利用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法转让专利
申请号 : CN201310486413.0
文献号 : CN103520715B
文献日 : 2015-05-13
发明人 : 乔云龙 , 张娇娇 , 杨艳坤 , 李山峰
申请人 : 黑龙江省百洲生物工程有限公司
摘要 :
本发明公开了一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，该方法包括：（1）细胞的培养：将细胞接种到细胞培养袋的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体、洗涤培养的细胞，接种猪圆环病毒2型病毒毒种，加入病毒增殖培养基继续培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液灭活后，乳化，即得。本发明方法优化了波浪生物反应器培养PK15细胞的各工艺参数，有效提升了PK15细胞的培养效率，最终显著提高了猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产效能以及免疫保护效力。免疫保护效力实验证实，本发明方法所制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗对于家畜有确切的免疫保护效力。
权利要求 :
1.一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，其特征在于：
5
包括：(1)细胞的培养：将PK15细胞按照3×10个/mL的接种量接种到细胞培养袋的微载体Cytodex-1上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；其中，微载体Cytodex-1在细胞培养袋中的含量是3g/L；所述的摇动参数为摆动角度8°、摆动速度为14rpm；(2)病毒液的增殖：沉降微载体Cytodex-1，洗涤培养的PK15细胞；接种猪圆环病毒2型病毒毒种，加入病毒增殖培养基继续培养细胞，收获病毒液；(3)将病毒液灭活后，乳化，得到猪圆环病毒2型灭活疫苗。
说明书 :
利用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的
方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，尤其涉及一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，属于猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产领域。
背景技术
[0002] 目前，猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产主要是转瓶细胞培养的传统培养方式，进而增殖猪圆环病毒。但转瓶培养细胞增殖较为缓慢而且生产过程中对细胞和病毒的培养条件，如pH、溶氧、糖耗等难以监控和适时补给，无法提供最佳的培养条件，造成该方法自动化程度低，劳动强度大，并因为转瓶细胞培养环境的不可控性，导致生产的产品质量稳定性不够，批间差较大。而PCV2的生物学特殊性比较特殊，它在细胞上的增殖滴度很低，而且不引起细胞病变，因此产毒滴度较低也是一个更为重要的问题，并且与当前大规模动物疫苗生产不相适应。此外如要扩大生产规模只能通过增加转瓶数量的方法，结果导致车间规模、设备通入、人员等需求更大，劳动量更大。另外提高病毒毒价，保证良好的临床效果是解决猪圆环病毒2型灭活疫苗产业化的当务之急。而用生物反应器替代转瓶生产疫苗株则克服了上述所述不足，成为最具有前途的猪圆环病毒2型灭活疫苗生产技术之一。
[0003] WAVE波浪生物反应器是采用抛弃型生产技术进行细胞培养的一种新型反应器，其工作方式是，细胞接种于可抛弃的细胞培养袋内，接种细胞的培养袋固定在托盘上以一定的方式摇动，精密控制的摇动保证了培养体系的有效混合和传氧效率。采用WAVE波浪生物反应器培养细胞，主要优点有：1）免除生物反应器清洗、消毒及其相关认证。2）封闭培养系统，无需固定的管道，简化细胞培养厂房，缩短反应器安装和生产产品转换时间。3）细胞培养袋Cellbag放在特殊设计的摇动平台上，平台的摇动在培养液中产生波浪提供培养物混合和氧气传递，产生一个适于细胞生长的完美环境。
