一种液相色谱法分离测定L-精氨酸左那氟沙星及其光学异构体的方法

摘要

本发明属药物领域，涉及一种液相色谱法分离测定L-精氨酸左那氟沙星及其光学异构体的方法，本发明的方法以三(3,5-二甲苯基）-氨基甲酸酯直链淀粉为填料的手性色谱柱，以正己烷-低级醇溶液为流动相，其中低级醇溶液中包含选自甲酸、乙酸和三氟乙酸中的一种或多种有机酸，其浓度体积比为0.1～1%；该方法能简单、快速、准确地分离、检测出L-精氨酸左那氟沙星及其光学异构体杂质。

权利要求

1.一种液相色谱法分离测定 L- 精氨酸左那氟沙星及其光学异构体的方法，其特征在于 ：以三 (3,5- 二甲苯基）- 氨基甲酸酯直链淀粉为填料的手性色谱柱，以正己烷-低级醇溶液为流动相，其中低级醇溶液中包含选自甲酸、乙酸和三氟乙酸中的一种或多种有机酸，其浓度体积比为 0.1 ～ 1%。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的低级醇选自以下化合物的一种或多种：甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述正己烷-低级醇溶液的体积比为80:20～50:

50。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于包含以下步骤：

1）取L-精氨酸左那氟沙星或含L-精氨酸左那氟沙星的制剂适量，用乙醇或甲醇溶解样品，并配制成每1ml中含左那氟沙星0.2～5mg的样品溶液；

2）设置流动相流速为0.5～1.5ml/min；检测波长为215～250nm；色谱柱柱温箱温度为

20～50℃；

3）取1）步骤的样品溶液2～50μl，注入高效液相色谱仪，完成L-精氨酸左那氟沙星与光学异构体的分离测定。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于包含以下步骤：取L-精氨酸左那氟沙星适量，加乙醇溶解并稀释制成每1ml中约含左那氟沙星0.5mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液适量，用乙醇稀释制成每1ml中约含左那氟沙星5μg的溶液，作为对照溶液； 以色谱柱规格为4.6×250mm的DAICEL AD-H；以65:35的正己烷-乙醇为流动相，所述乙醇中含

0.1％的三氟乙酸，柱温30℃，流速1.0ml/min；检测波长235nm；取L-精氨酸左那氟沙星及右那氟沙星各适量，加乙醇溶解并稀释制成每1ml中各约含0.1mg的溶液，作为系统适用性试验溶液；精密量取系统适用性试验溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25％；再精密量取供试品溶液及对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，供试品溶液色谱图中右那氟沙星峰不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍。

说明书

一种液相色谱法分离测定L-精氨酸左那氟沙星及其光学异构

体的方法

技术领域

[0001] 本发明属药物领域，具体涉及用液相色谱法分离测定L-精氨酸左那氟沙星及其光学异构体的方法。

背景技术

[0002] 喹诺酮类药物现在已发展到四代，第一代以萘啶酸为代表，第二代以吡哌酸为代表，仅对革兰氏阴性菌有效，第三代是此类药物发展的高峰期，出现了大量新药，并且是广谱抗菌，这其中以诺氟沙星，环丙沙星等为代表。第四代喹诺酮类抗生素则是在第三代广谱的基础上又进一步扩大了抗菌谱，使之可对抗支原体和衣原体感染。

[0003] 国内抗生素研发一直比较热门，目前市场上应用最多的是第三代喹诺酮类药物。那氟沙星由日本大冢公司开发，属于第三代喹诺酮抗菌药，外用治疗痤疮和毛囊炎。1993年首次在日本上市（商品名：Acuatim），2004年在德国上市（商品名：Nadixa），2005年在中国上市（商品名：依尤宁，1％软膏）。

[0004] 那氟沙星结构中存在一个手性碳原子，因此具有一组立体构型不同的光学异构体，即(R)-那氟沙星和(S)-那氟沙星，具有有效的生物活性的是(S)-那氟沙星，研究表明，S-型异构体是主要起效的成分，S-型异构体抗菌活性是消旋体的2倍，是R-异构体的64～256倍。与氨基酸成盐后，增加了水溶性从而提高了生物利用度，增强了稳定性，降低了血管刺激性等副作用。L-精氨酸左那氟沙星是其中S-型异构体的氨基酸盐类，化学名为S-(—)-
9-氟-6，7-二氢-8-(4-羟基-1-哌啶基)-5-甲基-1-氧代-1H，5H-苯并〔i，j〕喹嗪-2-羧酸精氨酸盐。除左那氟沙星外，其光学异构体被列为 L-精氨酸左那氟沙星的杂质。

[0005] 对于L-精氨酸左那氟沙星的光学异构体为杂质，在生产L-精氨酸左那氟沙星过程中需要进行质量控制。手性药物的光学异构体的分离一直是手性药物质量控制的难点。因此，实现L-精氨酸左那氟沙星与其光学异构体的分离测定在于L-精氨酸左那氟沙星质量控制方面具有现实意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种用手性色谱柱分离测定L-精氨酸左那氟沙星及其光学异构体杂质的高效液相色谱方法，可以将L-精氨酸左那氟沙星与其光学异构体进行有效分离，从而可以准确控制L-精氨酸左那氟沙星的质量，从而实现L-精氨酸左那氟沙星与其光学异构体的分离测定。

