本发明涉及一种隐形热敏脂质体药物转运系统的制备及其在肿瘤治疗药物中的应用，可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大、治疗效果不佳等问题。本发明技术方案是由热敏脂质体负载靶向热敏剂和化疗药物构成，其中，靶向热敏剂和化疗药物的质量比为1:3，其中隐形热敏脂质体是经羧基化碳纳米管的合成、叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸的合成、隐形热敏脂质体的制备或经羧基化碳纳米管的合成、负载化疗药物的碳纳米管-赖氨酸的合成、隐形热敏脂质体的制备而得。本发明物理化学稳定性良好，制备条件简单可行，原料来源丰富，成本低，副作用小，能有效抑制肿瘤细胞的增殖，从而达到肿瘤靶向治疗的作用，是肿瘤靶向治疗中药物载体上的创新。
1.一种隐形热敏脂质体的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
（1）羧基化碳纳米管的合成：取95～110mg碳纳米管，放入250mL烧瓶中，加入120mL的混酸，11～13mL 质量浓度为30%的过氧化氢溶液，于超声波清洗器超声1h后，加入1L超纯水稀释，用0.22μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，用超纯水冲洗至pH为中性，放入烘箱中
80℃恒温干燥，得羧基化的碳纳米管；所述混酸为浓硫酸与浓硝酸以体积比3︰1所组成的混合酸；
（2）叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸的合成：取羧基化的碳纳米管45～55mg，加入25mL
0.1～0.3M的赖氨酸溶液，再加入9～11mg叶酸，45～55mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，9～11mg N-羟基琥珀酰亚胺，置于烧瓶中，超声分散2h后，在冰浴下，以100r/min搅拌24h使其充分反应，反应结束后于透析袋中透析48h，除去未反应的
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、叶酸和赖氨酸，在
60℃下真空干燥24h，得叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸；
（3) 隐形热敏脂质体的制备：称取45～55mg二棕榈酰磷脂酰胆碱，1~3mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000及18～22mg的胆固醇，置于100mL茄形烧瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超声乳化40min，形成稳定的O/W型乳剂，在45℃减压旋转下除去乙醚，200W探超2min，于透析袋中透析48h后，得隐形热敏脂质体；所述的PBS溶液为10mg叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸和6mg盐酸阿霉素溶于5mL PBS、pH7.4形成的溶液。
2.根据权利要求1所述的隐形热敏脂质体的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
（1）羧基化碳纳米管的合成：取100mg碳纳米管，放入250mL烧瓶中，加入120mL的混酸，12mL 质量浓度为30%的过氧化氢溶液，于超声波清洗器超声1h后，加入1L超纯水稀释，用0.22μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，用超纯水冲洗至pH为中性，放入烘箱中80℃恒温干燥，得羧基化的碳纳米管；
（2）叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸的合成：取羧基化的碳纳米管50mg，加入25mL 0.2M的赖氨酸溶液，再加入10mg叶酸，50mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，10mg N-羟基琥珀酰亚胺，置于烧瓶中，超声分散2h后，在冰浴下，以100r/min搅拌24h使其充分反应，反应结束后于透析袋中透析48h，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、叶酸和赖氨酸，在60℃下真空干燥24h，得叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸；
（3) 隐形热敏脂质体的制备：取50mg二棕榈酰磷脂酰胆碱，2mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000及20mg的胆固醇，置于100mL茄形烧瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超声乳化40min，形成稳定的O/W型乳剂，在45℃减压旋转下除去乙醚，
200W探超2min，于透析袋中透析48h后，得隐形热敏脂质体。
3.根据权利要求1所述的隐形热敏脂质体的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
