一种玉米病原菌诱导启动子

摘要

本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一个玉米病原菌诱导启动子，该启动子能够被玉米纹枯病菌，水稻白叶枯病病菌以及水稻细菌性条斑病病菌所激活。通过对启动子截短验证，确定了﹣1144bp至﹣1084bp和﹣1084bp至﹣973bp这两个区段为受病原菌诱导的反应元件。可以利用本发明启动子构建植物表达载体，用于通过植物基因工程技术改善植物对各种病害的抗性。

权利要求

1.一种玉米病原诱导启动子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于：该启动子可以被玉米纹枯病菌或水稻白叶枯病病菌或水稻细菌性条斑病病菌激活。

3.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于：序列中﹣1144bp至﹣1084bp和﹣

1084bp至﹣973bp为玉米纹枯病菌或水稻白叶枯病病菌或水稻细菌性条斑病病菌诱导反应元件。

4.权利要求1所述的启动子在抗纹枯病、水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病抗性改良中的应用。

说明书

一种玉米病原菌诱导启动子

技术领域

[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一个玉米病原菌诱导启动子p GRMZM2G084947，该启动子可用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。

背景技术

[0002] 由真菌、细菌、病毒以及线虫引起的植物疾病为作物生产带来巨大影响。植物拥有两套不同的抗性机制：一是被动防御机制，是指一些抗性相关的形态结构，如表皮和坚硬的细胞壁（Brady JD,Fry S.Formation of di-isodityrosine and loss of isodityrosine in the cell walls of tomato cell-suspension cultures treated with fungal elicitors or H2O2.Plant Physiol1997,115:87-92.）。另一个是主动防御，主动防御是抗性基因与病原菌识别并且互作引起的。病原物无毒基因（avr）编码的激发子与寄主植物响应的抗病基因（R）编码激发子的受体分子相互作用产生抗病反应。植物抗病防卫反应一般经历信号识别、信号传导、防卫基因表达三个环节。主动防御中所有类型的抗病机制都要依靠防卫基因表达，抵抗的有效性取决于基因表达的时空特性。正是由于防卫基因的时空表达特性，其启动子往往具有某些特殊的顺式作用元件，人们可以利用防卫基因、尤其是其顺式元件为基因工程改良提供有利的工具。植物中绝大部分抗病基因都编码具有核苷酸结合位点以及亮氨酸重复的蛋白（NBS-LRR)，（McHale L,Tan X,Koehl P,Michelmore RW.Plant NBS-LRR proteins：adaptable guards.Genome Biol2006,7:212.）。但是对于这类基因的启动子研究还比较少。

[0003] 植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5ˊ端上游区的DNA序列，是转录调控的中心。从1983年第一株转基因植物问世以来，启动子一直是基因工程的研究热点，选择合适并有效表达的启动子将为基因工程的研究奠定坚实的基础。组织特异启动子可以使外源基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节特性；诱导型启动子可以使外源基因对某些信号产生响应，只在特殊信号刺激下表达。这些启动子的最大优点是：它克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异性的持续、高效表达所造成的浪费，并且满足某些需要外源基因特异表达的需求。组织特异性或诱导表达启动子一直以来都是植物基因工程研究的重点和难点。

[0004] 目前，已经找到一些组织特异性或诱导表达启动子，并发现其上存在的相应的顺式因子，为后来的启动子研究奠定了基础。烟草的Sar8.2b基因受水杨酸（SA）诱导，在其启动子上发现了几个顺式作用因子，包括as-1因子、GT21和Dof结合序列。SA诱导Sar8.2b基因表达可能存在于-728至-927bp和-197至-351bp的区域的顺式因子中（Song F,Goodman RM.Cloning and identification of the promoter of the tobacco Sar8.2b gene,a gene involved in systemic acquired resistance.Gene2002,290:115-124.）。玉米蔗糖合成酶I只在韧皮部细胞中表达（Yang NS,Russell D.Maize sucrose synthase-promoter directs phloem cell specific expression of gus gene in transgenic tobacco plants.Proc Natl Acad Sci1990,87:4144-4148.）。PsGNS2启动子只在种子中特异表达（Buchner P,Rochat C,Wuilleme S,Boutin JP.Characterization of a tissue-specific and developmentally regulated beta-1,3-glucanase gene in pea(Pisum sativum).Plant Mol Biol2002,49:171-186.）。

