他克莫司联合氟康唑在制备抗真菌药物中的应用

摘要

本发明公开了他克莫司联合氟康唑在制备抗真菌药物中的应用。本发明以多种方法研究氟康唑和他克莫司联用对常见非白色念珠菌的静态与动态联合抗真菌作用。研究发现，他克莫司联合氟康唑对非白色念珠菌（光滑念珠菌和克柔念珠菌）具有明显的协同抗真菌作用。可以预见，他克莫司联合氟康唑可以用于制备抗真菌药物。本发明将他克莫司与氟康唑联合应用，可以增强氟康唑对非白色念珠菌的抗菌活性，产生协同的抗真菌作用，并能够逆转非白色念珠菌对氟康唑的耐药性，为新药的开发及老药新用提供了研究方向。

权利要求

1. 他克莫司联合氟康唑在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于：所述真菌为克柔念珠菌。

说明书

他克莫司联合氟康唑在制备抗真菌药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及他克莫司联合氟康唑在制备抗真菌药物中的应用。

背景技术

[0002] 随着肿瘤及艾滋病患者的不断增加，器官移植、导管插管及内窥镜技术的普遍开展，高效广谱抗生素、FK506及激素的广泛应用，人类深部真菌感染的发病率逐年增加，真菌已成为医院内感染的重要致病菌。白色念珠菌是临床真菌感染中常见的分离菌，氟康唑（fluconazole,FLC）对其有效。但随着FLC在临床的广泛应用，对其不敏感的非白色念珠菌（non-Candida albicansspecies），如光滑念珠菌（Candida glabrata，CG）、热带念珠菌、克柔念珠菌（Candida krusei，CK）、近平滑念珠菌等，分离率逐渐上升，在器官移植的病人中越来越多的非白色念珠菌被分离，甚至在某些地区非白色念珠菌的分离率高于白色念珠菌。据文献报道，非白色念珠菌对FLC耐药率已达57.5%,其中热带念珠菌、光滑念珠菌对FLC耐药性达19.4%，克柔念珠菌对FLC耐药率达100％。除此之外，非白色念珠菌对FLC、伊曲康唑等药物出现了不同程度的交叉耐药，交叉耐药性高于白色念珠菌。因此，非白色念珠菌近年来由于分离率不断升高，且对常用抗真菌药物的敏感性低，给临床抗感染治疗带来了挑战，引起了人们的关注和重视。

[0003] 非白色念珠菌在结构、致病性、耐药性等方面均与白色念珠菌不同；虽然毒力弱，但它对生物表面的粘附力却非常强，易感染免疫低下的患者，死亡率高。现有抗真菌药物品种有限，虽然已用于临床的新的唑类抗真菌药伏立康唑、棘白菌素类药物卡泊芬净和两性霉素B对非白色念珠菌有效，但它们价格昂贵，且副作用大，而开发新的抗菌谱能够覆盖非白色念珠菌的药物，耗时耗资巨大。FLC是临床最常用的抗真菌药物，具有价格便宜、副作用小、生物利用度高等优点。因此，如能从临床上应用的药物中发现能够增加FLC对非白色念珠菌敏感性的成分，联合克服非白色念珠菌对FLC的耐药性，将有重要的临床意义。

[0004] 关于FLC与其他药物联用抗真菌的研究可分为两大类：一是同为抗真菌药物之间的联用；二是FLC与非抗真菌药物之间的联用。近年来，第二种联用方式给抗真菌研究提供了新的思路，并成为大家研究的热点。这些非抗真菌药物单独应用时对真菌的作用效果很弱或无，但与FLC联用时能增强其抗真菌作用，呈现出协同作用效果。

[0005] 他克莫司（tacrolimus，FK506）在临床上广泛应用于器官移植、自身免疫性疾病的患者，而这些患者易遭受真菌感染。在临床上FK506有与FLC联合应用的机会；另外，现有研究表 明FK506与唑类药物联合，具有抗白色念珠菌的作用，特别是对耐药菌。但对于FK506和FLC联用能否逆转非白色念珠菌对FLC的耐药性，目前尚无大型定量研究报道。

