碳纳米管载抗病毒药物复合物、制备方法及其在水产养殖无病毒携带苗生产中的应用

摘要

本发明公开了一种碳纳米管载抗病毒药物复合物、制备方法及其在水产养殖无病毒携带苗生产中的应用，以单壁碳纳米管载吗啉胍的杀病毒制剂为制备实例，并以草鱼呼肠孤病毒为测试模型，在草鱼水花鱼苗进行无病毒携带杀灭试验，能彻底杀灭所感染的病毒，使用该方法在水产种苗生产中，可阻断父母通过垂直传播给子代的病毒。生产成本低，使用方法简单，能在鱼、虾、蟹、贝类等水产动物无特定病原病毒携带苗种生产进行推广应用。

权利要求

1.一种碳纳米管载抗病毒药物复合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将单壁碳纳米管进行酸化处理后，再与牛血清白蛋白连接得单壁碳纳米管载蛋白复合物；对吗啉胍进行羧基化修饰得吗啉胍活性酯；

2)利用单壁碳纳米管载蛋白复合物和吗啉胍活性酯制备单壁碳纳米管载吗啉胍复合物。

2.根据权利要求1所述一种碳纳米管载抗病毒药物复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤1)的具体步骤为：

将单壁碳纳米管加入到硫酸和硝酸组成的混和酸中后于65-75℃水浴中超声处理

2-4h；然后用去离子水洗涤，然后用硝酸回流24-48h，回流后用超纯水洗涤，然后离心、真空干燥至恒重，得到酸化的单壁碳纳米管；

将酸化的单壁碳纳米管加入到2-(N-吗非啉)乙磺酸的水溶液中超声处理0.5-2h得混合物，向混合物中再加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和N-羰基琥珀酸亚胺，然后超声处理2-4h、离心，将离心得到的沉淀加入PBS缓冲液中，再向PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，然后超声处理2-4h、室温搅拌48-60h，搅拌后在纯水中透析3-4d，然后离心，离心得到的沉淀即为单壁碳纳米管载蛋白复合物；

将由吗啉胍制备的琥珀酰吗啉胍溶解于N，N-二甲基甲酰铵中得混合物A，然后向混合物A中加入N-羟基琥珀酰胺和环二己基碳二亚胺，或者向混合物A中加入N-羟基琥珀酰胺和异丙基碳二亚胺，然后室温避光搅拌2-6h，搅拌后过滤除去沉淀，向过滤得到的滤液中加入乙醚，然后将析出的固体再次溶解于N，N-二甲基甲酰胺中得混合物B，向混合物B中再加入乙醚，收集析出的沉淀，即为琥珀酰吗啉胍活性酯。

3.根据权利要求2所述一种碳纳米管载抗病毒药物复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤2)的具体步骤为：

用硼酸缓冲液将单壁碳纳米管载蛋白复合物配制成溶液A，然后将琥珀酰吗啉胍活性酯的N，N-二甲基甲酰胺溶液滴加到溶液A中，然后室温避光搅拌3-5h，搅拌后抽滤除去液体，然后置于真空干燥箱中于35-45℃干燥即得单壁碳纳米管载吗啉胍复合物。

4.一种如权利要求1、2或3所述的制备方法制备的碳纳米管载抗病毒药物复合物在制备水产动物苗种抗病毒药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述碳纳米管载抗病毒药物复合物在生产中直接用水稀释并搅拌混合均匀，然后泼洒于刚孵化出来仔鱼、虾苗、蟹苗或贝类的幼苗池中。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述碳纳米管载抗病毒药物复合物为单壁碳纳米管载吗啉胍复合物，单壁碳纳米管载吗啉胍复合物中吗啉胍的质量分数为

10-40％，幼苗池内单壁碳纳米管载吗啉胍复合物的使用量按吗啉胍计算为10.0-20.0mg/L。

说明书

碳纳米管载抗病毒药物复合物、制备方法及其在水产养殖

无病毒携带苗生产中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及材料科学和生物科学领域，特别涉水产养殖中生产鱼、虾、蟹、贝类等无病毒携带苗种领域。

背景技术

[0002] 目前，我国水产养殖每年因病害造成的直接经济损失达150多亿元。而病毒性疾病是鱼、虾、蟹、贝类等水产动物防治最难、危害最为严重的病害，其最大特点是：发病快，一旦爆发，药物难以控制；往往是毁灭性死亡。病毒性疾病防治的主要瓶颈有两点：一是病毒的不断变异加大了防治难度；二是由于宿主细胞、细胞器的膜屏障作用致使药物进入细胞内的剂量受到限制，往往达不到完全抑制或杀灭病毒的药物浓度。水产动物病毒性疾病传播的途径分为垂直传播和水平传播两种方式，在渔业生产上，父母亲本通过苗种进行垂直传播使得子代携带病毒为特点，一旦水环境恶化、气温变化导致水产动物免疫功能下降，是导致病毒病爆发性传播、大规模死亡最主要的因素。

[0003] 碳纳米管具有独特的物理和化学性能，已经在电子、光学、催化、储能、增强材料和电子显微镜成像等领域引起广泛关注并取得阶段性的研究成果。最近，碳纳米管在生物医药领域的研究尤其引人注目，已成为纳米医药领域的一个新方向和研究热点。碳纳米管根据管壁的层数可以分为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管。碳纳米管在生物环境中具有比球形粒子更优异的性能，特别适合作为药物载体：首先，碳纳米管可以轻易的穿过细胞膜出入细胞，具有很好的跨膜性；其次，碳纳米管具有超高的比表面积，可以通过物理作用大量负载药物，还可通过化学改性连接特定分子。

[0004] 在医药领域，主要集中在碳纳米管载抗肿瘤药物研究方面。碳纳米管载药在细胞水平研究，最多的文献报道是碳纳米管载阿霉素（DOX）显著提高了抑制肿瘤细胞的活性[参考文献1-2]；EGF靶向诱导单壁碳纳米管—顺铂杀灭肿瘤细胞等[参考文献3]。碳纳米管载药在动物模型水平的研究，主要是利用小鼠模型，通过碳纳米管载抗肿瘤药如阿霉素（Doxorubicin)、吉他西滨(Gemcitabine)、紫杉醇等，大大降低了药物有效使用剂量，显著提高了抗肿瘤效果[参考文献4-7]。

[0005] 但是，在水产养殖领域，碳纳米管载药的应用尚属空白。

[0006] 碳纳米管载药已知的用途有：

[0007] 1.碳纳米管作为载体在抗癌药物转运中的应用，公开号：CN101209349，申请人：中国科学院大连化学物理研究所，邹汉法等。主要功能是合成的氧化碳纳米管可以键合上不同的抗癌药物转运中的应用。