[0004] 采用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗时，所加入微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养袋的摇动参数等生产条件对于猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力的高低等有非常显著的影响，在生产实践中需要对这些条件进行优化才能有效提高猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，该方法对微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养条件等参数进行了优化，有效提升了猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。
[0006] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0007] 一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，包括：（1）细胞的培养：将PK15细胞接种到细胞培养袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体，洗涤培养的细胞，接种猪圆环病毒2型病毒毒种，加入病毒增殖培养基培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液灭活后，乳化，得到猪圆环病毒2型灭活疫苗；其中，所述的摇动条件为摆动角度8°、摆动速度为14rpm。
[0008] 采用WAVE波浪生物反应器培养PK15细胞时，摇动培养参数对于细胞在微载体上的吸附以及细胞生长有非常显著的影响，为了筛选到最适宜的摇动培养参数以最大限度的促进细胞生长，本发明对摇动培养时的摆动角度以及摆动速度等参数进行了优化考察，观察不同的培养条件对于细胞的生长所带来的影响。通过实验发现，在对于细胞培养袋中的细胞进行摇动培养时，摆动角度以及摆动速度对于细胞的生长有非常显著的影响；本发明最终发现，当摇动培养时的培养条件为摆动角度8°、摆动速度为14rpm能够最为显著的促进细胞的生长，该培养条件下的细胞生长速度显著高于其它的培养条件。
[0009] 此外，细胞接种密度与微载体含量对细胞生长的影响也密切相关，其中重要的标志是接种时要保证合适的细胞密度与载体的比例关系。在每克微载体接种相同细胞数的前提下，本发明考察微载体（Cytodex1）含量为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L时细胞生长情况，用来确定合适的载体用量。为了生产高滴度的病毒，需要细胞密度较高，同时，为了较快和高效的培养细胞，又要求细胞的细胞扩增倍数较高。从实验结果可见，随着微载体含量的增加，细胞密度会有所增加，但细胞扩增倍数较低。当微载体含量为3g/L时，不仅细胞密度高，细胞扩增倍数也较高。
[0010] 在确定了微载体最适宜用量的基础上，本发明为3g/L的微载体用量，分别以不同的接种密度接种细胞，每天取样分析，以筛选最适宜的细胞接种密度。从实验结果可见，当4 5
微载体含量相等，不同的接种密度对PK15细胞生长影响较大。以5×10、1×10个/mL接
5
种时，接种密度低接种后5天仍在缓慢生长，没有进入稳定生长期的明显标志；以2×10、
5 5 5 5
3×10、4×10、5×10、6×10个/mL接种时接种密度高，PK15细胞在接种后第2天进入稳定生长期；随着细胞接种密度的增高，PK15细胞生长速度的增加并不与细胞接种密度增加
5
保持同步；当PK15细胞接种密度为3×10个/mL时，PK15细胞在第4天和第5天后的生
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长速度要明显高于其它接种密度的生长速度，因此，本发明优选采用3×10个/mL的接种量接种PK15细胞。
微载体含量相等，不同的接种密度对PK15细胞生长影响较大。以5×10、1×10个/mL接
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种时，接种密度低接种后5天仍在缓慢生长，没有进入稳定生长期的明显标志；以2×10、
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3×10、4×10、5×10、6×10个/mL接种时接种密度高，PK15细胞在接种后第2天进入稳定生长期；随着细胞接种密度的增高，PK15细胞生长速度的增加并不与细胞接种密度增加
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保持同步；当PK15细胞接种密度为3×10个/mL时，PK15细胞在第4天和第5天后的生