[0005] 玉米是最重要的粮食作物之一，玉米纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的真菌性病害，是我国玉米产区的主要病害之一。玉米抗病基因的克隆以及启动子的分离可以使我们更好地了解寄主与病原菌的互作并为基因工程改良奠定基础。因此如何利用玉米抗病基因的克隆以及启动子的分离获得抗病植株成为亟待解决的问题之一。

发明内容

[0006] 本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一个玉米病原菌诱导启动子，该启动子能够被水稻白叶枯病病菌黄单胞菌PXO99，水稻细菌性条斑病病菌RS105以及玉米纹枯病菌YWK-196所激活,可见该启动子对病菌的响应具有广谱性。通过对该启动子进行截短，确定了﹣1144bp至﹣1084bp和﹣1084bp至﹣973bp为病原诱导关键区域，可以利用本发明启动子构建成各种植物表达载体，用于通过植物基因工程技术改善植物品质和其他有益生产性状。

[0007] 发明人首先提供了一个玉米病原菌诱导启动子，命名为pGRMZM2G084947，该启动子基因序列中含有如序列表SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

[0008] 该启动子来源于玉米B73（Zea mays），是下述核苷酸序列之一：

[0009] 序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列或部分DNA序列。

[0010] 序列表中的SEQ ID NO.1由2068个碱基组成。自5ˊ端第1895位碱基为转录起始位点，记为+1。

[0011] 其中TATA框位于转录起始位点上游-528至-523位碱基，而CAAT框位于-112至-109位碱基，这些元件在转录中是基本启动子元件。

[0012] 自5ˊ端第-735位，-49位碱基为黄化诱导元件ACGTATERD1；自5ˊ端第-1752位，+93位碱基为胚和胚乳特异表达元件CANBNNAPA；自5ˊ端第-1604位，-1674位，-1633位碱基为脱水响应元件CBFHV；自5ˊ端第-1248位，-949位，-272位，-113位，-1236位，-1223位碱基为热激蛋白基因表达元件CCAATBOX1；自5ˊ端第-1652位，-1856位，-1808位，-1854位，-1760位碱基为钙调蛋白基因表达元件CGCGBOXAT；自5ˊ端第-1723位，-1103位，-1075位，-961位，-47位，+38位碱基为铜离子诱导表达元件CURECORECR；自5ˊ端第-1891位，-1513位，-1001位，-1376位，-1341位，-1034位，-715位，-213位，-1727位，-1577位碱基为DNA结合蛋白基因表达元件DOFCOREZM；自5ˊ端第-1667位，-1194位，-1100位，-832位，-572位，-558位，-459位，-120位碱基为贮藏蛋白基因表达元件EBOXBNNAPA；自5ˊ端第-1181位，-345位，-1119位，-546位，-501位，-418位，+119位碱基为增强子元件EECCRCAH1；自5ˊ端第-489位，-549位碱基位乙烯调控元件（ERELEE4）；自5ˊ端第-1645位，-1524位，-1458位，-1382位，-1017位，-986位，-727位，-598位，-357位碱基为光诱导元件GATABOX；自5ˊ端第-1345位，-998位，-1297位，-1168位碱基为病原菌和盐离子诱导表达元件GT-1；自5ˊ端第-1769位，-1673位，-1603位，-633位碱基为低温诱导元件LTRECOREATCOR15;自5ˊ端第-1003位，-999位，-294位，-1244位，-1178位，-329位,-311位碱基为花粉特异表达元件POLLEN1LELAT52;自5ˊ端第-1557位，-301位，-1323位，-370位，-154位，+123位碱基为水杨酸诱导元件WBOXATNPR1。启动子PGRMZM2G084947的序列分析结果表明2H16基因在水稻抗性和胁迫诱导过程中受复杂因素的调控。

[0013] 同时通过截短验证，确定了病原诱导相关区段位于﹣1144bp至﹣1084bp和﹣1084bp至﹣973bp，在确定了上述的病原诱导关键区域后，可以方便的与其他抗病相关基因通过基因工程改造来改善植物抗病性。

[0014] 综上所述，本发明的发明人在国际上首次提供了一个玉米病原菌诱导启动子pGRMZM2G084947，水稻转基因证明发现转基因植株受到黄单胞菌PXO99，水稻细菌性条斑病菌RS105以及玉米纹枯病菌YWK-196诱导后GUS活性有显著上升，说明pGRMZM2G084947含有相应的应答反应因子。p2H16在模式植物中的表达特征表明其是一个病原相关的启动子。pGRMZM2G084947的功能研究可为揭示GRMZM2G084947的表达调控机理以及具体功能打下基础，还可应用于水稻抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。