（1）羧基化碳纳米管的合成：取105mg碳纳米管，放入250mL烧瓶中，加入120mL的混酸，13mL 质量浓度为30%的过氧化氢溶液，于超声波清洗器超声1h后，加入1L超纯水稀释，用0.22μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，用超纯水冲洗至pH为中性，放入烘箱中80℃恒温干燥，得羧基化的碳纳米管；
（2）叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸的合成：称取羧基化的碳纳米管53mg，加入25mL
0.2M的赖氨酸溶液，再加入11mg叶酸，53mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，11mg N-羟基琥珀酰亚胺，置于烧瓶中，超声分散2h后，在冰浴下，以100r/min搅拌
24h使其充分反应，反应结束后于透析袋中透析48h，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、叶酸和赖氨酸，在60℃下真空干燥24h，得叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸；
（3) 隐形热敏脂质体的制备：称取53mg二棕榈酰磷脂酰胆碱，3mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000及22mg的胆固醇，置于100mL茄形烧瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超声乳化40min，形成稳定的O/W型乳剂，在45℃减压旋转下除去乙醚，200W探超2min，于透析袋中透析48h后，得隐形热敏脂质体。
4.一种隐形热敏脂质体的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
（1）羧基化碳纳米管的合成：取95～110mg碳纳米管，放入250mL烧瓶中，加入120mL混酸，11～13mL 质量浓度为30%的过氧化氢溶液，于超声波清洗器超声1h后，加入1L超纯水稀释，用0.22μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，用超纯水冲洗至pH为中性，放入烘箱中
80℃恒温干燥，得羧基化碳纳米管；所述混酸为浓硫酸与浓硝酸以体积比3︰1所组成的混合酸；
（2）负载化疗药物的碳纳米管-赖氨酸的合成：称取羧基化碳纳米管45～55mg，加入
25mL 0.1～0.3M赖氨酸溶液，45～55mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和9～11mg N-羟基琥珀酰亚胺，置于烧瓶中，超声分散2h后，在冰浴下，以100r/min搅拌24h，使其充分反应，反应结束后于透析袋中透析48h，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和赖氨酸，在60℃下真空干燥24h，得碳纳米管-赖氨酸；再称取9～11mg碳纳米管-赖氨酸，加入10mL超纯水，超声至全溶，再加入18～22mg化疗药物，超声4h，于透析袋中透析24h，除去游离的药物，得负载药物的碳纳米管-赖氨酸；
（3) 隐形热敏脂质体的制备：取45～55mg 二棕榈酰磷脂酰胆碱, 1~3mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000及18～22mg胆固醇，置于100mL茄形烧瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超声乳化40min，形成稳定的O/W型乳剂，在45℃减压旋转下除去乙醚，200W探超2min，于透析袋中透析48h，得隐形热敏脂质体；所述PBS溶液为10mg负载化疗药物的碳纳米管-赖氨酸和6mg盐酸阿霉素溶于5mL PBS、pH7.4形成的溶液。
5.根据权利要求4所述的隐形热敏脂质体的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
（1）羧基化碳纳米管的合成：取100mg碳纳米管，放入250mL烧瓶中，加入120mL混酸，
12mL 质量浓度为30%的过氧化氢溶液，于超声波清洗器超声1h后，加入1L超纯水稀释，用
0.22μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，用超纯水冲洗至pH为中性，放入烘箱中80℃恒温干燥，得羧基化碳纳米管；
（2）负载盐酸阿霉素的碳纳米管-赖氨酸的合成：取羧基化碳纳米管50mg，加入25mL
0.2M赖氨酸溶液，50mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10mg N-羟基琥珀酰亚胺，置于烧瓶中，超声分散2h后，在冰浴下，以100r/min搅拌24h，使其充分反应，反应结束后于透析袋中透析48h，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和赖氨酸，在60℃下真空干燥24h，得碳纳米管-赖氨酸；再取
