溶剂进一步柱色谱分离得到若干个馏分；

[0012] （6）对步骤5所得到的活性最高的馏分进一步用50:1和25:1体积比的氯仿/甲醇混合溶剂柱色谱分离得到原儿茶醛。

[0013] 所述的提取方法，步骤2中，依次用等量石油醚和乙酸乙酯萃取，然后取乙酸乙酯相进行四级柱色谱分离。

[0014] 所述的提取方法得到的原儿茶醛的用途，所述提取化合物原儿茶醛用于除草。

[0015] 本发明中所述的提取分离方法，系采用活性追踪法一步步探索而成，它非常适合于麦冬中该物质的提取分离，提取分离的过程及方法不同于上述植物。

[0016] 本发明提取分离该提取物的各阶段产物对受体植物幼苗的生长均具有很好的抑制作用，特别是最终提取的活性化合物原儿茶醛的除草活性更高，有效中浓度均很低，该提取物可用于直接开发植物源除草剂或作为先导化合物开发仿生除草剂。

具体实施方式

[0017] 本发明所述的化合物具有下列结构式：

[0018]

[0019] 该化合物是从麦冬的干叶中提取。

[0020] 具体的，将植物麦冬干燥叶的粗粉用80%甲醇提取，提取液减压（真空抽滤）回收溶剂，得甲醇提取浸膏；取浸膏加入10倍量蒸馏水混悬后，依次分别用等量石油醚和乙酸乙酯萃取；取乙酸乙酯萃取相依次分别用石油醚+丙酮、丙酮+甲醇经硅胶柱色谱进行洗脱，得到A1～A19共19个馏分；对活性较高的A10馏分经过进一步三级柱色谱分离，得到本发明的活性物质。

[0021] 本发明所述化合物具有较强的抑制植物幼苗生长的活性。具体来说本发明所分离的化合物对生菜、夏至草等11种受体植物幼苗胚根和胚轴的生长具有很强的抑制作用，可用于直接开发植物源除草剂或作为先导化合物开发仿生除草剂。

[0022] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

[0023] 实施例1化合物原儿茶醛的提取

[0024] 取4000g麦冬叶粉末，用80%甲醇溶液（完全浸没粉末）浸泡提取3次，3次时间分别为7d、5d和3d。期间每隔6小时搅拌一次。提取液合并后经真空抽滤和旋转蒸发将乙醇回收得到甲醇提取浸膏611g。将乙醇提取浸膏600g加入10倍量（6L）蒸馏水混悬后，先用石油醚萃取8次（每次添加石油醚为6L），而后用乙酸乙酯再萃取8次（每次添加乙酸乙酯为6L），合并各试剂萃取液后旋转蒸发回收溶剂，分别得到石油醚和乙酸乙酯萃取物浸膏，其中乙酸乙酯萃取物浸膏112.5g。取乙酸乙酯萃取物浸膏70g经硅胶柱色谱，依次用100:0、50:1、20:1、15:1、10:1、20:3、5:1、3:1、2:1、1:1和0:1体积比的石油醚和丙酮混合溶剂与50:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1和1:1体积比的丙酮和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱得到A1～A19共19个馏分，对活性较高的A10馏分依次用100:0、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:100体积比的氯仿/甲醇混合溶剂进行进一步硅胶柱色谱分离，得到A10-1～A10-6共6个馏分；对活性最高的A10-2馏分用100:1、50:1、25:1、5:1体积比的氯仿/甲醇混合溶剂进一步柱色谱分离得到A10-2-1～A10-2-3共3个馏分；对活性最高的A10-2-2馏分进一步用50:1和25:1体积比的氯仿/甲醇混合溶剂柱色谱分离得到原儿茶醛，为淡黄色结晶。

[0025] 对上述分离的化合物原儿茶醛进行结构鉴定，所得波谱数据如下：

[0026] ESI-MS：138(M.1)

[0027] 1H-NMR(500MHz，Atcone) ：δ:6.99(1H,d,J=8.0Hz,H-5)，7.33(1H,dd,J=1.8,8.0Hz,H-6)，7.35(1H,d,J=1.8Hz,H-2)，δ:8.60(1H,brs,OH)，δ:8.96(1H,brs,OH)，δ:9.76(1H,s,CHO)；

[0028] 13C-NMR(125MHz，Atcone)：δ:114.2(C-5)，115.2(C-2)，124.6(C-6)，130.0(C-1)，145.6(C-3)，151.5(C-4)，190.4(CHO)；

[0029] DEPT135和DEPT90：化合物有四个-CH，分别为δ:114.2(C-5)，115.2(C-2)，124.6(C-6)和190.4(CHO)。

[0030] 实验例2原儿茶醛及其每个提取阶段的除草活性

[0031] 1）实验材料

[0032] 生菜、黄瓜、白菜、小麦、反枝苋、夏至草、独行菜、播娘蒿、泥胡菜、狗尾草、稗[0033] 2）实验方法

[0034] 琼脂法：将受体植物种子经0.2%次氯酸钠溶液浸泡15min后，用自来水冲洗数次并置流水下浸泡吸水3～5h左右，而后用蒸馏水洗涤数次，均匀摆放在带盖方盘内的吸水纸上，滴加蒸馏水至种子不漂浮，遮光置于全智能人工气候箱（HP1000GS-B型，武汉瑞华仪器设备有限责任公司）内发芽，待胚根（或种子根）达3～5mm时移植至混有各阶段提取物的0.5%琼脂凝胶（事先配制100mL，并均匀分注至3个小烧杯中）上，各提取物的浸膏需事先分别用0.5mlDMSO溶解后再加入至琼脂溶液中配制含毒基质，各处理（含空白对照）中DMSO最高浓度为0.5%，且在配置后待琼脂凝固后再进行处理，在该浓度下对受体植物的生长没有不良影响。以不含提取物的0.5%琼脂凝胶（含0.5%DMSO）为空白对照。移植时先用尖嘴镊子在已凝固的琼脂表面插5个小孔，之后分别夹取胚根长度基本一致的预萌发受体植物种子，将胚根（或种子根）垂直由小口轻轻植入琼脂凝胶中。每烧杯5粒,重复3次。为防止光照对化合物及植物幼根生长的影响，将各烧杯放入人工气候箱遮光培养2～4d。人工气候箱设置为14h(25℃)和10h(20℃)的自动循环，箱内相对湿度为60%。待处理结束后，用电子游标卡尺分别测量受体植物幼苗胚根(或种子根)和胚轴(或胚芽鞘)的长度，以各植物胚根(种子根)和胚轴(胚芽鞘)的实际生长量计算有效中浓度（EC50）。

[0035] 3）实验结果

[0036] 从麦冬叶中提取分离原儿茶醛共分为甲醇提取、石油醚和乙酸乙酯萃取、柱色谱分离等阶段。每个阶段的除草活性见表1～4。

[0037] 表1麦冬叶甲醇提取物对生菜、小麦、夏至草、稗和反枝苋幼苗生长的抑制作用[0038]

[0039] 表2麦冬叶甲醇提取物的乙酸乙酯相对生菜、小麦和夏至草幼苗生长的抑制作用[0040]

[0041] 表3麦冬叶甲醇提取物的乙酸乙酯相柱色谱分离物对生菜、小麦和夏至草幼苗生长的抑制作用

[0042]

[0043] 表4原儿茶醛对11种受体植物幼苗生长的抑制作用