[0008] 2.功能化碳纳米管抗癌药物载体的制备和应用，公开号：CN101618221，上海师范大学，贾能勤等，主要用途是功能化碳纳米管喜树碱复合物在体外Hela宫颈癌细胞治疗中的应用。

[0009] 3.碳纳米管－壳聚糖－藻蓝蛋白复合物在制备抗肿瘤药物中的应用，公开号：CN102284063A，华南理工大学，张学武等，主要作用是在肿瘤细胞光动力治疗和光热治疗中具有广阔的前景。

[0010] 4.一种反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体，公开号：CN101015696，上海师范大学，贾能勤等，主要应用于肿瘤或基因疾病的治疗。

[0011] 5.单壁碳纳米管转载抗肿瘤药物技术及其应用，公开（公告）号：CN102370988A，华东理工大学，马兴元等，主要用途是将功能化的单壁碳纳米管与目标分子连接，所述目标分子是指生物大分子抗肿瘤药物，包括核酸药物或者蛋白药物。

[0012] 以上文献与专利主要是碳纳米管载抗肿瘤药物在离体细胞水平、小鼠模型水平的研究，尚无碳纳米管载抗病毒药在抗病毒、特别在水产养殖用于无病毒携带苗种生产中的应用。病毒性疾病是危害鱼、虾、蟹、贝类等水产动物最为重要的病害，在渔业生产上，父母亲本往往通过受精卵的垂直传播致使子代携带病毒为传播的主要途径。渔业生产中，一旦水环境恶化、气温变化导致水产动物免疫功能下降，导致大规模、爆发性发病甚至死亡。因此，阻断由父母亲本对子代病毒的传播是保障鱼、虾、蟹、贝类等养殖成功的关键所在。目前，生产上最为先进的技术是通过长期、一代代无病毒亲本选育，最终获得无特定病毒感染的亲本，再通过这些亲本来生产无特定病原携带苗种（简称SPF苗种）。通过该方法来生产水产无病毒携带苗在国内外已经成为控制病毒性疾病研究的热点。但是，由于其成本高、隔断病毒难度大、周期长、适宜种类有限等困境制约了SPF水产苗种生产与推广应用。

[0013] 以下是发明人引用的有关参考文献：

[0014] [1]Liu Z,Sun X M,Nakayama-Ratchford N,et al.Supramolecular chemistry on water-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery[J].ACS NANO,2007,l(l):50-56.

[0015] [2]X.Zhang,L.Meng,Q.Lu,Z.Fei,P.J.Dyson.Targeted delivery and controlled release of doxorubicin to cancer cells using modified single wall carbon nanotubes,Biomaterials,30(2009)6041-6047.

[0016] [3]Ashwin A.Bhirde,Vyomesh Patel,Julie Gavard,Guofeng Zhang,Alioscka A.Sousa,Andrius Masedunskas,Richard D.Leapman,Roberto Weigert,J.Silvio Gutkind,James F.Rusling.Targeted Killing of Cancer Cells in Vivo and in Vitro with EGF-Directed Carbon Nanotube-Based Drug Delivery.ACS Nano,2009,3(2):307–316.

[0017] [4]Liu Z,Chen K,Davis C,Sherlock S,Cao Q,Chen X,Dai H.DrugDelivery with Carbon Nanotubes for in vivo Cancer Treatment.Cancer
Res.2008,68,6652-6660.

[0018] [5]Yang F,Jin C,Yang D,Jiang Y,Li J,Di Y,Hu J,Wang C,Ni Q,Fu D.Magnetic functionalised carbon nanotubes as drug vehicles for cancer lymph node metastasis treatment[J].European Journal of Cancer,2011,47(12):1873-1882.[0019] [6]Ren J,Shen S,Wang D,Xi Z,Guo L,Pang Z,Qian Y,Sun X,Jiang X.The targeted delivery of anticancer drugs to brain glioma by PEGylated oxidized multi-walled carbon nanotubes modified with angiopep-2[J].Biomaterials,2012,33(11):3324-3333.

[0020] [7]Meng L,Zhang X,Lu Q,Fei Z,Dyson PJ.Single walled carbon nanotubes as drug delivery vehicles:targeting doxorubicin to tumors.2012Feb;33(6):1689-98.发明内容

[0021] 本发明的目的在于提供一种碳纳米管载抗病毒药物复合物、制备方法及其在水产养殖无病毒携带苗生产中的应用。

[0022] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。

[0023] 一种碳纳米管载抗病毒药物复合物，包括单壁碳纳米管（Single wall carbon nanotubes,SWCNTs）以及连接在单壁碳纳米管上的抗病毒药物。

[0024] 所述抗病毒药物为吗啉胍（Moroxydine）或三氮唑核苷（Ribavirin）。

[0025] 一种碳纳米管载抗病毒药物复合物的制备方法，包括以下步骤：

[0026] 1）将单壁碳纳米管（SWCNT）进行酸化处理，将酸化处理后的单壁碳纳米管再与牛血清白蛋白（BSA）连接得单壁碳纳米管载蛋白复合物（SWCNT-BSA）；对抗病毒药物吗啉胍进行羧基化修饰得吗啉胍活性酯；

[0027] 2）利用单壁碳纳米管载蛋白复合物和吗啉胍活性酯制备单壁碳纳米管载吗啉胍复合物（SWCNT-BSA-吗啉胍）。

[0028] 所述步骤1）的具体步骤为：

[0029] 将单壁碳纳米管加入到硫酸和硝酸组成的混和酸中后于65-75℃水浴中超声（40KHz，500W）处理2-4h；然后用去离子水洗涤所述单壁碳纳米管至pH值不再变化，然后用硝酸回流24-48h，回流后用超纯水洗涤所述单壁碳纳米管至pH值不再变化，然后离心，将离心得到的黑色固体真空干燥至恒重，得到酸化的单壁碳纳米管；

[0030] 将酸化的单壁碳纳米管加入到2-（N-吗非啉）乙磺酸的水溶液中超声（40KHz，500W）处理0.5-2h得混合物，向混合物中再加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和N-羰基琥珀酸亚胺（酸化的单壁碳纳米管:乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺的质量比=1:3～7；酸化的单壁碳纳米管:N-羰基琥珀酸亚胺的质量比=1:5～10），然后超声（40KHz，500W）处理
2-4h、离心，将离心得到的沉淀加入PBS缓冲液（磷酸缓冲液）中并超声使固体分散均匀，再向PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白（酸化的单壁碳纳米管:牛血清白蛋白=1:1～15），然后超声（40KHz，500W）处理2-4h、室温搅拌48-60h，搅拌后转移到截留量为10万的透析袋中，在纯水中透析3-4d后离心，离心得到的沉淀即为单壁碳纳米管载蛋白复合物；