10mg碳纳米管-赖氨酸，加入10mL超纯水，超声至全溶，再加入20mg盐酸阿霉素，超声4h，于透析袋中透析24h，除去游离的药物，得负载盐酸阿霉素的碳纳米管-赖氨酸；
（3) 隐形热敏脂质体的制备：称取50mg二棕榈酰磷脂酰胆碱，2mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000及20mg胆固醇，置于100mL茄形烧瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超声乳化40min，形成稳定的O/W型乳剂，在45℃减压旋转下除去乙醚，
200W探超2min，于透析袋中透析48h，得隐形热敏脂质体；所述PBS溶液为10mg负载盐酸阿霉素的碳纳米管-赖氨酸和6mg盐酸阿霉素溶于5mL PBS、pH7.4形成的溶液。
6.根据权利要求4所述的隐形热敏脂质体的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
（1）羧基化碳纳米管的合成：取105mg碳纳米管，放入250mL圆底烧瓶中，加入120mL混酸，13mL质量浓度为30%的过氧化氢溶液，于超声波清洗器超声1h后，加入1L超纯水稀释，用0.22μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，用超纯水冲洗至pH为中性，放入烘箱中80℃恒温干燥，得羧基化碳纳米管；
（2）负载多西紫杉醇的碳纳米管-赖氨酸的合成：称取羧基化碳纳米管53mg，加入25mL
0.15M赖氨酸溶液，53mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和11mg N-羟基琥珀酰亚胺，置于烧瓶中，超声分散2h后，在冰浴下，以100r/min搅拌24h，使其充分反应，反应结束后于透析袋中透析48h，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和赖氨酸，在60℃下真空干燥24h，得碳纳米管-赖氨酸；
再称取10mg碳纳米管-赖氨酸，加入10mL超纯水，超声至全溶，再加入22mg多西紫杉醇，超声4h，于透析袋中透析24h，除去游离的药物，得负载多西紫杉醇的碳纳米管-赖氨酸；
（3）隐形热敏脂质体的制备：称取53mg 二棕榈酰磷脂酰胆碱，3mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000及22mg胆固醇，置于100mL茄形烧瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超声乳化40min，形成稳定的O/W型乳剂，在45℃减压旋转下除去乙醚，
200W探超2min，于透析袋中透析48h，得隐形热敏脂质体；所述PBS溶液为10mg负载多西紫杉醇的碳纳米管-赖氨酸和6mg盐酸阿霉素溶于5mL PBS、pH7.4形成的溶液。
7.权利要求1或权利要求2-6任一项所述方法制备的隐形热敏脂质体作为药物转运系统在制备治疗肿瘤药物中的应用。
一种隐形热敏脂质体的制备及其药物转运系统在肿瘤治疗
药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及药物领域，特别是一种隐形热敏脂质体的制备及其药物转运系统在肿瘤治疗药物中的应用。
背景技术
[0002] 隐形热敏脂质体是一种物理化学和主动靶向的药物转运载体。在正常体温下，亲水性药物很难透过脂质体膜而扩散出来，而当脂质体随血液循环经过被加热的靶器官时，局部的高温可促使药物在靶部位释放并形成较高的药物浓度；隐形热敏脂质体具有良好的载药性、靶向性以及生物相容性而成为生物医药领域中的研究热点，目前已报道热敏脂质体局部加热方法有水浴法、微波法、射频法等。
[0003] 单壁或多壁碳纳米管，石墨烯，纳米金具有巨大的比表面积(～2600m2/g)、较高的近红外产热能力、独特的跨膜能力以及大离域π键等特性，已广泛应用于生物医药领域。碳纳米管可以有效携带蛋白质、抗体、多肽、药物和核酸等生物活性物质进入细胞，从而成为人们关注的载体。碳纳米管对700～1100nm范围的近红外光具有高吸收特性，同时生物系统对此范围的近红外光具有高度透过性，因此可利用碳纳米管的光热转换特性对肿瘤进行激光热疗。碳纳米管是药物转运载体，同时也是发挥热疗效应的主体，可作为化疗药物增敏剂和靶向热敏剂。但碳纳米管不溶于水和有机溶剂，且在溶液中易聚集成束，难以分散，严重影响其应用。
[0004] DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)，C40H80NO8P,分子量734.04，相变温度41-42℃，可作为热敏脂质体制备的主要材料，当温度达到其相变温度时就可引起热敏脂质体迅速释放内含药物，实现靶向治疗；DSPE-PEG2000（二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000）具有良好的亲水性和柔韧性，可延长药物载体在体内的循环时间。
[0005] 目前，通过隐形热敏脂质体负载靶向热敏剂（如碳纳米管）和化疗药物形成药物转运系统，特别是在肿瘤治疗药物中的应用尚未见有报道。
发明内容