附图说明

[0015] 图1为本发明所述启动子转化水稻中花植株受到黄单胞菌PXO99、细菌性条斑病菌RS105诱导后GUS染色观察结果灰度图；

[0016] 图2为本发明所述启动子转化水稻中花植株受到黄单胞菌PXO99、细菌性条斑病菌RS105诱导后GUS定量检测结果；

[0017] 图1和图2中，H2O为对照，接种24h后进行染色及定量检测，结果发现接种4h后GUS活性达到峰值，说明该启动子受到上述病原细菌的诱导；

[0018] 图3为本发明所述启动子转化水稻中花植株受到玉米纹枯病菌YWK-196诱导后GUS染色观察结果灰度图；

[0019] 图4为本发明所述启动子转化水稻中花植株受到玉米纹枯病菌YWK-196诱导后GUS定量检测结果；

[0020] 图3和图4中，不接菌CK为对照，接种24h后进行GUS染色及定量检测，结果发现接种4h后GUS活性达到峰值，随后逐渐降低，但始终高于对照，说明该启动子受到上述病原真菌的诱导；

[0021] 图5为本发明实施例5所述不同截短启动子在本生烟上瞬时表达后受到玉米纹枯病菌YWK-196诱导后GUS定量检测结果；

[0022] 结果发现，接种24h后进行GUS定量检测，在截去-1144bp至-876bp这个区段后，GUS活性明显减弱，说明与病原诱导相关的元件存在于这个区段；

[0023] 图6为本发明实施例7所述不同截短启动子在本生烟上瞬时表达后受到玉米纹枯病菌YWK-196诱导后GUS定量检测结果；

[0024] 结果发现，接种24h后进行GUS定量检测，在截去-1144bp至-1084bp和-1084bp至-973bp这两个区段后，GUS活性明显减弱，说明与病原诱导相关的元件存在于这两个区段；

[0025] 图7为图1的彩色示意图；

[0026] 图8为图3的彩色示意图。

具体实施方式

[0027] 以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；

[0028] 实施例1玉米GRMZM2G084947基因启动子pGRMZM2G084947序列分析[0029] 首先，根据数据库中GRMZM2G084947基因序列信息，确定其起始密码子ATG上游2068bp的序列为其启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0030] 用 PLACE（Higo K,Ugawa Y,Iwamoto M,Korenaga T.Plant cis-acting regulatory DNA-elements(PLACE).Nucl Acids Res1999,27:297-300.)软件对玉米启动子pGRMZM2G084947的核苷酸序列（序列表中的SEQ IDNO.1）进行序列分析。