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长速度要明显高于其它接种密度的生长速度，因此，本发明优选采用3×10个/mL的接种量接种PK15细胞。
[0011] 本发明方法优化了波浪生物反应器培养PK15细胞的各工艺参数，有效提升了PK15细胞的培养效率，最终显著提高了猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产效能以及免疫保护效力；免疫保护效力实验证实，本发明方法所制备的猪圆环病毒灭活疫苗对于家畜有确切的免疫保护效力。
具体实施方式
[0012] 下面结合具体实施方案来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0013] 生物材料及仪器
[0014] 1.1、生物反应器：美国Wave Biotech公司WAVE波浪生物反应器。
[0015] 1.2、微载体：Cytodex-1（购自美国通用电气医疗集团生命科学部）。
[0016] 1.3、猪圆环病毒2型病毒毒株：购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5774。
[0017] 实施例1利用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗
[0018] 1.细胞的培养
[0019] 1.1微载体处理：按培养的终体积称取微载体（Cytodex-1）适量，用无Ca2+、2+ 2+ 2+ 2+
Mg -PBS室温浸泡过夜，弃去PBS，再用无Ca 、Mg -PBS洗一次，弃去，最后加入无Ca 、
2+
Mg -PBS高压灭菌（115℃、10psi、15min）。
Mg -PBS室温浸泡过夜，弃去PBS，再用无Ca 、Mg -PBS洗一次，弃去，最后加入无Ca 、
2+
Mg -PBS高压灭菌（115℃、10psi、15min）。
[0020] 1.2细胞复苏培养：用方瓶培养从液氮罐中复苏的PK15细胞，培养条件包括：pH值7.2、温度37℃；培养48-72h，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；该过程中使用的培养基为MEM，血清为胎牛血清，使用量为8%。
[0021] 1.3微载体培养：用EDTA-胰酶细胞消化液制备细胞悬液，细胞计数后按2×105个/mL的密度接种到细胞培养袋中进行培养。培养的方法参数为：微载体浓度为2g/L、DO值50%、温度37℃﹑摆动角度7°、摆动速度16次/min。在培养过程中监控细胞培养袋中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的产生，同时在不同的节点上细胞计数（Cytodex1上的细胞计数先用PBS漂洗2次，经0.1%结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血球计数板计数细胞核），当细胞
6 6
的密度达到1×10-2×10个/mL时开始灌注，依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注
0.7-2个工作体积的速度，以维持细胞的生成。
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的密度达到1×10-2×10个/mL时开始灌注，依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注
0.7-2个工作体积的速度，以维持细胞的生成。
[0022] 2.病毒液的增殖
[0023] 当细胞培养到达第四天时沉降微载体，排出细胞培养袋中液体，加入PBS洗涤细胞，重复洗涤3次，加入病毒维持液并接种猪圆环病毒2型，其中病毒接种剂量为5%、病毒增值的培养基为含1%血清的MEM，pH值7.4，温度36.5℃，培养24h后将细胞维持液弃去，以0.01mol/L的PBS充分洗涤接种病毒的细胞，加入D-氨基葡萄糖孵育30min，弃去D-氨基葡萄糖，将细胞以0.01mol/L、pH为7.4的PBS充分洗涤，加入细胞维持液继续培养细胞。连续培养10天后，收获病毒液，于-20℃冻融两次，得到猪圆环病毒2型病毒液。
[0024] 3.病毒液灭活及乳化制成疫苗
[0025] 收获病毒液用甲醛溶液灭活，甲醛溶液终浓度0.1%，37℃灭活24h。灭活后的猪圆环病毒2型加入常规油性佐剂，搅拌混匀，制得猪圆环病毒2型病毒油乳剂灭活疫苗。
[0026] 实验例1微载体含量的优化实验