[0006] 针对上述情况，克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种隐形热敏脂质体药物转运系统的制备方法及其在肿瘤治疗药物中的应用，可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大、治疗效果不佳等问题。
[0007] 本发明解决的技术方案是，由隐形热敏脂质体负载靶向热敏剂和化疗药物构成，其中，靶向热敏剂和化疗药物的质量比为1:3，所述的靶向热敏剂为单壁碳纳米管及其衍生物、多壁碳纳米管及其衍生物、石墨烯及其衍生物、纳米金及其衍生物、纳米银及其衍生物、有机聚合物的一种；所述的化疗药物为盐酸阿霉素、盐酸表阿霉素、柔红霉素、盐酸米托蒽醌、多西紫杉醇、紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、长春瑞滨、洛莫司汀、卡莫司汀、地西他宾、甲氨蝶呤、羟基喜树碱、小核酸类寡义反核苷酸和小干扰RNA的一种或两种以上的组合物。
[0008] 所述的隐形热敏脂质体的制备方法，由以下步骤实现：
[0009] （1）羧基化碳纳米管的合成：取95～110mg碳纳米管，放入250mL烧瓶中，加入120mL的混酸，11～13mL质量浓度30%的过氧化氢溶液，于超声波清洗器超声1h后，加入
1L超纯水稀释，用0.22μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，用超纯水冲洗至pH为中性，放入烘箱中80℃恒温干燥，得羧基化的碳纳米管(CNTs-COOH)；所述混酸为浓硫酸与浓硝酸以体积比3︰1所组成的混合酸；
[0010] （2）叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸的合成：取羧基化的碳纳米管45～55mg，加入25mL0.1～0.3M的赖氨酸溶液，再加入叶酸9～11mg，45～55mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，9～11mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），置于烧瓶中，超声分散2h后，在冰浴下，以100r/min搅拌24h使其充分反应，反应结束后于透析袋中透析
48h，除去未反应的EDC·HCl、NHS、叶酸和赖氨酸，在60℃下真空干燥24h，得叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸（FA-Lys/CNTs）；
[0011] （3)隐形热敏脂质体的制备：称取45～55mg二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC），1～3mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）及18～22mg的胆固醇，置于100mL茄形烧瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超声乳化40min，形成稳定的O/W型乳剂，在45℃减压旋转下除去乙醚，探超（200W，2min），于透析袋中透析48h后，得隐形热敏脂质体；所述的PBS溶液为10mg叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸和6mg盐酸阿霉素溶于5mL PBS(pH7.4)形成的溶液。
[0012] 也可由以下步骤实现：
[0013] （1）羧基化碳纳米管的合成：取95～110mg碳纳米管，放入250mL烧瓶中，加入120mL混酸，11～13mL质量浓度30%过氧化氢溶液，于超声波清洗器超声1h后，加入1L超纯水稀释，用0.22μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，用超纯水冲洗至pH为中性，放入烘箱中
80℃恒温干燥，得羧基化碳纳米管(CNTs-COOH)；所述混酸为浓硫酸与浓硝酸以体积比3︰
1所组成的混合酸；
[0014] （2）负载化疗药物的碳纳米管-赖氨酸的合成：称取羧基化碳纳米管45～55mg，加入25mL0.1～0.3M赖氨酸溶液，45～55mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和9～11mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），置于烧瓶中，超声分散2h后，在冰浴下，以100r/min搅拌24h，使其充分反应，反应结束后于透析袋中透析48h，除去未反应的EDC·HCl、NHS和赖氨酸，在60℃下真空干燥24h，得碳纳米管-赖氨酸（Lys/CNTs）；再称取9～11mg碳纳米管-赖氨酸，加入10mL超纯水，超声至全溶，再加入18～22mg化疗药物，超声4h，于透析袋中透析24h，除去游离的药物，得负载药物的碳纳米管-赖氨酸；
[0015] （3)隐形热敏脂质体的制备：取45～55mg的二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC），1～3mg的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）及18～22mg的胆固醇，置于100mL茄形烧瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超声乳化40min，形成稳定的O/W型乳剂，在45℃减压旋转下除去乙醚，探超（200W，2min），于透析袋中透析48h，得隐形热敏脂质体；所述PBS溶液为10mg负载化疗药物的碳纳米管-赖氨酸和6mg盐酸阿霉素溶于5mL PBS(pH7.4)形成的溶液。