发明内容

[0006] 针对上述现有技术，本发明拟以多种方法，研究FLC和FK506联用对常见非白色念珠菌的静态与动态联合抗真菌作用，研究发现，他克莫司联合氟康唑对非白色念珠菌（光滑念珠菌及克柔念珠菌）具有明显的抑制作用，能够逆转这些非白色念珠菌对FLC的耐药性，可以预见，他克莫司联合氟康唑可以用于制备抗真菌药物，这些真菌包括光滑念珠菌和克柔念珠菌。

[0007] 进一步地，对于对氟康唑呈剂量依赖性敏感的光滑念珠菌，联合应用时，他克莫司的最低抑菌浓度为0.5μg/ml，氟康唑的最低抑菌浓度为8μg/ml。对于对氟康唑耐药的光滑念珠菌，他克莫司的最低抑菌浓度为8μg/ml，氟康唑的最低抑菌浓度为16μg/ml。对于对氟康唑呈低耐药的克柔念珠菌，他克莫司的最低抑菌浓度为0.25μg/ml，氟康唑的最低抑菌浓度为8μg/ml；对于对氟康唑高耐药的克柔念珠菌，他克莫司的最低抑菌浓度为8μg/ml，氟康唑的最低抑菌浓度为16μg/ml。

[0008] 更进一步地，所述他克莫司与氟康唑的浓度以他克莫司0.5μg/ml，氟康唑8μg/ml为最佳。

[0009] 经检索，虽然已有他克莫司与氟康唑联合抗白色念珠菌的报道，但目前尚无二者联合对非白色念珠菌的抗真菌作用研究报道，所以本发明的应用具备非显而易见性。本发明将他克莫司与氟康唑联合应用，可以增强氟康唑对非白色念珠菌的抗菌活性，产生协同的抗真菌作用，并能够逆转非白色念珠菌对氟康唑的耐药性，为新药的开发及老药新用提供了研究方向。附图说明

[0010] 图1：FLC和FK506联用抗CK9作用效果（以XTT显示两药联合时于96孔平板的作用效果）。

[0011] 图2：FLC和FK506联用抗CK9作用三维效果图（X轴：FLC浓度；Y轴：FK506浓度；Z轴：各浓度组合下的ΔE值）。

[0012] 图3：FLC和FK506联用对非白色念珠菌的时间-杀菌曲线，其中，（A）：FLC和FK506联用对光滑念珠菌CG4的曲线图，FLC浓度10μg/mL，FK506浓度0.5μg/mL；（B）：FLC和FK506联用对克柔念珠菌CK4的曲线图，FLC浓度10μg/mL，FK506浓度0.25μg/mL。

具体实施方式

[0013] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

[0014] 实施例1FLC与FK506联合抗真菌静态作用测定

[0015] 1.材料

[0016] 1.1实验菌株

[0017] 质控菌株：标准菌株CPATCC10231（近平滑念珠菌）。

[0018] 实验菌株：临床分离的非白色念珠菌，经科玛嘉显色鉴别培养基鉴别确认，在固体培养基上传代培养。光滑念珠菌编号为CG1、CG2、CG3、CG4、CG5、CG8，克柔念珠菌编号为CK2、CK3、CK4、CK6、CK7、CK8、CK9、CK10。

[0019] 1.2药品与试剂

[0020] FLC，山东诚创医药技术开发有限公司。

[0021] FK506，中国药品生物制品检定所。

[0022] PBS（磷酸盐缓冲液）粉末，北京索莱宝科技有限公司，批号101012。

[0023] PBS溶液：称取PBS粉末（北京索莱宝科技有限公司）24g，溶于2L双蒸水中即得到pH7.2的PBS缓冲溶液。121℃高温高压湿热灭菌20min，冷却分装备用。

[0024] 二甲基亚砜（DMSO），Merck公司。

[0025] 3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

[0026] 酵母浸膏，北京奥博星生物技术有限责任公司，批号100402。

[0027] 蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司，批号100526。

[0028] 葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司，批号20101102。

[0029] 琼脂粉，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

[0030] RPMI1640液体培养液：取RPMI1640（含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠）粉末（美国GIBCO公司）4.16g，加入10%葡萄糖溶液80ml及MOPS粉13.812g，加蒸馏水至约为400ml，混合均匀后在22℃用1mol/L的NaOH溶液调pH为7.0，临用前用0.22μm混合纤维膜过滤灭菌。