[0031] 将吗啉胍以及琥珀酸酐（吗啉胍:琥珀酸酐的质量比=5:4～6）溶解于N，N-二甲基甲酰胺后于60-70℃水浴条件下反应24-36h，反应后蒸除溶剂、冷却至室温，然后与冰水混合，混合后用盐酸调节体系的pH为2-3，待体系中产生白色沉淀后过滤，用冰水对过滤得到的沉淀洗涤3-5次，然后用甲醇重结晶即得琥珀酰吗啉胍；将琥珀酰吗啉胍溶解于N，N-二甲基甲酰铵中得混合物A，然后向混合物A中加入N-羟基琥珀酰胺和环二己基碳二亚胺（琥珀酰吗啉胍:环二己基碳二亚胺的质量比=1:1～2；琥珀酰吗啉胍:N-羟基琥珀酰胺的质量比=1:1～1.5），室温避光搅拌反应2-6h，搅拌后过滤除去沉淀，向过滤得到的滤液中加入乙醚，然后将析出的固体再次溶解于N，N-二甲基甲酰胺中得混合物B，向混合物B中再加入乙醚，收集析出的沉淀，即为琥珀酰吗啉胍活性酯。

[0032] 所述步骤2）的具体步骤为：

[0033] 用pH为8.7的硼酸缓冲液将单壁碳纳米管载蛋白复合物配制成溶液A，然后将琥珀酰吗啉胍活性酯的N，N-二甲基甲酰胺溶液滴加到溶液A中(单壁碳纳米管载蛋白复合物:琥珀酰吗啉胍活性酯的质量比=1:1～3)，然后室温避光搅拌3-5h，搅拌后抽滤除去液体，然后置于真空干燥箱中于35-45℃干燥即得单壁碳纳米管载吗啉胍复合物。

[0034] 上述碳纳米管载抗病毒药物复合物在水产养殖无病毒携带苗生产中的应用。

[0035] 所述无病毒携带苗的种类为鱼、虾、蟹或贝类。

[0036] 所述碳纳米管载抗病毒药物复合物在生产中直接用水稀释并搅拌混合均匀，然后泼洒于刚孵化出来仔鱼、虾苗、蟹苗或贝类的幼苗池中。

[0037] 所述碳纳米管载抗病毒药物复合物为单壁碳纳米管载吗啉胍复合物，单壁碳纳米管载吗啉胍复合物中吗啉胍的质量分数为10-40%，幼苗池内单壁碳纳米管载吗啉胍复合物的使用量按吗啉胍计算为10.0-20.0mg/L。

[0038] 本发明利用单壁碳纳米管和抗病毒药物如吗啉胍、三氮唑核苷等已知材料为原料，单壁碳纳米管作为一种新型纳米材料，对鱼类毒性低，利用其高效的穿透性皮肤、细胞膜和承载性可显著提高水产动物苗种体内、细胞内药物含量，并能一次性彻底杀灭由父母亲本垂直传播带来的水生动物病原性病毒，生产鱼、虾、蟹、贝类等水产动物无病毒携带苗种，效果显著；本发明所述碳纳米管载抗病毒药物使用时采用药浴的方法，简单方便，按剂量泼洒于幼苗池中即可有效杀灭苗种体内病毒，阻断病毒的垂直传播来生产无病毒携带苗种。

附图说明

[0039] 图1为BSA、酸化碳纳米管、BSA-碳纳米管和单壁碳纳米管载吗啉胍复合物红外谱图；

[0040] 图2为吗啉胍工作曲线；

[0041] 图3为异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的单壁碳纳米管(SWCNT-FITC)在仔鱼体内的代谢；

[0042] 图4为单壁碳纳米管穿透鱼体表、鱼体内的代谢。

具体实施方式

[0043] 下面结合附图对发明作进一步说明。

[0044] 试验例1单壁碳纳米管载吗啉胍复合物的制备

[0045] 1材料与方法

[0046] 1.1材料

[0047] 1.1.1单壁碳纳米管样品

[0048] 单壁碳纳米管（SWCNT）样品购自中国科学院成都有机化学研究所。单壁碳纳米管的制备采用化学气相沉积法（CVD），其中的主要杂质为金属催化剂和无定形碳，元素质量分布为（厂家提供）：C=96.3wt%，Al=0.08wt%，Cl=0.41wt%，Co=2.91wt%，S=0.29wt%。

[0049] 1.1.2试剂

[0050] 浓硝酸（HNO3），西安化学试剂厂；浓硫酸（H2SO4），国药集团化学试剂有限公司；浓盐酸（HCl），国药集团化学试剂有限公司；二甲基亚砜（DMSO），Sigma公司；硼酸，国药集团化学试剂有限公司；色谱甲醇，国药集团化学试剂有限公司；琥珀酸酐，Sigma公司；吗啉胍（98%），Sigma公司；2-（N-吗非啉）乙磺酸，Sigma公司；N，N-二甲基甲酰铵（DMF），国药集团化学试剂有限公司；乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDAC），西安化学试剂厂；环二己基碳二亚胺（DCC），国药集团化学试剂有限公司；异丙基碳二亚胺（DIC），国药集团化学试剂有限公司；N-羰基琥珀酸亚胺（NHS），国药集团化学试剂有限公司；异硫氢酸荧光素（FITC），Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA），Sigma公司；胰蛋白酶（Trypsin），Sigma公司。所有试剂均为分析纯。

[0051] 1.1.3试验仪器

[0052] ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，上海特成机械设备有限公司；H1650-W型台式高速微量离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；1010-3B型电热恒温鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；SY-360型超声波提取器，上海宁商超声仪器有限公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术（上海）有限公司；Veeco MultiMode V原子力显微镜，德国布鲁克公司；L-2000型高效液相色谱仪，日本日立公司。