[0007] 本发明所说的用液相色谱方法分离测定L-精氨酸左那氟沙星及其光学异构体杂质的方法，是以三(3,5－二甲苯基）-氨基甲酸酯直链淀粉[Amylose tris(3,5-dimethylphenyl carbamate)]为填料的手性色谱柱，以正己烷-低级醇溶液为流动相，其中低级醇溶液中包含有机酸。这里所说的液相色谱法包括高效液相色谱法或高效液相色谱法-质谱法联用。

[0008] 上述所说的手性色谱柱选自牌号为CHIRALPAK AD和CHIRALPAK AD-H的色谱柱。

[0009] 本发明的低级醇选自以下溶剂：甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇，或其混合物，优选为乙醇或异丙醇。

[0010] 本发明所述的方法，其流动相正己烷-低级醇溶液的体积比为80:20～50:50。

[0011] 上述所说的低级醇溶液中包含的有机酸选自甲酸、乙酸和三氟乙酸，有机酸的浓度占低级醇溶液的体积百分比（V/V)为0.1～1%。

[0012] 本发明所述的分离测定方法，可按以下方法实现：

[0013] 1）取L-精氨酸左那氟沙星或含L-精氨酸左那氟沙星的制剂适量，用乙醇或甲醇溶解样品，并配制成每1ml中含左那氟沙星0.2～5mg的样品溶液；

[0014] 2）设置流动相的流速为0.5～1.5ml/min，流动相的流速优选为1.0ml/min；检测波长为215～250nm，最佳检测波长为235nm；色谱柱柱温箱温度为20～50℃，最佳柱温为30℃；

[0015] 3)取1）的样品溶液2～50μl，注入高效液相色谱仪，完成L-精氨酸左那氟沙星与光学异构体的分离测定。

[0016] 其中：

[0017] 高效液相色谱仪：戴安P680型高效液相色谱仪；

[0018] 色谱柱：CHIRALPAK AD-H手性色谱柱（250mm×4.6mm）；

[0019] 柱温：30℃；

[0020] 流动相：正己烷-乙醇（含0.1％的三氟乙酸）=（65:35）；

[0021] 流量：1.0ml/min；

[0022] 检测波长：235nm；

[0023] 进样体积：20μl ；

[0024] 所述的分离测定方法，照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D）测定。

[0025] 最优选的液相色谱法分离测定L-精氨酸左那氟沙星及其光学异构体的方法为：取L-精氨酸左那氟沙星适量，加乙醇溶解并稀释制成每1ml中约含左那氟沙星0.5mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取适量，用乙醇稀释制成每1ml中约含左那氟沙星5μg的溶液，作为对照溶液；照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D）测定。 以DAICEL AD-H（ 4.6×250mm）色谱柱；以正己烷-乙醇（含0.1％的三氟乙酸）（35:65）为流动相，柱温30℃，流速1.0ml/min；检测波长235nm；取L-精氨酸左那氟沙星及右那氟沙星各适量，加乙醇溶解并稀释制成每1ml中各约含0.1mg的溶液，作为系统适用性试验溶液。精密量取系统适用性试验溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，精氨酸左那氟沙星与右那氟沙星依次出峰，两者的分离度应符合要求。取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25％；再精密量取供试品溶液及对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，供试品溶液色谱图中右那氟沙星峰不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍（0.2%）。

[0026] 本发明采用CHIRALPAK AD-H手性色谱柱，能够有效分离测定L-精氨酸左那氟沙星的光学异构体；选用乙醇或甲醇溶解样品，确保了溶液的稳定性；选用进样体积为20μl，柱温为30℃，提高了色谱峰的对称性。本发明解决了分离测定L-精氨酸左那氟沙星的光学异构体的测定问题，能简单、快速、准确地分离、检测出L-精氨酸左那氟沙星及其光学异构体杂质，从而保证了L-精氨酸左那氟沙星及其制剂的质量可控。

附图说明

[0027] 图1 空白溶剂的高效液相色谱图；

[0028] 图2 那氟沙星消旋体的高效液相色谱图；

[0029] 图3 L-精氨酸左那氟沙星的高效液相色谱图；

[0030] 图4 空白辅料的高效液相色谱图；

[0031] 图5 L-精氨酸左那氟沙星片的高效液相色谱图。

具体实施方式

[0032] 实施例1

[0033] 试验仪器：

[0034] 美国戴安P680型高效液相色谱系统及工作站；自动进样；以CHIRALPAK AD-H手性色谱柱（250mm×4.6mm）为分离柱；

[0035] 检测条件：

[0036] 紫外检测波长：235nm；流动相：正己烷-乙醇（含0.1％的三氟乙酸）=（65:35）；柱温30℃；进样体积为20μl。

[0037] 试验步骤：

[0038] 取那氟沙星消旋体约10mg，置100ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（1）。分别取乙醇空白溶液和供试品溶液（1），按上述试验仪器和检测条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图1、图2。图2中保留时间为6.805分钟的色谱峰为左那氟沙星的色谱峰；11.640分钟的色谱峰为左那氟沙星光学异构体的色谱峰。