[0016] 所述隐形热敏脂质体药物转运系统，可以用于静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射、透皮给药、体内植入。
[0017] 本发明的隐形热敏脂质体负载靶向热敏剂（如碳纳米管）和化疗药物，靶向热敏剂能够负载难溶性化疗药物，具有强光热转换特性和产生活性氧能力，还具有肿瘤靶向性的特点，在肿瘤部位进行激光照射，利用热敏剂在激光照射下产热导致热敏材料的热敏感性使药物转运系统定位释放药物，从而达到肿瘤靶向治疗的作用；本发明体物理化学稳定性良好，制备条件简单可行，原料来源丰富，成本低，副作用小，能有效抑制肿瘤细胞的增殖，是肿瘤靶向治疗中药物载体上的创新。
具体实施方式
[0018] 以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0019] 实施例1
[0020] 本发明制备方法在具体实施中，可由以下步骤实现：
[0021] （1）羧基化碳纳米管的合成：称取100mg碳纳米管，放入250mL圆底烧瓶中，加入120mL的混酸，12mL质量浓度30%的过氧化氢溶液，于超声波清洗器超声1h后，加入1L超纯水稀释，用0.22μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，用超纯水冲洗至pH为中性，放入烘箱中80℃恒温干燥，得羧基化的碳纳米管(CNTs-COOH)；所述混酸为浓硫酸与浓硝酸以体积比3︰1所组成的混合酸；
[0022] （2）叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸的合成：称取羧基化的碳纳米管50mg，加入25mL0.2M的赖氨酸溶液，再加入叶酸10mg，50mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，10mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），置于烧瓶中，超声分散2h后，在冰浴下，以100r/min搅拌24h使其充分反应，反应结束后于透析袋中透析48h，除去未反应的EDC·HCl、NHS、叶酸和赖氨酸，在60℃下真空干燥24h，得叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸（FA-Lys/CNTs）；
[0023] （3)隐形热敏脂质体的制备：称取50mg二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC），2mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）及20mg的胆固醇，置于100mL茄形烧瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超声乳化40min，形成稳定的O/W型乳剂，在45℃减压旋转下除去乙醚，探超（200W，2min），于透析袋中透析48h后，得隐形热敏脂质体；所述的PBS溶液为10mg叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸和6mg盐酸阿霉素溶于5mLPBS(pH7.4)形成的溶液。
[0024] 实施例2
[0025] 本发明制备方法在具体实施中，也可由以下步骤实现：
[0026] （1）羧基化碳纳米管的合成：称取105mg碳纳米管，放入250mL圆底烧瓶中，加入120mL的混酸，13mL质量浓度30%的过氧化氢溶液，于超声波清洗器超声1h后，加入1L超纯水稀释，用0.22μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，用超纯水冲洗至pH为中性，放入烘箱中80℃恒温干燥，得羧基化的碳纳米管(CNTs-COOH)；
[0027] （2）叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸的合成：称取羧基化的碳纳米管53mg，加入25mL0.2M的赖氨酸溶液，再加入叶酸11mg，53mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，11mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），置于烧瓶中，超声分散2h后，在冰浴下，以100r/min搅拌24h使其充分反应，反应结束后于透析袋中透析48h，除去未反应的EDC·HCl、NHS、叶酸和赖氨酸，在60℃下真空干燥24h，得叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸（FA-Lys/CNTs）；
