小麦热胁迫相关蛋白TaGCN5及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种小麦热胁迫相关蛋白TaGCN5及其编码基因和应用。本发明提供了一种蛋白质，命名为TaGCN5蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐高温胁迫能力相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明中构建了TaGCN5基因的超表达载体，转化拟南芥后显著增加了植物的耐高温胁迫能力。本发明对于培育耐高温植物具有重大价值。

权利要求

1.一种蛋白质，是序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求2或3所述基因插入pCAMBIA-1300载体的多克隆位点得到的重组质粒。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任意片段的引物对。

7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐高温胁迫能力高于所述目的植物的转基因植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要4或5所述重组表达载体导入所述目的植物中。

9.权利要求1所述蛋白质、权利要求2或3所述基因、权利要求4或5中任一所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育具有耐高温胁迫能力的转基因植物中的应用。

10.权利要求7或8所述方法在植物育种中的应用。

说明书

小麦热胁迫相关蛋白TaGCN5及其编码基因和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种小麦热胁迫相关蛋白TaGCN5及其编码基因和应用。

背景技术

[0002] 在作物生长、发育过程中，除了受到病虫等生物因素的侵袭外，也常常受到不良气候和土壤因素的影响，而使产量和品质受到影响，这种不良影响称为环境胁迫或非生物胁迫。随着全球变暖，水资源短缺，土壤沙化、盐碱化，作物所经受的非生物胁迫会越来越频繁，越来越严重。

[0003] 小麦是我国重要的粮食作物，其产量和品质直接关系到人们的生活。高温对小麦的生长发育有着十分重要的影响，高温不仅会影响子房和胚珠囊以及花粉的发育、开花和受精，还会影响灌浆、蛋白和淀粉的合成，导致籽粒产量下降、品质变劣。开展小麦耐热性的分子机理研究，鉴定耐热相关基因，并将其应用到小麦的分子育种中去，有助于小麦耐热品种的培育。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种小麦热胁迫相关蛋白TaGCN5及其编码基因和应用。

[0005] 本发明提供了一种蛋白质，命名为TaGCN5蛋白，是如下（a）或（b）：

[0006] （a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0007] （b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐高温胁迫能力相关的由序列1衍生的蛋白质。

[0008] 为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0009] 表1标签的序列

[0010]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0011] 上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0012] 编码所述TaGCN5蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

[0013] 所述基因具体可为如下（1）或（2）或（3）的DNA分子：

[0014] （1）序列表中序列2所示的DNA分子；

[0015] （2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码与植物耐高温胁迫能力相关的蛋白的DNA分子；

[0016] （3）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且与植物耐高温胁迫能力相关的蛋白的DNA分子。

[0017] 上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

[0018] 含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

[0019] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

[0020] 所述重组表达载体具体可为将所述基因插入pCAMBIA-1300载体的多克隆位点（如KpnI和SacI酶切位点之间）得到的重组质粒。

[0021] 扩增所述基因的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

[0022] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到耐高温胁迫能力高于所述目的植物的转基因植物。所述基因可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

[0023] 所述双子叶植物优选为拟南芥，如gcn5突变体。所述耐高温胁迫能力高可体现为相对电导率降低。

[0024] 本发明还保护所述TaGCN5蛋白、所述基因、含有所述基因的重组表达载体、含有所述基因的表达盒、含有所述基因的转基因细胞系或含有所述基因的重组菌在培育具有耐高温胁迫能力的转基因植物中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物优选为拟南芥，如gcn5突变体。

[0025] 本发明还保护以上任一所述方法在植物育种中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物优选为拟南芥，如gcn5突变体。

[0026] 本发明还保护所述TaGCN5蛋白在调节植物耐高温胁迫能力中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物优选为拟南芥，如gcn5突变体。