[0031] 用上述软件对启动子pGRMZM2G084947中的顺式作用元件进行搜索、预测，结果该启动子中含有众多与已知真核生物的顺式元件的同源序列。其中，将GRMZM2G315431cDNA序列的第一个碱基定义为转录起始位点（记为+1），即序列表中SEQ ID NO.1自5ˊ端的第1895位碱基，其中TATA框位于转录起始位点上游-528至-523位碱基，而CAAT框位于-112至-109位碱基，这些元件在转录中是基本启动子元件。自5ˊ端第-735位，-49位碱基为黄化诱导元件ACGTATERD1(Simpson SD,Nakashima K,Narusaka Y,Seki M,Shinozaki K,Yamaguchi-Shinozaki K.Two different novel cis-acting elements of erd1,a clpA homologous Arabidopsis gene function in induction by dehydration stress and dark-induced senescence.Plant J2003,33:259-270.)；自5ˊ端第-1752位，+93位碱基为胚和胚乳特异表达元件CANBNNAPA(Ellerstrom M,Stalberg K,Ezcurra I,Rask L.Functional dissection of a napin gene promoter:identification of promoter elements required for embryo and endosperm-specific transcription.Plant Mol Biol1996,32:1019-1027.)；自5ˊ端第-1604位，-1674位，-1633位碱基为脱水响应元件CBFHV(Svensson JT,Crosatti C,Campoli C,Bassi R,Stanca AM,Close TJ,Cattivelli L.Transcriptome analysis of cold acclimation in barley albina and xantha mutants.Plant Physiol2006,141:257-270.)；自5ˊ端第-1248位，-949位，-272位，-113位，-1236位，-1223位碱基为热激蛋白基因表达元件CCAATBOX1(Rieping M,Schoffl F.Synergistic effect of upstream sequences,CCAAT box elements,and HSE sequences for enhanced expression of chimaeric heat shock genes in transgenic tobacco.Mol Gen Genet1992,231:226-232.)；自5ˊ 端 第 -1652位，-1856 位，-1808位，-1854位，-1760位碱基为钙调蛋白基因表达元件CGCGBOXAT（Yang T,Poovaiah BW.A calmodulin-binding/CGCG box DNA-binding protein family involved in multiple signaling pathways in plants.J Biol Chem.2002，277:45049-45058.）； 自 5ˊ 端第-1723位，-1103位，-1075位，-961位，-47位，+38位碱基为铜离子诱导表达元件CURECORECR(Quinn JM,Merchant S.Two copper-responsive elements associated with the chlamydomonas Cyc6gene function as targets for transcriptional activators.Plant Cell1995,7:623-628.)；自5ˊ端第-1891位，-1513位，-1001位，-1376位，-1341位，-1034位，-715位，-213位，-1727位，-1577位碱基为DNA结合蛋白基因表达元件DOFCOREZM(Yanagisawa S.Dof1and Dof2transcription factors are associated with expression of multiple genes involved in carbon metabolism in maize.Plant J2000,21:281-288.)；自5ˊ端第-1667位，-1194位，-1100位，-832位，-572位，-558位，-459位，-120位碱基为贮藏蛋白基因表达元件EBOXBNNAPA(Stalberg K,Ellerstom M,Ezcurra I,Ablov S,Rask L.Disruption of an overlapping E-box/ABRE motif abolished high transcription of the napA storage-protein promoter in transgenic Brassica napus seeds.Planta1996,199:515-519.)；自5ˊ端第-1181位，-345位，-1119位，-546位，-501位，-418位，+119位碱基为增强子元件EECCRCAH1(Yoshioka S,Taniguchi F,Miura K,Inoue T,Yamano T,Fukuzawa H.The novel Myb transcription factor LCR1regulates the CO2-responsive gene Cah1,encoding a periplasmic carbonic anhydrase in Chlamydomonas reinhardtii.Plant Cell2004,16:1466-1477.)；自5ˊ端第-1645位，-1524位，-1458位，-1382位，-1017位，-986位，-727位，-598位，-357位碱基为光诱导元件GATABOX(Gilmartin PM,Sarokin L,Memelink J,Chua NH.Molecular light switches for plant genes.Plant Cell1990,2:369-378.)；自5ˊ端 第-1345位，-998位，-1297位，-1168位碱基为病原菌和盐离子诱导表达元件GT-1(Park HC,Kim ML,Kang YH,Jeon JM,Yoo JH,Kim MC,Park CY,Jeong JC,Moon BC,Lee JH,Yoon HW,Lee SH,Chung WS,Lim CO,Lee SY,Hong JC,Cho MJ.Pathogen-and NaCl-induced expression of the SCaM-4promoter is mediated in part by a GT-1box that interacts with a GT-1-like transcription factor.Plant Physiol2004,135:2150-2161.)；自5ˊ端第-1769位，-1673位，-1603位，-633位碱基为低温诱导元件LTRECOREATCOR15（Jiang C,Iu B,Singh J Requirement of a CCGAC cis-acting element for cold induction of the BN115gene from winter Brassica napus Plant Mol Biol.1996,30:679-684）;自5ˊ端第-1003位，-999位，-294位，-1244位，-1178位，-329位,-311位碱基为花粉特异表达元件POLLEN1LELAT52（Bate N,Twell D Functional architecture of a late pollen promoter:pollen-specific transcription is developmentally regulated by multiple stage-specific and co-dependent activator elements Plant Mol Biol.1998,37:859-869）；自5ˊ端第-1557位，-301位，-1323位，-370位，-154位，+123位碱基为水杨酸诱导元件WBOXATNPR1(Chen W,Provart NJ,Glazebrook J,Katagiri F,Chang HS,Eulgem T,Mauch F,Luan S,Zou G,Whitham SA,Budworth PR,Tao Y.Expression profile matrix of Arabidopsistranscription factor genes suggests their putative functions in response to environmental stresses.Plant Cell2002,14:559-574.)。