[0053] 1.2试验方法

[0054] 1.2.1单壁碳纳米管的酸化

[0055] 上述购买的单壁碳纳米管按100mg加30mL混酸的比例加入到由98%H2SO4和65%HNO3组成的混酸（3：1，V/V）中，然后于70℃水浴中超声（40KHz，500W）处理4h，再用去离子水洗涤至pH值不变化，再按100mg加入25mL硝酸的比例加入到2.6M稀硝酸中加热回流24h。回流后用超纯水洗涤至pH值不再变化，然后于5000rpm离心，离心后收集黑色固体于60℃真空干燥至恒重，得到酸化的单壁碳纳米管。

[0056] 1.2.2单壁碳纳米管连接蛋白

[0057] 取酸化的单壁碳纳米管（3.5g）加入2-（N-吗非啉）乙磺酸（0.1M，pH=5.6，2000mL）后用超声（40KHz，500W）处理30min得混合物，然后向上述混合物再加入20g乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDAC）和25g N-羰基琥珀酸亚胺（NHS）并超声（40KHz，500W）处理2h，然后6000rpm离心5min，离心后去上清，取沉淀加入到PBS缓冲液（磷酸缓冲液）中（pH=7.4，2000mL），向PBS缓冲液中再加入35g牛血清白蛋白（BSA），超声（40KHz，500W）处理2h后室温搅拌48h得反应产物。反应产物用截留量为10万的透析袋在纯水中进行透析，透析3d后，透析完的产物3000rpm离心10min，沉淀即为单壁碳纳米管载蛋白复合物（SWCNT-BSA）。

[0058] 1.2.3药物的修饰

[0059] 将用万分之一天平精确称取的吗啉胍110.0g以及琥珀酸酐100.0g加入到71.0mL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，然后60℃水浴条件下反应24h，减压浓缩除去溶剂，冷却至室温后加入4000mL冰水，并用2mol/L的HCl酸化，调节pH为2，将产生的白色沉淀过滤，用冰水洗涤沉淀3-5次，然后甲醇重结晶纯化即得琥珀酰吗啉胍（SACV）。称取10.0gSACV溶解于N，N-二甲基甲酰铵（DMF）中得混合液，向混合液中加入12.0g N-羟基琥珀酰胺（NHS）与8.0mL（10.0g）环二己基碳二亚胺（DCC）（或异丙基碳二亚胺DIC代替DCC），室温避光剧烈搅拌4h，搅拌后过滤除去反应沉淀，向滤液中加入乙醚，有固体缓慢析出，将固体再次溶解于DMF中，以乙醚再次沉淀，沉淀即为琥珀酰吗啉胍活性酯，琥珀酰吗啉胍活性酯存放于干燥器中备用。

[0060] 1.2.4单壁碳纳米管载吗啉胍复合物(SWCNT-BSA-吗啉胍)合成

[0061] 用pH=8.7的硼酸缓冲液将单壁碳纳米管载蛋白复合物配制成10mg/mL的溶液，记为溶液A，将10mL质量浓度为40mg/mL的琥珀酰吗啉胍活性酯的DMF溶液滴加到20mL溶液A中，室温避光搅拌反应3h后减压抽滤，然后置于真空干燥箱中40℃干燥，即得单壁碳纳米管载吗啉胍复合物(SWCNT-BSA-吗啉胍)，4℃低温干燥保藏。

[0062] 1.2.5合成物效果检测

[0063] 1）傅里叶红外检测

[0064] BSA、酸化碳纳米管、BSA-碳纳米管和单壁碳纳米管载吗啉胍复合物的红外谱图见-1图1所示。图1中1为BSA的红外光谱，1657、1535和3303cm 处的吸收峰分别属于酰胺I、-1
II和自由氨基的特征峰；图1中2为酸化碳纳米管的红外光谱，3427和1725cm 处吸收峰-1
为O-H和C=O的伸缩震动的特征峰，2361cm 处峰为酸化碳纳米管中吸附的CO2的吸收峰；
图1中3为BSA-碳纳米管的红外光谱，由于碳纳米管的影响，BSA的三个特征峰发生蓝移，-1
出现在1699、1541、和3447cm 处。由于BSA吸收峰的遮掩，单壁碳纳米管载吗啉胍复合物的红外谱图（图1中4）与BSA-碳纳米管的红外光谱十分的相似。

[0065] 傅里叶红外检测条件：

[0066] 采用溴化钾压片法；扫描波数4000～400cm-1。

[0067] 2）液相含量检测

[0068] 精确称取一定量的上述合成的单壁碳纳米管载吗啉胍复合物，加入胰蛋白酶溶液（10mg/L）处理载药复合体，调节pH至8.0，37℃恒温培养箱培育24h。酶解完后，取5mL溶液用截留量为10万的透析袋清水透析，透析72h后，将袋内残留物洗出，60℃烘干称重，即为碳纳米管的重量。另取5mL酶解溶液，5000rpm离心10min，取1mL上清液，用于高效液相色谱测定吗啉胍的含量。

[0069] 吗啉胍高效液相色谱测定条件：

[0070] 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；水为流动相；流速1mL/min；检测波长210nm；进样量20μL；柱温30℃。

[0071] 2结果与分析

[0072] 分别称取100mg上述合成产物用于合成效果检测。合成的药物复合物加入50mL的胰蛋白酶溶液（10mg/L）进行酶解，酶解后，各取5mL分别用于单壁碳纳米管和吗啉胍的含量检测。其中SWCNT的检测主要是通过酶解透析，去除杂物，残留下来的固体即为单壁碳纳米管，对单壁碳纳米管进行烘干称重即可计算出单壁碳纳米管的含量。对于复合物中吗啉胍的含量，采用酶解产物，离心取上清液，稀释一定倍数以后采用高效液相色谱法，测定稀释液中吗啉胍的含量，并根据稀释倍数就能计算出复合物中的载药量。其中载药量的公式如下：

[0073] 载药量=（复合物中吗啉胍的含量/复合物的质量）×100%

[0074] 对于高效液相色谱法测定吗啉胍的含量，在上述液相条件下，液相测定结果显示：标准品吗啉胍的出峰时间为10.5min左右，待测样品虽然有其它物质的杂峰，但仍然可以观测到其中的吗啉胍峰值，其出峰时间与吗啉胍标准品的出峰时间基本一致。

[0075] 吗啉胍标准品的测定工作曲线依据液相色谱仪测定进行制作。工作曲线绘制中，共设计9个实验浓度，进样量在0.1～20μg范围内根据实验浓度和峰面积的值进行直线回归拟合，见图2所示。

[0076] 拟合以后的标准工作曲线方程如下：

[0077] Y=2002609.341X+1576978.221 (公式1)