[0031] 酵母浸膏-蛋白胨-葡萄糖(YPD)琼脂培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸膏10g，琼脂粉20g，用1000ml蒸馏水溶解，充分搅拌均匀后121℃灭菌20min，冷却后4℃冰箱保存备用；

[0032] XTT-甲萘醌溶液：取XTT粉末0.0500g，溶解于100ml已灭菌的林格氏液配成0.5mg/ml的溶液，用0.22μm滤膜滤过灭菌；加入10μl的100mmol/L的甲萘醌丙酮溶液（取甲萘醌0.0860g溶解于5ml丙酮），使其终浓度为10μmol/L，摇匀，4℃避光保存。

[0033] 96孔培养板，美国COSTAR公司。

[0034] 1.3仪器

[0035]

[0036] 2.内容与方法

[0037] 2.1实验菌种及菌株的确定

[0038] 非白色念珠菌主要分为光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌及克柔念珠菌等。在上述4种菌中，克柔念珠菌耐药性最大，其对FLC天然耐药，对伊曲康唑耐药率不断上升，且在唑类药物之间存在交叉耐药现象；光滑念珠菌因其具有很强的获得耐药性，它的耐药性仅次于克柔念珠菌；热带念珠菌和近平滑念珠菌对FLC相对敏感。然而就分离率而言，在很多地区光滑念珠菌的分离率在非白色念珠菌中为最高，其次为热带念珠菌和近平滑念珠菌，克柔念珠菌相对分离率低，只在少数地区具有较高的分离率。综合对FLC的敏感性及临床分离率，本次试验选用光滑念珠菌及克柔念珠菌来进行后续的研究。

[0039] 实验菌种确定后，根据NCCLS推荐的M27-A3方案进行FLC的药敏试验来选择不同敏感性的光滑念珠菌和克柔念珠菌菌株。96孔板加好后，恒温35℃培养24h。然后加入XTT-甲萘醌溶液避光培养2h，用酶标仪在492nm处测OD值。根据在24h判读折点的最新标准（对于CG：MIC≤32μg/ml，为剂量依赖性敏感菌株SDD，MIC＞32μg/ml，为耐药菌株R；对于CK：为天然耐药菌株R），选取的光滑念珠菌为CG4（SDD）、CG8（SDD），CG2（R），CG3（R）；克柔念珠菌CK2（低耐药）、CK3（低耐药）、CK4（低耐药）、CK6（低耐药）、CK7（低耐药）、CK8（高耐药）、CK9（高耐药）、CK10（高耐药）。

[0040] 2.2实验菌液与实验药液的配制

[0041] 2.2.1菌液的配制

[0042] 受试菌株在YPD培养基上转种2次，挑取单个较大菌落用PBS缓冲液配成菌悬液，6
以中国细菌标准浊度管比浊，调整浓度约为4.5×10CFU/mL，以RPMI1640液体培养基将其
3
稀释使96孔平板内工作菌液浓度为2.25×10CFU/mL。在显微镜下用血球计数板验证工作菌液浓度。

[0043] 2.2.2药液的配制

[0044] FLC以灭菌蒸馏水配成2560μg/ml，FK506以DMSO配成6400μg/ml，将各药物母液以RPMI1640进行对倍稀释达到系列工作浓度。

[0045] 2.3联合药敏测定

[0046] 根据NCCLS颁布的抗真菌药敏试验M27-A3方案，采用96孔板模型测定FLC与3
FK506联用时的MIC值。经前期实验条件摸索，各菌株工作菌液浓度为2.25×10CFU/mL，FLC的浓度设计为0.25-128μg/ml，对剂量依赖性敏感（SDD）的CG和低耐药的CK，FK506的浓度设计为体内能够达到的药物浓度0.008-0.5μg/ml；对耐药的CG和高耐药的CK，FK506的浓度设计为0.25-16μg/ml。第12列作为空白对照不加菌液，其余各孔加入100μl菌液，H1孔为生长对照孔。其余不足200μl的孔以1640培养液补齐。35℃恒温培养24h后，然后加入XTT-甲萘醌溶液避光培养2h,用酶标仪在492nm处测OD值。得到OD值后按以下公式计算真菌生长百分数：真菌生长百分数=(各孔OD值一空白对照孔OD值)/生长对照孔OD值×100％，以抑制80％以上真菌生长的最低药物浓度为MIC值。所有实验重复三次。