[0032] 启动子pGRMZM2G084947的序列分析结果表明GRMZM2G084947基因在玉米抗性和胁迫诱导过程中受复杂因素的调控。

[0033] 表1GRMZM2G084947启动子序列中的调控元件分析

[0034]

[0035]

[0036]

[0037]

[0038] N代表A，C，G或T；R代表A或G

[0039] 实施例2构建GRMZM2G084947启动子序列与GUS基因的重组载体并转化水稻中花11

[0040] 以玉米B73DNA为模板，用正向引物，其序列如SEQ ID NO.2所示（5ˊ-AAGCTGCAGCAGGCTACGGGGAACAAGA-3ˊ，带下划线碱基为限制性内切酶PstI识别位点）和反向引物，其序列如SEQ ID NO.3所示（5ˊ-AAGGTCGACTTGCGGCTGCTCGACTTA-3ˊ，带下划线碱基为限制性内切酶SalI识别位点）扩增启动子片段；

[0041] PCR反应程序如下：预变性94℃5min，变性94℃40s，退火62℃40s，延伸72℃2min，反应35个循环，后延伸72℃7min，获得序列如SEQ ID NO.1的启动子片段：-1894bp-+174bp区域，并在序列两端分别添加上限制性内切酶PstI和SalI的识别位点；

[0042] 反应结束后，对PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化目的片段，测序验证所得到的PCR产物，PCR产物用PstI和SalI进行酶切，与经相同酶双酶切的植物表达载体pCAMBIA1391连接。将以上获得的启动子片段连接在GUS基因的上游获得重组载体，命名为pC1391：：pGRMZM2G084947，用电激法将重组载体转化农杆菌EHA105。

[0043] 通过农杆菌介导转化水稻中花11，将分化出的苗子移栽至土中生长。用PCR方法进一步验证检测转基因植株。收获转基因植株种子。将转基因植株种子播种于土中并用于启动子功能以及特征研究。所述转化方法均采用现有技术。

[0044] 实施例3检测pGRMZM2G084947转基因植株对病原菌的诱导反应

[0045] 取在温室生长约3周的T1代实施例2中获得的水稻中花11转基因幼苗做各种处理。分别用水稻白叶枯病病原菌黄单胞菌PXO99，水稻细菌性条斑病菌RS105以及玉米纹枯病菌YWK-196接种水稻幼苗，并设置未接种为对照。检测不同转基因株系接种前后GUS活性的强弱。其中白叶枯病菌和细条病菌在PSA培养基上28℃培养2天，用无菌水重悬，采用注射接种，接种病原菌后1天取植株叶片进行分析；玉米纹枯病菌在PDA培养基上25℃培养2天，打孔器取菌块接种叶片，1天后取接种叶片进行分析。

[0046] 经上述不同处理的转基因植物的GUS分析结果如图所示，其中接种PXO99、RS105后的转基因植株GUS活性与接种H2O相比有明显增强（图1和图2）；接种YWK-196后的转基因植株GUS活性与不接菌CK相比有明显增强（图3和图4）。

[0047] 实施例4构建不同截短的GRMZM2G084947启动子序列与GUS基因的重组载体并在本生烟上瞬时表达

[0048] 以玉米B73DNA为模板，分别用正向引物，其序列如SEQ ID NO.4，5，6，7，8 所 示（5ˊ-GGGCACGCGGCGATAATTTAC-3ˊ，5ˊ-GCTGTTTTGGAGCTTGCCCAC-3ˊ，
5ˊ-CTGGGGTGCATACCATGCTTAAC-3ˊ，5ˊ-TCGCGCAATGGGCTAAAGC-3ˊ，
5ˊ-GCCGTGCCGCTTGTCAAACT-3ˊ）和 反 向 引 物，其 序 列 如 SEQ ID NO.9 所 示（5ˊ-CTCGATCAGTTCCTTGCGGCT-3ˊ）扩增启动子片段；

[0049] PCR反应程序如下：预变性94℃5min，变性94℃40s，退火57℃40s，延伸72℃1.5min，反应35个循环，后延伸72℃7min，获得序列SEQ ID NO.10，11，12，13，14的片段-1656-+174bp，-1144-+174bp，-876-+174bp、-620-+174bp和-166-+174bp区域；