[0028] （3)隐形热敏脂质体的制备：称取53mg二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC），3mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）及22mg的胆固醇，置于100mL茄形烧瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超声乳化40min，形成稳定的O/W型乳剂，在45℃减压旋转下除去乙醚，探超（200W，2min），于透析袋中透析48h后，得隐形热敏脂质体；所述的PBS溶液为10mg叶酸靶向的碳纳米管-赖氨酸和6mg盐酸阿霉素溶于5mLPBS(pH7.4)形成的溶液。
[0029] 实施例3
[0030] 本发明制备方法在具体实施中，可由以下步骤实现：
[0031] （1）羧基化碳纳米管的合成：称取100mg碳纳米管，放入250mL圆底烧瓶中，加入120mL混酸，12mL质量浓度30%的过氧化氢溶液，于超声波清洗器超声1h后，加入1L超纯水稀释，用0.22μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，用超纯水冲洗至pH为中性，放入烘箱中80℃恒温干燥，得羧基化碳纳米管(CNTs-COOH)；
[0032] （2）负载盐酸阿霉素的碳纳米管-赖氨酸的合成：称取羧基化碳纳米管50mg，加入25mL0.2M赖氨酸溶液，50mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），置于烧瓶中，超声分散2h后，在冰浴下，以100r/min搅拌24h，使其充分反应,反应结束后于透析袋中透析48h，除去未反应的EDC·HCl、NHS和赖氨酸，在60℃下真空干燥24h，得碳纳米管-赖氨酸（Lys/CNTs）；再称取10mg碳纳米管-赖氨酸，加入10mL超纯水，超声至全溶，再加入20mg盐酸阿霉素，超声4h，于透析袋中透析
24h，除去游离的药物，得负载盐酸阿霉素的碳纳米管-赖氨酸（Lys/CNTs-DOX）；
[0033] （3）隐形热敏脂质体的制备：称取50mg的二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC），2mg的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）及20mg的胆固醇，置于100mL茄形烧瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超声乳化40min，形成稳定的O/W型乳剂，在45℃减压旋转下除去乙醚，探超（200W，2min），于透析袋中透析48h，得隐形热敏脂质体；所述PBS溶液为10mg负载盐酸阿霉素的碳纳米管-赖氨酸和6mg盐酸阿霉素溶于5mL PBS(pH7.4)形成的溶液。
[0034] 实施例4
[0035] 本发明制备方法在具体实施中，也可由以下步骤实现：
[0036] （1）羧基化碳纳米管的合成：称取105mg碳纳米管，放入250mL圆底烧瓶中，加入120mL混酸，13mL质量浓度30%的过氧化氢溶液，于超声波清洗器超声1h后，加入1L超纯水稀释，用0.22μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，用超纯水冲洗至pH为中性，放入烘箱中80℃恒温干燥，得羧基化碳纳米管(CNTs-COOH)；
[0037] （2）负载多西紫杉醇的碳纳米管-赖氨酸的合成：称取羧基化碳纳米管53mg，加入25mL0.15M赖氨酸溶液，53mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和11mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），置于烧瓶中，超声分散2h后，在冰浴下，以100r/min搅拌24h，使其充分反应,反应结束后于透析袋中透析48h,除去未反应的EDC·HCl、NHS和赖氨酸，在60℃下真空干燥24h，得碳纳米管-赖氨酸（Lys/CNTs）；再称取10mg碳纳米管-赖氨酸，加入10mL超纯水，超声至全溶，再加入22mg多西紫杉醇，超声4h，于透析袋中透析
24h，除去游离的药物，得负载多西紫杉醇的碳纳米管-赖氨酸（Lys/CNTs-DOC）；
[0038] （3)隐形热敏脂质体的制备：称取53mg的DPPC，2mg的DSPE-PEG2000及22mg的胆固醇，置于100mL茄形烧瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超声乳化40min，形成稳定的O/W型乳剂，在45℃减压旋转下除去乙醚，探超（200W，2min），于透析袋中透析48h，得隐形热敏脂质体；所述PBS溶液为10mg负载多西紫杉醇的碳纳米管-赖氨酸和6mg盐酸阿霉素溶于5mL PBS(pH7.4)形成的溶液。
[0039] 本发明的隐形热敏脂质体的制备方法及其药物转运系统在肿瘤治疗药物中的应用分为体外和体内两部分：
[0040] （1）体内：将本发明的隐形热敏脂质体药物转运系统加入到癌细胞中进行培养，给药3h后用780～1100nm波长的宽波长光源或者808nm激光光照，光照时间1～5min，继续培养24h，测定癌细胞的存活率。