[0078] Y：峰面积；X：吗啉胍含量(μg)R2=0.997

[0079] 拟合回归方程的R2=0.997，表示进样量在0.1～20μg范围内，药物含量与峰面积之间成正比关系。经过测定五次合成的复合物的药物含量，结果显示：单壁碳纳米管载吗啉胍复合物(SWCNT-BSA-吗啉胍)的载药量为18.6%。单壁碳纳米管的含量测定：经胰蛋白酶酶解消化，透析袋透析去除小分子物质，剩下的残留物即为单壁碳纳米管，单壁碳纳米管经烘干、称重和换算以后，其中单壁碳纳米管的质量分数为55.2%。

[0080] 试验例2单壁碳纳米管载吗啉胍复合物杀灭病毒效果评价

[0081] 1材料与方法

[0082] 1.1材料

[0083] 1.1.1病毒、试验动物

[0084] 草鱼呼肠孤病毒株（GCRV-873）由本实验室保种，病毒滴度6.5×10-6/mL。成年稀有鮈鲫（雄性体重：5.15±0.37g，体长：1.14±0.16cm；雌性体重：5.72±0.25g,体长：2.35±0.41cm）购自中国科学院水生生物研究所。实验选用约200尾成年稀有鮈鲫饲养在容积为250L的水族箱中，箱中装有200L充分曝气的自来水，加热棒调节使水温维持在
26±0.5℃，充气增氧保持水中溶解氧在6mg/L以上，日光灯调节光照周期为14：10h，每日早、中、晚各投喂1次冷冻红虫饵料，每次投饵量约为20g。在晚上投饵1h后，清除缸底杂物，换水1/3，每周清理一次水族箱。驯养15d以后，挑选身体健康、性腺发育良好的雌、雄稀有鮈鲫亲鱼用于人工催产授精。

[0085] 1.1.2试验试剂

[0086] 单壁碳纳米管载吗啉胍复合物由本实验室合成，吗啉胍含量18.6%；吗啉胍（98%），Sigma公司；CaCl2·2H2O，国药集团化学试剂有限公司；MgSO4·7H2O，国药集团化学试剂有限公司；NaHCO3，国药集团化学试剂有限公司；KCl，国药集团化学试剂有限公司；氯仿，西安化学试剂厂；异丙醇，西安化学试剂厂；乙醇，西安化学试剂厂；注射用绒促性素（HCG），宁波市三生药业有限公司；琼脂糖（Agarose），Sigma公司；焦碳酸二乙酯（DEPC），Sigma公司；Trizol试剂，Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶，Takara公司；cDNA反转录试剂盒，Takara公司；定量PCR检测试剂盒，Takara公司；DNA Marker DL2000，东盛生物科技有限公司。所有试剂均为分析纯。

[0087] 1.1.3试验仪器

[0088] ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；6孔细胞培养板，迈博瑞生物膜技术（南通）有限公司；ZPG-280恒温光照培养箱，哈尔滨东拓科技开发有限公司；DU640型核酸/蛋白分析仪，美国Backman公司；凝胶成像系统，美国伯乐公司；RTC-200型梯度PCR仪，美国伯乐公司；电泳仪、电泳槽，北京市六一仪器厂；冷冻低温离心机，美国Thermo公司；超低温冰箱，美国Thermo公司。

[0089] 1.2稀有鮈鲫亲鱼的人工催产授精

[0090] 试验所需稀有鮈鲫仔鱼来源于人工催产和人工授精。

[0091] （1）人工催产

[0092] 催产剂为绒毛膜促性腺激素（HCG，规格：500IU/支），用灭菌的鱼类生理盐水（0.65%）配制成100IU/mL的浓度，-20℃低温保存，使用时室温解冻。注射器为25μL微量进样器，酒精棉球对稀有鮈鲫腹部进行消毒。雌鱼采用2次催产法，在腹鳍基部注射催产素，注射剂量为第一次5μL，第二次10μL，两次注射时间间隔24h。雄鱼采用一次催产法，注射剂量为5μL，注射时间与雌鱼的第二次注射同步。第二次注射后24h即可获得成熟的精子和卵子。

[0093] （2）人工授精

[0094] 采用人工干法授精。首先分别捞出催产后的待产雌、雄亲鱼，酒精棉球腹部消毒，然后轻压腹部挤出卵子置于事先洗净烘干的培养皿中，紧接着用相同的方法挤出精子加入到卵子中。用毛细管（一端封闭已用酒精灯灼烧封闭）轻轻搅拌1min，然后加入标准稀释水（ISO7346/3；294.0mg/L CaCl2·2H2O；123.3mg/L MgSO4·7H2O；63.0mg/L NaHCO3；5.5mg/L KCl），轻轻振荡1min，最后放入26.0±0.5℃的恒温培养箱中培育，每隔12h换水，及时剔除死卵。发育正常的受精卵在26.0±0.5℃条件下经过72h出膜形成仔鱼，用于后续试验研究。

[0095] 1.3仔鱼病毒感染与杀灭病毒活性检测

[0096] （1）稀有鮈鲫仔鱼染毒

[0097] 孵化24h以内的稀有鮈鲫仔鱼浸浴在含GCRV病毒（病毒滴度6.5×10-6/mL）的上述标准稀释水中（1：1000稀释），28.0±0.5℃感染24h。

[0098] （2）吗啉胍、碳纳米管载吗啉胍复合物对染毒仔鱼杀灭病毒活性检测[0099] 对染毒仔鱼分别使用浓度为1、5、10和20mg/L（浓度为所含吗啉胍量计算）的吗啉胍、碳纳米管载吗啉胍复合物药浴处理4h后，再更换不含前述药物的标准稀释水进行养殖，每个处理组400尾仔鱼。水温控制在8.0±0.5℃，每天投喂熟鸡蛋黄少许。在药浴后的第3、6、9和12d分别随机挑选10尾仔鱼提取RNA，检测GCRV病毒感染率。同时，每天观察统计仔鱼的存活情况。

[0100] a.病毒RNA的提取

[0101] 采用病毒RNA提取试剂盒（RNApure Virus Kit，CW0586，北京康为世纪生物科技有限公司）提取鮈鲫仔鱼GCRV病毒RNA，步骤参照试剂盒说明书。

[0102] b.RNA的质量检测和浓度测定

[0103] 用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶检测上述提取的病毒RNA的完整性，其中电泳条TM件为恒定电压120V，15min，核酸染料为GoldView （北京赛百盛基因技术有限公司），DNA Marker为DL2000（东盛生物科技有限公司）。结合DU640型核酸/蛋白分析仪（美国Backman公司），检测提取RNA的质量和浓度。