[0027] 细胞接种密度与微载体含量对细胞生长的影响密切相关，其中重要的标志是接种时要保证合适的细胞密度与载体的比例关系；为了生产高滴度的病毒，需要细胞密度较高，同时，为了较快和高效的培养细胞，又要求细胞的细胞扩增倍数较高。
[0028] 在每克微载体接种相同PK15细胞数的前提下，考察Cytodex1含量为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L时PK15细胞生长情况，用来确定合适的载体用量。
[0029] 实验结果见表1。从表1可以看出，随着微载体含量的增加，PK15细胞密度会有所增加，但PK15细胞扩增倍数却有所降低。微载体含量为3g/L时，PK15细胞生长较快，培养7
时间为5天时，PK15细胞密度达到了1.68×10g/L，非常显著的高于其它的微载体的细胞密度；此外，当微载体含量高于3g/L时，PK15细胞生长的增加速度不显著。因此，本发明在细胞培养袋中培养PK15细胞时，所加入的微载体的含量优选为3g/L。
时间为5天时，PK15细胞密度达到了1.68×10g/L，非常显著的高于其它的微载体的细胞密度；此外，当微载体含量高于3g/L时，PK15细胞生长的增加速度不显著。因此，本发明在细胞培养袋中培养PK15细胞时，所加入的微载体的含量优选为3g/L。
[0030] 表1不同微载体含量PK15细胞生长情况（单位个/mL）
[0031]
[0032] 实验例2PK15细胞接种密度的筛选实验4 5 5 5 5 5
[0033] 当微载体的用量为3g/L，分别以5×10、1×10、2×10、3×10、4×10、5×10、5
6×10个/mL的接种密度接种PK15细胞，每天取样分析，PK15细胞生长情况如表2所示。
6×10个/mL的接种密度接种PK15细胞，每天取样分析，PK15细胞生长情况如表2所示。
[0034] 表2不同接种密度PK15细胞生长情况（单位个/mL）
[0035]
[0036] 从表2可以看出，当微载体含量相等，不同的接种密度对PK15细胞生长影响较大。以5×104、1×105个/mL接种时，接种密度低接种后5天仍在缓慢生长，没有进入稳定生长期的明显标志；以2×105、3×105、4×105、5×105、6×105个/mL接种时接种密度高，PK15细胞在接种后第2天进入稳定生长期；从表2的数据的可见，随着细胞接种密度的增高，PK15细胞生长速度的增加并不与细胞接种密度增加保持同步；当PK15细胞接种密度为3×105个/mL时，PK15细胞在第4天和第5天后的生长速度要明显高于其它接种密度的生长速度，因此，本发明优选采用3×105个/mL的接种量接种PK15细胞。
[0037] 实验例3摇动条件的优化实验
[0038] 以3g/L的含量加入微载体，以3×105个/mL密度接种PK15细胞，加入细胞培养基培养，摆动角度分别为5°、6°、7°、8°、9°；摆动速度分别为12rpm、14rpm、16rpm、18rpm，每天取样，观察微载体上细胞吸附和生长情况，考察摇动条件对细胞培养的影响。
[0039] 实验结果见表3。从表3可以看出，整个培养过程，摇动条件对细胞的密度影响较大。从实验结果可见，当摇动条件为摆动角度8°、摆动速度14rpm时，在此摇动条件下细胞的生长速度要远远高于其它的摇动条件（差异显著）。因此，本发明的摇动条件优选为摆动角度8°、摆动速度14rpm。
[0040] 表3不同摇动条件下PK15细胞生长情况（单位：个/mL）
[0041]0（天） 1（天） 2（天） 3（天） 4（天） 5（天）
6°、12rpm 3×105 6.2×105 4.16×106 9.52×106 1.17×107 1.77×107
6°、14rpm 3×105 7.8×105 4.61×106 9.82×106 1.23×107 1.82×107
6°、16rpm 3×105 7.3×105 4.48×106 9.71×106 1.09×107 1.79×107
6°、18rpm 3×105 6.8×105 4.39×106 9.62×106 1.14×107 1.68×107
7°、12rpm 3×105 6.3×105 4.21×106 9.67×106 1.19×107 1.81×107
7°、14rpm 3×105 7.92×105 4.58×106 9.79×106 1.22×107 1.92×107
7°、16rpm 3×105 7.6×105 4.36×106 9.68×106 1.24×107 1.89×107
7°、18rpm 3×105 6.5×105 4.27×106 9.62×106 1.12×107 1.71×107
8°、12rpm 3×105 6.9×105 4.44×106 9.75×106 1.16×107 1.84×107