[0039] 取 L-精氨酸左那氟沙星约42mg（约相当于左那氟沙星25mg），置50ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（2）。取供试品溶液（2），按上述试验仪器和检测条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图3。图3证明， L-精氨酸左那氟沙星的光学纯度达到药品用原料药要求，本法可以用于L-精氨酸左那氟沙星的质量监测。

[0040] 取 L-精氨酸左那氟沙星片（辅料为羧甲基纤维素钠、L-精氨酸）适量，约相当于左那氟沙星25mg，置50ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液（3）。分别取空白辅料（辅料为羧甲基纤维素钠、L-精氨酸）溶液和取供试品溶液（3），按上述验仪器和检测条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图4、图5。 图4证明， 空白辅料不干扰测定，图5表明本法可以用于L-精氨酸左那氟沙星制剂的质量监测。

[0041] 实施例2

[0042] 试验仪器：

[0043] 美国戴安P680型高效液相色谱系统及工作站；自动进样；以CHIRALPAK AD-H手性色谱柱（250mm×4.6mm）为分离柱；

[0044] 检测条件：

[0045] 紫外检测波长：235nm；流动相：正己烷-甲醇（含0.1％的三氟乙酸）=（65:35）；柱温30℃；进样体积为20μl。

[0046] 试验步骤：

[0047] 取那氟沙星消旋体约10mg，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（1）。分别取甲醇空白溶液和供试品溶液（1），按上述试验仪器和检测条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图1、图2。图2中保留时间为6.805分钟的色谱峰为左那氟沙星的色谱峰；11.640分钟的色谱峰为左那氟沙星光学异构体的色谱峰。

[0048] 取 L-精氨酸左那氟沙星约42mg（约相当于左那氟沙星25mg），置50ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（2）。取供试品溶液（2），按上述试验仪器和检测条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图3。图3证明， L-精氨酸左那氟沙星的光学纯度达到药品用原料药要求，本法可以用于L-精氨酸左那氟沙星的质量监测。

[0049] 取 L-精氨酸左那氟沙星片（辅料为羧甲基纤维素钠、L-精氨酸）适量，约相当于左那氟沙星25mg，置50ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液（3）。分别取空白辅料（辅料为羧甲基纤维素钠、L-精氨酸）溶液和取供试品溶液（3），按上述验仪器和检测条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图4、图5。 图4证明， 空白辅料不干扰测定，图5表明本法可以用于L-精氨酸左那氟沙星制剂的质量监测。

[0050] 实施例3

[0051] 检测条件：紫外检测波长：215nm；流动相：正己烷-乙醇（含0.5％的三氟乙酸）=（60:40）；柱温20℃；进样体积为20μl。

[0052] 检测仪器及试验测定方法同实施例1。

[0053] 实施例4：

[0054] 检测条件：紫外检测波长：250nm；流动相：正己烷-乙醇（含0.2％的甲酸）=（80:20）；柱温50℃；进样体积为20μl。

[0055] 检测仪器及试验测定方法同实施例1。

[0056] 实施例5：

[0057] 检测条件：紫外检测波长：220nm；流动相：正己烷-乙醇（含1％的三氟乙酸）=（50:50）；柱温40℃；进样体积为20μl。

[0058] 检测仪器及试验测定方法同实施例1。

[0059] 实施例6

[0060] 检测条件：紫外检测波长：235nm；流动相：正己烷-异丙醇（含0.1％的甲酸）=（65:35）；柱温30℃；进样体积为20μl。

[0061] 检测仪器及试验测定方法同实施例1。

[0062] 实施例7

[0063] 检测条件：紫外检测波长：250nm；流动相：正己烷-异丙醇（含0. 5％的三氟乙酸）=（60:40）；柱温20℃；进样体积为20μl。

[0064] 检测仪器及试验测定方法同实施例1。

[0065] 实施例8

[0066] 检测条件：紫外检测波长：235nm；流动相：正己烷-甲醇（含0.1％的乙酸）=（65:35）；柱温30℃；进样体积为20μl。

[0067] 检测仪器及试验测定方法同实施例1。

[0068] 实施例9

[0069] 检测条件：紫外检测波长：215nm；流动相：正己烷-甲醇（含1％的三氟乙酸）=（70:30）；柱温20℃；进样体积为20μl。

[0070] 检测仪器及试验测定方法同实施例1。

[0071] 实施例10

[0072] 检测条件：紫外检测波长：215nm；流动相：正己烷-甲醇（含0.1％的甲酸和0.1％的乙酸）=（70:30）；柱温20℃；进样体积为20μl。

[0073] 检测仪器及试验测定方法同实施例1。