[0104] c.RNA的反转

[0105] 经上述RNA质量和浓度检测，将调整好浓度的RNA进行反转录，反转录使用cDNATM反转录试剂盒（PrimeScript RT-PCR Kit（DRR014A），宝生物工程（大连）有限公司），转录的具体方法参照反转录试剂盒的说明书。在DEPC处理过的PCR管中加入以下成分，具体见表1。

[0106] 表1反应液组成

[0107]

[0108] 反转录条件为：37℃，15min；85℃，5s。

[0109] d.定量引物的设计与合成

[0110] 根据GenBank中已发表的基因的cDNA序列，根据其同源区域用PrimerPremier5.0软件设计定量PCR引物。定量引物由南京金思瑞生物技术有限公司合成，引物序列见表2。

[0111] 表2基因定量PCR检测的引物序列

[0112]

[0113] e.定量PCR检测

[0114] 相关目的基因的实时定量检测，检测试剂采用Takara的实时定量检测试剂TM盒（PrimeScript RT-PCR Kit（RR037A），宝生物工程（大连）有限公司），检测仪器为CFX-96Real-Time PCR Detection System。使用SYBR GreenⅡ荧光嵌合进行实时定量反应。

[0115] 定量PCR反应液组成见表3。

[0116] 表3实时定量反应液组成

[0117]

[0118] 定量PCR反应采用两步法，反应程序为：95℃，30s；40个循环（95℃，5s，60℃，30s）；做熔解曲线，确定引物及反应是否正常。

[0119] 实时定量数据的处理采用2-△△CT法（Livak和Schmittgen，2001.Analysis of -ΔΔCTrelative gene expression data using real-time quantitative PCR and the2 method.Methods.25(4):402-408.）。其中，目的基因的实验数据采用平均值±标准差表示。

[0120] 2结果与分析

[0121] 2.1吗啉胍和单壁碳纳米管载吗啉胍两种药物治疗感染病毒鱼存活情况[0122] 不同浓度吗啉胍和单壁碳纳米管载吗啉胍治疗攻毒后的稀有鮈鲫仔鱼的存活结果见表4和表5所示。

[0123] 表4不同浓度吗啉胍治疗感染病毒仔鱼存活结果

[0124]

[0125] 从表4可以看出：病毒感染治疗在12d后，0mg/L使用对照组仔鱼存活数为57尾，存活率14.3%；1mg/L吗啉胍治疗组存活数为61尾，存活率15.3%；当治疗浓度达到20mg/L时，存活数达到119尾，存活率仅达到29.8%。

[0126] 表5不同浓度单壁碳纳米管载吗啉胍(SWCNT-BSA-吗啉胍)治疗感染病毒仔鱼存活结果

[0127]

[0128] 从表5可以看出：病毒感染治疗12d后，0mg/L对照组仔鱼存活数为57尾，存活率14.3%；1mg/L单壁碳纳米管载吗啉胍治疗组存活数为134尾，存活率与0mg/L对照组相比提高1倍以上，达到33.5%；当达到10mg/L时，存活数达到390尾，存活率与0mg/L治疗组相比提高6倍以上，达到97.5%。

[0129] 2.1吗啉胍和单壁碳纳米管载吗啉胍(SWCNT-BSA-吗啉胍)两种药物治疗感染病毒鱼的感染率

[0130] 不同浓度吗啉胍和单壁碳纳米管载吗啉胍治疗感染病毒后的稀有鮈鲫仔鱼，通过定量PCR检测，其感染病毒的数量结果见表6和表7。

[0131] 表6吗啉胍治疗仔鱼后病毒感染数

[0132]

[0133] 从表6可见：病毒感染治疗12d后，0mg/L治疗组仔鱼感染数为10尾，感染率100%；1mg/L吗啉胍治疗组仔鱼感染数为9尾，感染率为90%；当治疗浓度达到20mg/L时，感染数为6尾，感染率与0mg/L治疗组相比降低40%。

[0134] 表7单壁碳纳米管载吗啉胍(SWCNT-BSA-吗啉胍)治疗仔鱼后病毒感染数[0135]

[0136] 由表7看出：病毒感染治疗12d后，0mg/L治疗组仔鱼感染数为10尾，感染率100%；1mg/L单壁碳纳米管载吗啉胍治疗组感染数为6尾，感染率与0mg/L治疗组相比降低40%；
当治疗浓度达到10mg/L及其以上时，感染数降至0尾，感染率为0。

[0137] 研究结果表明：运用单壁碳纳米管作为载体以后，吗啉胍的治疗效果显著提高；10mg/L单壁碳纳米管载吗啉胍可使仔鱼存活率达到97.5%，病毒感染率降低至0；与不含单壁纳米管组相比，1mg/L单壁碳纳米管载吗啉胍即可达到20mg/L单一吗啉胍的治疗效果。

[0138] 综上所述，通过单壁碳纳米管载抗病毒药物吗啉胍杀灭草鱼GCRV实例结果表明：碳纳米管载抗病毒药物药浴水产动物苗种如鱼、虾、蟹、贝类等，可完全杀灭体内所携带的病毒，实现水产动物无病毒携带苗种的生产。

[0139] 试验例3单壁碳纳米管载吗啉胍复合物(SWCNT-BSA-吗啉胍)在稀有鮈鲫仔鱼体内代谢

[0140] 1材料与方法

[0141] 1.1试验材料

[0142] 1.1.1试验动物

[0143] 试验所需稀有鮈鲫仔鱼的获取同试验例2。

[0144] 1.1.2试验试剂

[0145] 单壁碳纳米管载吗啉胍复合物由本实验室合成，吗啉胍含量18.6%；吗啉胍（98%），Sigma公司；CaCl2·2H2O，国药集团化学试剂有限公司；MgSO4·7H2O，国药集团化学试剂有限公司；NaHCO3，国药集团化学试剂有限公司；KCl，国药集团化学试剂有限公司；注射用绒毛膜促性腺激素（HCG），宁波市三生药业有限公司；色谱甲醇，西安化学试剂厂。其余试剂均为分析纯。

[0146] 1.1.3试验仪器

[0147] ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；ZPG-280恒温光照培养箱，哈尔滨东拓科技开发有限公司；冷冻低温离心机，美国Thermo公司；超低温冰箱，美国Thermo公司；SY-360型超声波提取器，上海宁商超声仪器有限公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司；L-2000型高效液相色谱仪，日本日立公司。