[0050] 反应结束后，对PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化目的片段，测序验证所得到的PCR产物，PCR产物与经XcmI酶切的植物表达载体pCXGUS-P连接。将以上获得的启动子截短片段连接在GUS基因的上游获得重组载体，用电激法将重组载体转化农杆菌GV3101。

[0051] 将培养好的农杆菌GV3101和p19K用10mMMgCl2重悬，调OD600=1.0，等体积混合后注射本生烟叶片，注射3-5d后用于瞬时表达检测。

[0052] 实施例5检测不同截短的pGRMZM2G084947在本生烟上瞬时表达后对病原菌的诱导反应

[0053] 将注射农杆菌3d后的本生烟叶片剪下，平铺在接种盘中，将培养好的玉米纹枯病菌YWK-196用打孔器取下圆形菌块，倒扣在烟草叶片上，保湿25℃处理24h后取接种点叶片进行分析。

[0054] 经上 述接 种的 烟草叶 片GUS分 析结 果如 图所 示，接种 YWK-19624h后，-1656bp-+174bp和 -1144bp-+174bp的GUS 活 性 与 -1894bp-+174bp基 本 一 致，而-876bp-+174bp的GUS活性与-1144bp-+174bp相比有明显的减弱(图5)，说明-1144bp至-876bp这个区段是与病原诱导相关的。

[0055] 实施例6构建-1144bp至-876bp不同截短启动子序列与GUS基因的重组载体并在本生烟上瞬时表达

[0056] 为了进一步精确定位病原诱导相关的区段，对-1144bp至-876bp这一区段进行了再次截短。以玉米B73DNA为模板，分别用正向引物，其序列如SEQ ID NO.15，16所示（5ˊ-TGCTATAGTGTACTCTCCATGGTGC-3ˊ，5ˊ-GCTAATACTCAAGTACGACAAAACC-3ˊ）和反向引物，其序列如SEQ ID NO.17所示（5ˊ-CTCGATCAGTTCCTTGCGG-3ˊ）扩增启动子片段；

[0057] PCR反应程序如下：预变性94℃5min，变性94℃40s，退火55℃40s，延伸72℃1min，反应35个循环，后延伸72℃7min，获得序列SEQ ID NO.18，19的片段-1084bp-+174bp和-973bp-+174bp区域；

[0058] 反应结束后，对PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化目的片段，测序验证所得到的PCR产物，PCR产物与经XcmI酶切的植物表达载体pCXGUS-P连接。将以上获得的启动子截短片段连接在GUS基因的上游获得重组载体，用电激法将重组载体转化农杆菌GV3101。

[0059] 将培养好的农杆菌GV3101和p19K用10mM MgCl2重悬，调OD600=1.0，等体积混合后注射本生烟叶片，注射3-d后用于瞬时表达检测。

[0060] 实施例7检测不同截短启动子在本生烟上瞬时表达后对病原菌的诱导反应[0061] 将注射农杆菌3d后的本生烟叶片剪下，平铺在接种盘中，将培养好的玉米纹枯病菌YWK-196用打孔器取下圆形菌块，倒扣在烟草叶片上，保湿25℃处理24h后取接种点叶片进行分析。

[0062] 经上 述接 种的 烟草 叶片GUS分 析结 果如 图所 示，接种 YWK-19624h后，-1084-+174bp和 与-1144bp-+174bp 相 比GUS 活 性 明 显 减 弱，-973bp-+174bp与-1084-+174bp相比GUS活性明显减弱(图6)，说明-1144bp至-1084bp和-1084bp至-973bp这两个区段是与病原诱导相关的。

[0063] 以上这些结果说明GRMZM2G084947启动子是受到病原菌诱导的，其上存在相应的应答元件，是一个病原相关的启动子，同时通过截短验证，确定了病原诱导相关区段位于﹣1144bp至-1084bp和-1084bp至-973bp这两个区段之间。在确定了上述的病原诱导关键区域后，可以方便的与其他抗病相关基因通过基因工程改造来改善植物抗病性。

[0064] 实施例8利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示病原诱导启动子与植物抗病基因融合（如ZmRxo1、Os11N3、LeCfs等。这里可以举几个可用的植物抗病基因例子，）具体融合方法为常用技术，构建转基因植物材料；发明人发现在不影响植物本身生长发育的前提下，当病原菌侵染时，该启动子对病原菌作出响应，从而激活下游抗病基因的表达，提高植物对病原菌的抗性，对开展植物抗病研究具有重要意义。