[0041] 上述癌细胞为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。
[0042] （2)体外：将本发明的隐形热敏脂质体药物转运系统静脉注射到荷瘤小鼠体内，给药3h后用780～1100nm波长的宽波长光源或者808nm激光光照，光照时间为1～5min，测量荷瘤小鼠的肿瘤体积大小。
[0043] 上述荷瘤小鼠为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。
[0044] 本发明新型靶向热敏增敏剂介导的隐形热敏脂质体作为热敏剂可制成多种药物剂型，如注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的制剂可加入各种制剂添加剂，如生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等。给药方式可为静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射、透皮给药、体内植入方式等。
[0045] 相关试验资料如下：
[0046] 一、使用光照射本发明隐形热敏脂质体药物转运系统对肿瘤细胞生长活性的测定。
[0047] 通过光照射药物转运系统在体外抗肿瘤活性实验：将MCF-7乳腺癌细胞(由上海细胞库提供)用作待考察的癌细胞。将MCF-7细胞培养在含胎牛血清(FBS)10%，青链霉素混合液1%的RPMI1640培养基中，培养箱条件为37℃、5%CO2，每2～3天传代一次。收集对3
数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200μl，铺板使待测细胞调密度至6×10个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5%CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度（12.5、25、50、100μg/ml）的实施例1中的隐形热敏脂质体，设置复孔为4～6个。光照组放置在808nm近红外光2W中2min，保持光照过程中温度在37℃，光照结束后用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24h，对于无光照组而言，则直接用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24h，终止培养，吸出含药培养基，每孔用150μl PBS洗
2遍，加入预冷的10%TCA200μl，4℃放置1h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100μl的SRB溶液，静置放置10min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150μl10mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在808nm处测定每孔的OD值。存活率的计算公式：存活率=实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。
[0048] 实验证明，当用光照射2min，本发明药物转运系统的加入直接影响MCF-7细胞的增殖。二、光照射时，本发明隐形热敏脂质体药物转运系统体内抗肿瘤活性测定。
[0049] 取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成6
浓度为2×10 个/ml的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7d后，取其
3
中36只肿瘤体积≥100mm 昆明小鼠，随机分为6组，每组6只。具体分组如下：(1)对照组(生理盐水组)；(2)生理盐水激光组；(3)药物溶液组；(4)药物溶液激光组；(5)制剂组；(6)制剂激光组。6组均采用静脉给药的方式，其中光照组使用的光源为808nm近红外光源，功率为2W，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为2min。每2d给药一次，每次注射生理盐水或者药物溶液或者1mg/ml的制剂溶液200μl，共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积 计算肿瘤体积。
[0050] 实验证明，在光照射下给药本发明的隐形热敏脂质体，可以明显抑制小鼠肿瘤体积的增加。
[0051] 三、本发明的隐形热敏脂质体药物转运系统载药量的测定。
[0052] 取本发明的盐酸阿霉素隐形热敏脂质体给药系统，通过加入40倍甲醇提取给药系统中包封的盐酸阿霉素，紫外分光光度计测定载药量为1.85mg/mL，表明本发明的盐酸阿霉素隐形热敏脂质体可以作为抗肿瘤药物的载体。
[0053] 四、本发明的盐酸阿霉素隐形热敏脂质体给药系统的粒子大小和表面带电量的确定。
[0054] 本发明中的盐酸阿霉素隐形热敏脂质体给药系统的粒子大小和表面带电量的确定，使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行测定，折射率设置为1.590，吸收系数设置为0.010，温度设置为25℃，测量模式设置为自动，以Z平均统计值作为测定结果。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。介电常数设置为