[0148] 1.2试验方法

[0149] 1.2.1试验处理

[0150] 将出膜24h以内的稀有鮈鲫仔鱼浸泡在含不同浓度吗啉胍（1和10mg/L）和碳纳米管载吗啉胍复合物（所含吗啉胍浓度为1和10mg/L）的标准稀释水中，浸泡处理4h以后更换为上述标准稀释水继续培养。培养温度28.0±0.5℃，每隔24h更换1次标准稀释水，每天适量投喂熟鸡蛋黄。每个处理组4000尾仔鱼，3个平行，在特定取样时间抽样100尾仔鱼，再用标准稀释水反复洗涤以后用于后续样品制备和液相测定。

[0151] 1.2.2测定样品前处理

[0152] （1）首先将收集的100尾稀有鮈鲫仔鱼转入10mL离心管中，加入2mL去离子水和2mL甲醇。电动匀浆机匀浆1min，匀浆以后的样品室温静置4h。8000rpm离心10min，取上清液加入10mL离心管中，置60℃烘箱中至液体挥发完全。

[0153] （2）将上述干燥样品直接加入200μL流动相（色谱甲醇/纯水，V/V=70/30）涡旋振荡1min使其充分溶解。室温静置4h，1mL注射器吸取，0.22μm滤膜过滤，置离心管中，4℃保存备用。

[0154] 1.2.3高效液相测定

[0155] 液相上样和检测条件参见试验例1中的液相检测条件。

[0156] 2结果与分析

[0157] 不同浓度吗啉胍（1和10mg/L）和碳纳米管载吗啉胍复合物（所含吗啉胍浓度为1和10mg/L）浸浴稀有鮈鲫仔鱼，液相测定不同时间段的吗啉胍药物含量结果见表8所示。单一吗啉胍浸泡15min以后，仔鱼体内能够检测到吗啉胍；浸泡4h时，1mg/L处理组和10mg/L处理组吗啉胍浓度分别达到0.28和2.53mg/g体重；换为标准稀释水以后，24h以内吗啉胍完全代谢出体外。单壁碳纳米管承载以后，5min即能检测到体内吗啉胍；浸泡4h时，1mg/L处理组和10mg/L处理组吗啉胍浓度分别达到1.64和11.33mg/g体重；更换为标准稀释水以后，10mg/L处理组120h后吗啉胍才能完全代谢出体外。

[0158] 表8两种药物在稀有鮈鲫仔鱼体内代谢结果

[0159]

[0160] 上述研究结果表明：单壁碳纳米管载药以后，使得药物吗啉胍进入体内时间缩短，体内含量显著增加，代谢时间延长，从而也提高了药物效果；同时发现，120h后，所载的吗啉胍药物也能从碳纳米管解离下来，并在鱼体内被完全代谢排出体外，具有食品安全性。

[0161] 试验例4单壁碳纳米管穿透稀有鮈鲫仔鱼皮肤和安全性评价

[0162] 1材料与方法

[0163] 1.1试验材料

[0164] 1.1.1试验动物

[0165] 试验所需稀有鮈鲫仔鱼的获取同试验例2。

[0166] 1.1.2试验试剂

[0167] 单壁碳纳米（SWCNT）管样品购自中国科学院成都有机化学研究所；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的单壁碳纳米管(SWCNT-FITC)由本实验室合成；CaCl2·2H2O，国药集团化学试剂有限公司；MgSO4·7H2O，国药集团化学试剂有限公司；NaHCO3，国药集团化学试剂有限公司；KCl，国药集团化学试剂有限公司；注射用绒毛膜促性腺激素（HCG），宁波市三生药业有限公司。其余试剂均为分析纯。

[0168] 1.1.3试验仪器

[0169] ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；6孔细胞培养板，迈博瑞生物膜技术（南通）有限公司；ZPG-280恒温光照培养箱，哈尔滨东拓科技开发有限公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司；LSM510META激光共聚焦显微镜，德国卡尔蔡司股份公司；HT7700场发射透射电子显微镜，日本日立集团有限公司。

[0170] 1.2试验方法

[0171] 1.2.1单壁碳纳米管的毒性评价

[0172] 采用6孔细胞培养板作为毒性评价工具，实验时每孔加入10mL不同浓度的单壁碳纳米管溶液，放入10尾稀有鮈鲫仔鱼。采用换水式法，每隔24h更换相应浓度的溶液以保持溶液中的溶解氧充足和碳纳米管浓度稳定。毒性实验共有5个浓度（20、40、60、80和100mg/L），每个浓度30尾仔鱼，3个平行。6孔细胞培养板加上盖子以避免药液挥发而改变药液浓度。将封好的6孔板放在温度为25.0±0.5℃的恒温光照培养箱中培养，单壁碳纳米管处理4h以后更换为标准稀释水。4h、12h和24h观测仔鱼的存活率。

[0173] 1.2.2单壁碳纳米管穿透鱼体及在鱼体内代谢

[0174] 在6孔细胞培养板中，每孔加入10mL用FITC标记的含30mg/L单壁碳纳米管标准稀释水，放入10尾稀有鮈鲫仔鱼处理4h以后再更换为标准稀释水进行观察。每隔24h更换标准稀释水以保持溶液中的溶解氧充足。6孔细胞培养板加上盖子以避免液体挥发。将封好的6孔板放在温度为25.0±0.5℃的恒温光照培养箱中培养，特定时间观测时，分别取仔鱼固定在4%的多聚甲醛溶液和2.5%戊二醛溶液中用于激光共聚焦和透射电镜观察，检测单壁碳纳米管穿透鱼体以及在体内的代谢情况。

[0175] 2结果与分析

[0176] 2.1单壁碳纳米管对稀有鮈鲫仔鱼毒性

[0177] 本实验中，根据单壁碳纳米管的溶解性，浓度上限设为100mg/L。但即使在最高浓度，3个观测时间点均观测不到仔鱼死亡。

[0178] 2.2单壁碳纳米管穿透鱼体表、鱼体内的代谢

[0179] FITC荧光标记单壁碳纳米管(SWCNT-FITC)在浸浴稀有鮈鲫仔鱼30min以后，激光共聚焦显微镜观察显示：碳纳米管穿透鱼体表进入鱼体内，已经广泛分布在仔鱼体内各组织器官，并主要集中在头胸部区域（见图3-1）。从图3-2和图3-3看出，在更换为标准稀释水以后，荧光强度逐渐减弱，至144h已经检测不到荧光信号（见图3-4）。由此说明单壁碳纳米管在水环境条件下，能够顺利被代谢排出。