[0047] 2.4评价方法与结果判定

[0048] Loeweadditivity(LA)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用，因此将药物单用或联用产生相同药效的浓度（等效位点）进行比较。其分析方法为分数抑菌浓度指数法（fractionalinhibitoryconcentrationindex,FICI），表述如下：

[0049] ΣFIC=FICA+FICB=CA/MICA+CB/MIC；

[0050] MICA和MICB分别是药物A和B单用时的最小抑菌浓度，CA与CB为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。联合作用效果评价标准依据Odds的建议：FICI≤0.5为协同，FICI>4为拮抗，在0.5与4之间为相加或无关。

[0051] 3.结果

[0052] 实验结果表明FLC与FK506联用对所有光滑念珠菌和克柔念珠菌表现为协同作用。24h和48h作用评价结果总结如表1和表2所示。

[0053] 表1FLC与FK506单用及联用24h的MIC值及作用判定结果

[0054]

[0055] 表2FLC与FK506单用及联用48h的MIC值及作用判定

[0056]

[0057]

[0058] 从上表中可以看出FLC和FK506联用对耐药的CG和高耐药的CK协同作用较好，FICI值远小于0.5。其中在对FLC和FK506联用对CK9的药敏实验测定中，加入XTT避光孵育2h后的照片如图1所示。从图中可以明显地看出两药较强的协同作用，FK506的加入可以使CK9的MIC80%从256μg/ml降到16μg/ml，下降了4个梯度。

[0059] 为更直观地表现FK506和FLC联用对耐药的非白色念珠菌的作用程度，将联合药敏测定数据用基于BI理论的ΔE（生长百分数差值）模型分析。E为真菌生长百分数，ΔE=E理论-E实际。其中，E理论=EA×EB，为药物A与B联用时在无相互作用的假设下理论上的真菌生长百分数，EA与EB分别为两种药物单独应用时实际的真菌生长百分数；E实际为每一组药物联用浓度下对应的实际生长百分数。药物相互作用效果以药物各浓度下真菌生长百分数的理论值与实验值之差—ΔE评价，每一药物联用组合均可得到一个ΔE值。用Matlab数据分析软件作图，以联合应用的两药浓度分别为X轴和Y轴，ΔE值为Z轴，可以形成一个三维图像，0平面上或下的峰分别表示协同或拮抗，0平面表示无统计学显著区别。FK506和FLC联用对CK924h结果判读时，联用药物组合对应的ΔE值形成的三维图像如图2所示。由图2可以看出两者联用对高耐药的CK9呈现出较强的协同作用，在有效的药物浓度范围有较高的ΔE值，图中高度越高，协同作用效果越好。

[0060] 4.结论

[0061] 面对临床应用中抗真菌药物较少且出现耐药现象的现状，研制新型的抗真菌药物是解决这一问题的途径之一，同时通过联合用药的方式来增加真菌对药物的敏感性也是一种较好的选择。FLC和FK506联用对SDD的光滑念珠菌和对FLC低耐药的克柔念珠菌起效的FK506浓度在体内是可以达到的；对耐药的CG和高耐药的CK起效的FK506浓度在体内很难达到，只能在个别脏器如肝脏或许可以达到。但有意义的是，有文献报道耐药的光滑念珠菌只占了9%；高耐药的克柔念珠菌（MIC＞64μg/ml）占了40%，低耐药的克柔念珠菌占了57%。从以上数据可以看出SDD的CG和低耐药的CK占的比重多于耐药的CG和高耐药的CK，FLC和FK506联合治疗非白色念珠菌感染在临床有一定的应用前景。