79，黏度系数设置为0.8872，温度设置为25℃，测量模式设置为自动。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。测得的结果是粒径为100～
200nm，电位是-40mV。
[0055] 五、本发明中的盐酸阿霉素隐形热敏脂质体给药系统的体外抗肿瘤活性。
[0056] 本发明中的盐酸阿霉素隐形热敏脂质体给药系统的体外抗肿瘤活性，将MCF-7乳腺癌细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。将MCF-7细胞培养在含胎牛血清(FBS)10%，青链霉素混合液1%的RPMI1640培养基中培养箱条件为37℃、5%CO2，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200μl，铺板使待测细胞3
调密度至6×10 个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5%CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度（0、0.5、1、2、4、6、8μg/ml）的实施例1中的盐酸阿霉素隐形热敏脂质体，不加入实施例1中的盐酸阿霉素隐形热敏脂质体为对照组，设置复孔为4～6个。光照组放置在808nm近红外光2W中2min，保持光照过程中温度在37℃，光照结束后用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24h，对于不光照组而言，则直接用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24h，终止培养，吸出含药培养基，每孔用150μl PBS洗2遍，加入预冷的10%TCA200μl，4℃放置1h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100μl的SRB溶液，静置放置10min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150μl10mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在515nm处测定每孔的OD值。抑制率的计算公式：抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。
[0057] 实验证明，本发明的盐酸阿霉素隐形热敏脂质体作为药物载体时能装载药物进入肿瘤细胞内部，更好地发挥抗肿瘤药物的疗效，而且结合光照后，能够更明显抑制肿瘤细胞的增殖。六、本发明中的盐酸阿霉素隐形热敏脂质体给药系统的体内抗肿瘤活性。
[0058] 本发明中的盐酸阿霉素隐形热敏脂质体给药系统的体内抗肿瘤活性，取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3ml，小鼠喂6
养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×10 个/ml的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7d后，取其中24只肿瘤体积
3
≥100mm 昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下：(1)对照组(生理盐水组)；
(2)盐酸阿霉素注射液组；(3)隐形热敏脂质体组；(4)隐形热敏脂质体激光组。盐酸阿霉素注射液组、盐酸阿霉素隐形热敏脂质体组和盐酸阿霉素隐形热敏脂质体光照组的盐酸阿霉素给药剂量相等，均为10.125mg/kg。4组均采用静脉给药的方式，其中光照组使用的光源为808nm近红外光源，功率为2W，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为2min。每
2d给药一次，共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积 计算肿瘤体积。
[0059] 当给药予本发明的盐酸阿霉素隐形热敏脂质体后，小鼠肿瘤体积的增加比盐酸阿霉素注射液得到明显的抑制，结合激光照射时，小鼠肿瘤体积的增加得到更加明显的抑制。
[0060] 同时，还采用了其他光源以及抗肿瘤药物做了类似的实验，均取得了相同和相类似的结果，本发明分组科学，方法稳定可靠。
[0061] 有益技术效果:
[0062] （1）本发明隐形热敏脂质体不会对碳纳米管本身的特性进行破坏，其水分散性强，对生物体的毒性很低，物理以及化学稳定性良好，质量好，制备条件简单可行，原料来源丰富，成本低。
[0063] （2）本发明隐形热敏脂质体可以作为肿瘤热敏治疗的一种良好的热敏剂，实验表明无论是体外还是体内，结合光照的情况下均可以明显抑制肿瘤细胞以及组织的发生和发展；而在无光照的情况下，本发明对正常细胞以及组织毒副作用很小，可以根据光的聚焦等手段来选择性的杀伤肿瘤组织和细胞。
[0064] （3）本发明隐形热敏脂质体可以作为一种良好的抗肿瘤药物的载体，具有毒性极