[0180] 稀有鮈鲫仔鱼浸浴在含单壁碳纳米管水体中，在不同时间段通过透射电镜观察，图4是单壁碳纳米管由鱼的体表进入并排除的全过程。单壁碳纳米管首先穿透仔鱼表皮（见图4的1-3），并逐渐进入稀有鮈鲫体内（见图4的4-6），最终又被吞噬细胞吞噬排除体外（见图4-7中显示管腔中含吞噬细胞；图4-8和图4-9中显示1个吞噬细胞含单壁碳纳米管）。

[0181] 试验例5单壁碳纳米管载吗啉胍(SWCNT-BSA-吗啉胍)杀灭感染病毒GCRV-873的草鱼水花鱼苗效果试验

[0182] 1.1材料

[0183] 1.1.1病毒、试验动物

[0184] 草鱼呼肠孤病毒株（GCRV-873）由本实验室保种，病毒滴度6.5×10-6/mL。草鱼水花鱼苗（平均体长：4.73±0.09mm）为刚孵化2日龄，统计大约为250000尾，由陕西省国家级新民家鱼良种场提供。

[0185] 1.1.2试剂

[0186] 单壁碳纳米管载吗啉胍复合物(SWCNT-BSA-吗啉胍)由本实验室合成，载药量为32.6%；吗啉胍（98%），Sigma公司；琼脂糖（Agarose），Sigma公司；焦碳酸二乙酯（DEPC），Sigma公司；Trizol试剂，Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶，Takara公司；cDNA反转录试剂盒，Takara公司；定量PCR检测试剂盒，Takara公司；DNA Marker DL2000，东盛生物科技有限公司。

[0187] 1.1.3试验仪器

[0188] ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；6孔细胞培养板，迈博瑞生物膜技术（南通）有限公司；ZPG-280恒温光照培养箱，哈尔滨东拓科技开发有限公司；DU640型核酸/蛋白分析仪，美国Backman公司；凝胶成像系统，美国伯乐公司；RTC-200型梯度PCR仪，美国伯乐公司；电泳仪、电泳槽，北京市六一仪器厂；冷冻低温离心机，美国Thermo公司；超低温冰箱，美国Thermo公司。

[0189] 1.2水花鱼苗病毒感染试验与杀灭病毒活性检测

[0190] 1.2.1水花鱼苗病毒感染试验

[0191] 将孵化出2日龄的草鱼水花鱼苗250000尾，浸浴在含GCRV病毒（病毒滴度-66.5×10 /mL）的上述标准稀释水中（1：1000稀释），28.0±0.5℃感染24h（例2证实该病毒滴度均可感染）。

[0192] 1.2.2单壁碳纳米管载吗啉胍(SWCNT-BSA-吗啉胍)杀灭病毒活性检测

[0193] 对染毒250000尾草鱼水花苗分3组。A组150000尾，在染毒结束后更换无病毒的水，再使用浓度为10mg/L（浓度为所含吗啉胍量计算）的碳纳米管载吗啉胍复合物药浴处理4h后，投放在水深1米、2亩池塘进行培育养殖；B组，将染毒50000尾草鱼水花苗在染毒结束后更换无病毒的水，再使用浓度为10mg/L吗啉胍药浴处理4h后，投放在水深1米、1亩池塘进行培育养殖；C组，将染毒50000尾草鱼水花苗在染毒结束后更换无病毒的水，直接投放在水深1米、1亩池塘进行培育养殖到夏花鱼种阶段。试验均在陕西省国家级新民家鱼良种场实施。

[0194] 3组养殖池塘均采用豆浆泼洒投喂，每天加注少量新水，进行日常养殖管理，养殖20d后，全池塘捕捞统计数量，并每个池塘随机抽样1000尾草鱼夏花鱼种，每组10尾分别进行病毒检测。检测方法与例2相同。

[0195] 2结果与分析

[0196] 2.1鱼苗培育20d后存活情况

[0197] 鱼苗培养第20d，全部捕捞统计两个池塘存活数量。A组使用碳纳米管载吗啉胍复合物药浴处理的150000尾水花鱼苗，经过20d培育，获得平均体长2.75cm、平均体重0.23g的夏花鱼种105600尾，成活率为70.4%；B组感染病毒后，吗啉胍处理的50000尾水花鱼苗经过20d培育，获得平均体长3.15cm、平均体重0.31g的夏花鱼种16100尾，成活率为32.2%；C组感染病毒后，不经药物处理的50000尾水花鱼苗经过20d培育，获得平均体长
3.01cm、平均体重0.92g的夏花鱼种4170尾，成活率为8.3%。由此可以看出，导致草鱼鱼苗前期培育死亡最主要的病害是草鱼呼肠孤病毒，这与前人的研究结果相吻合。所以，通过该方法阻断由亲鱼垂直传播给子代的病毒造成大规模死亡是保障鱼苗培育的关键。

[0198] 2.2SWCNT-BSA-吗啉胍杀灭感染病毒活性检测

[0199] 抽样检查经过20d培育草鱼夏花鱼种，A组随机取样1000尾，分10尾一组分别通过PCR检测感染病毒情况，体内均无草鱼呼肠孤病毒存在，结果见表9；B组随机取样1000尾，分10尾一组分别通过PCR检测感染病毒情况，体内有不同程度感染草鱼呼肠孤病毒，最高第10组，感染率达80%，最低感染率为50%，平均感染率达64%（见表10）；C组是感染病毒后无药浴处理的夏花鱼种，在培养中成活率最低，随机取样1000尾通过PCR检测，草鱼呼肠孤病毒病毒感染率达100%（见表11）。

[0200] 表9单壁碳纳米管载吗啉胍(SWCNT-BSA-吗啉胍)药浴后的夏花鱼种检测病毒情况

[0201]

[0202] 表10吗啉胍药浴后的夏花鱼种检测病毒情况

[0203]

[0204] 表11感染病毒后无药浴处理的夏花鱼种检测病毒情况

[0205]

[0206] 综上所述，通过单壁碳纳米管载抗病毒药物吗啉胍(SWCNT-BSA-吗啉胍)完全杀灭草鱼GCRV，大大提高苗种培育中的成活率，同时，阻断了病毒垂直传播的途径，实现了无病毒携带苗种的生产。

[0207] 本发明利用碳纳米管载药能够在水体中由鱼、虾、蟹、贝类等水生动物的体表穿透进入内脏各组织、细胞内，杀灭上述水生动物体内、特别是细胞内的病毒，可以在水产养殖过程中生产鱼、虾、蟹、贝类等水产动物无病毒携带苗种。