[0062] 实施例2FLC与FK506联合抗真菌动态作用测定

[0063] 1.材料

[0064] 1.1菌株

[0065] 实验所用菌株为临床分离的光滑念珠菌CG4和克柔念珠菌CK4，经科玛嘉酵母菌鉴别培养基鉴别确认，在固体培养基上传代培养。

[0066] 1.2药品与试剂

[0067] FLC和FK506原料药；二甲基亚砜DMSO；PBS缓冲液；0.1mol/LNaOH溶液；科玛嘉显色培养基（法国）；RPMI1640（GIBCO，美国，含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，以MOPS缓冲液调pH至7.0）；酵母浸膏-蛋白胨-葡萄糖(YPD)琼脂培养基。

[0068] 1.3仪器

[0069] MMM-55L恒温培养箱（德国）；MMM-55L干热灭菌器（德国）；THZ-C恒温振荡器；HS-9041台式蒸汽灭菌器（韩国）；ESCO超净操作台（韩国）。

[0070] 2.内容与方法

[0071] 本实验采用实验药物于体内可获得的浓度，建立药物单用与药物联用作用体系，在35℃振荡培养48h。分别在0h、6h、12h、24h、48h从体系中吸取少量菌液，经系列稀释后倒平板菌落计数，测定药物的动态抗菌活性大小。

[0072] 2.1体系的建立

[0073] 实验建立4个作用体系：生长对照组、FK506单用组、FLC单用组以及FLC和FK506联用组。

[0074] 2.1.1实验菌液与实验药液的制备

[0075] 取于YPD培养基上传代两次的CG4和CK4，挑取单个较大菌落，以PBS缓冲液制成6
菌悬液，采用中国浊度标准进行比浊，初浓度为4.5×10CFU/mL，以RPMI1640液体培养基适当稀释至工作浓度。在显微镜下用血球计数板验证工作菌液浓度。

[0076] 取与实施例1同法配制的药物母液，以RPMI1640进行倍比稀释，参照药物在人体内的可获得浓度以及上一部分静态药敏实验结果，配制工作药液，使药物在时间-杀菌曲线工作体系内的浓度分别为：FLC-10μg/mL，FK506-0.5μg/mL（CG4）；FLC-10μg/mL，FK506-0.25μg/mL（CK4）。

[0077] 2.1.2体系的制备与培养

[0078] 制备生长对照组、FK506单用组、FLC单用组以及FLC与FK506联用组四个体系，各体系均为5mL，每组加0.5mL菌液，具体制备方法见表3。

[0079] 表3药物作用体系制备方法

[0080]

[0081]

[0082] 将制备完毕的体系于35℃振荡培养48h。

[0083] 2.2药物联用时的动态抗菌活性测定

[0084] 作用体系制备完毕后，分别在体系建立后的0h、6h、12h、24h和48h从各组中吸取一定量的菌悬液，并经过系列10倍稀释后，采用菌落计数法测定药物单用及联用的动态抗菌活性。实验重复3次取平均值。

[0085] 3.结果

[0086] 本部分实验联用药效评价标准如下：如果与活性最强的成分相比，药物联用体系每毫升CFU的常用对数下降值大于或等于2为协同作用；与活性最低的成分相比，每毫升CFU的常用对数升高值大于或等于2为拮抗作用；其他情况为无关作用。依据不同时间点菌落计数结果，绘制FLC分别和FK506联用48h内对CG4和CK4的时间-杀菌曲线，如图3所示。从图3可以看出，对于光滑念珠菌CG4和克柔念珠菌CK4，FK506单用组和生长组相比几乎无抗真菌作用，FLC单用组有一定的抗真菌作用，FLC和FK506联用组与FLC单用组相比，24h时常用对数值的下降值都超过了2，曲线有较好的分离，协同抗真菌作用较强。

[0087] 4.结论

[0088] 时间-杀菌曲线法可提供药物单用或联用时对受试菌株影响的动态作用结果，广泛应用于评价抗菌药物单用及联用时的抗菌效果。本研究动态抗菌实验结果表明FLC和FK506联用后对光滑念珠菌CG4和克柔念珠菌CK4呈现出协同作用，这与上一章实验结果是一致的，而且所应用的FLC和FK506的浓度在体内是能够达到的药物浓度。