8°、14rpm 3×105 8.7×105 5.23×106 1.17×107 1.92×107 2.36×107
8°、16rpm 3×105 7.8×105 4.51×106 9.81×106 1.26×107 1.87×107
8°、18rpm 3×105 7.3×105 4.30×106 9.59×106 1.17×107 1.78×107
6°、12rpm 3×105 6.2×105 4.16×106 9.52×106 1.17×107 1.77×107
6°、14rpm 3×105 7.8×105 4.61×106 9.82×106 1.23×107 1.82×107
6°、16rpm 3×105 7.3×105 4.48×106 9.71×106 1.09×107 1.79×107
6°、18rpm 3×105 6.8×105 4.39×106 9.62×106 1.14×107 1.68×107
7°、12rpm 3×105 6.3×105 4.21×106 9.67×106 1.19×107 1.81×107
7°、14rpm 3×105 7.92×105 4.58×106 9.79×106 1.22×107 1.92×107
7°、16rpm 3×105 7.6×105 4.36×106 9.68×106 1.24×107 1.89×107
7°、18rpm 3×105 6.5×105 4.27×106 9.62×106 1.12×107 1.71×107
8°、12rpm 3×105 6.9×105 4.44×106 9.75×106 1.16×107 1.84×107
8°、14rpm 3×105 8.7×105 5.23×106 1.17×107 1.92×107 2.36×107
8°、16rpm 3×105 7.8×105 4.51×106 9.81×106 1.26×107 1.87×107
8°、18rpm 3×105 7.3×105 4.30×106 9.59×106 1.17×107 1.78×107
[0042]9°、12rpm 3×105 7.46×105 4.30×106 9.61×106 1.12×107 1.72×107
9°、14rpm 3×105 7.69×105 4.30×106 9.82×106 1.23×107 1.81×107
9°16rpm 3×105 7.51×105 4.30×106 9.78×106 1.15×107 1.69×107
9°、18rpm 3×105 7.58×105 4.30×106 9.69×106 1.06×107 1.57×107
9°、14rpm 3×105 7.69×105 4.30×106 9.82×106 1.23×107 1.81×107
9°16rpm 3×105 7.51×105 4.30×106 9.78×106 1.15×107 1.69×107
9°、18rpm 3×105 7.58×105 4.30×106 9.69×106 1.06×107 1.57×107
[0043] 实验例5疫苗的免疫原性比较实验
[0044] 1、疫苗：（1）供试疫苗：实施例1所制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗（细胞苗）；（2）对照疫苗：采用转瓶制作的猪圆环病毒2型灭活疫苗。
[0045] 2、实验方法
[0046] 选取42日龄健康猪30头，随机分为A、B、C共3组，每组10头，分3栏饲养，每组按1～10的顺序逐头打耳缺编号，观察7d，无异常，实验方法如下：
[0047] 2.1试验前采血和初免试验猪49日龄，3个组同时逐头前腔静脉采血5ml，随即颈部肌肉注射相应疫苗或生理盐水：A组(试验I组)每头免疫用转瓶制作的对照疫苗3ml；B组(试验II组)每头免疫供试疫苗3ml；C组(对照组)每头注射生理盐水3ml。所采血样常温析出血清，按分组对应编号标记，-20℃冷冻保存待检。
[0048] 2.2初免抗体检测采血和二免试验猪70日龄采血，试验组逐头免疫相同种类和剂量的疫苗，对照组仍每头注射生理盐水3ml。所采血样析出血清，编号保存。
[0049] 2.3二免抗体检测采血试验猪91日龄，全部试验猪逐头前腔静脉采血5ml，所采血样析出血清，编号保存。
[0050] 2.4抗体检测和统计分析把所采血清，逐份ELISA检测PCV2抗体，血清抗体OD值依分组编号逐头登记。按统计学方法比较各组方差及OD均值差异显著性。
[0051] 3实验结果
[0052] PCV2抗体的检测结果和统计分析结果见表4和表5。
[0053] 表4各试验组与对照组免疫的不同阶段PCV-2抗体检测结果
[0054]
[0055] 表5PCV2血清抗体检测结果的统计学检验
[0056]