[0027] 以上任一所述的高温具体可为38℃以上。

[0028] 高温这一非生物逆境是影响植物产量的重要限制因素。本发明以拟南芥为基础，通过同源克隆的方法，获得与拟南芥GCN5同源的小麦基因，通过转基因的方法对其功能进行深入分析和鉴定，进一步明确了TaGCN5基因在小麦响应高温胁迫过程中的作用。本发明中构建了TaGCN5基因的超表达载体，转化拟南芥后显著增加了植物的耐高温胁迫能力。本发明对于培育耐高温植物具有重大价值。

附图说明

[0029] 图1为实施例2中的表型照片。

[0030] 图2为实施例2中的电导率结果。

具体实施方式

[0031] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pCAMBIA-1300载体：Cambia公司。农杆菌GV3101：Biovector公司。gcn5突变体与瓦斯莱生态型拟南芥的差异仅在于AtGCN5基因突变失活了。

[0032] 瓦斯莱生态型拟南芥（用“Ws”表示）：参考文献：Bertrand,C.,Bergounioux,C.,Domenichini,S.,Delarue,M.,and Zhou,D.X.(2003).Arabidopsis histone acetyltransferase AtGCN5regulates the floral meristem activity through the WUSCHEL/AGAMOUS pathway.J.Biol.Chem.278,28246–28251。

[0033] gcn5突变体（即文献中的AtGCN5mutant，用“gcn5”表示）：参考文献：Bertrand,C.,Bergounioux,C.,Domenichini,S.,Delarue,M.,and Zhou,D.X.(2003).Arabidopsis histone acetyltransferase AtGCN5regulates the floral meristem activity through the WUSCHEL/AGAMOUS pathway.J.Biol.Chem.278,28246–28251。

[0034] 实施例1、小麦热胁迫相关蛋白TaGCN5及其编码基因的发现

[0035] 在NCBI数据库的基础上，对来源于其它植物的现有相关功能的基因和片段进行比对，根据比对和序列分析的结果，对小麦的相关片段进行拼接、延伸和功能鉴定，最终得到一个完成的开放阅读框，该开放阅读框编码序列表的序列1所示的蛋白质，将该蛋白质命名为TaGCN5蛋白。将编码TaGCN5蛋白的基因命名为TaGCN5基因，如序列表的序列2所示。

[0036] 实施例2、转基因植物的获得和鉴定

[0037] 一、重组质粒的构建

[0038] 1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

[0039] 2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0040] F1：5’-CACCCGGGGTACCATGGACGGCCTCGCGGCGCC-3’；

[0041] R1：5’-CTGGGTCGAGCTCCTAGTTCTTCGTTGACGCAG-3’。

[0042] 3、用限制性内切酶KpnI和SacI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

[0043] 4、用限制性内切酶KpnI和SacI双酶切pCAMBIA-1300载体，回收载体骨架。

[0044] 5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在pCAMBIA-1300载体的KpnI和SacI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。

[0045] 二、转基因植物的获得

[0046] 1、将步骤一构建的重组质粒转化农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。

[0047] 2、取gcn5突变体种子，4℃春化3天后播种于MS培养基，培养（22℃/18℃、16小时光照/8小时黑暗、60％-70％湿度），生长到两片真叶时移栽到填充有培养基质（培养基质为等体积混合的营养土和蛭石）的种植钵中，植株开花后剪去主枝顶端以促进侧枝发展，将剪枝后4-6天的植株倒置于步骤1得到的重组农杆菌的菌悬液中浸泡，然后取出植株，用充满气的黑色塑料袋包住，平放，22℃暗培养24小时，然后去掉塑料袋将种植钵直立，培养（22℃/18℃、16小时光照/8小时黑暗、60％-70％湿度）至植株至结实，收获T0代种子。

[0048] 3、取T0代种子，4℃春化3天后平铺于含60μl/100ml潮霉素的MS培养基，培养（22℃/18℃、16h光照/8h黑暗、60％-70％湿度）7天后挑选阳性植株（阳性植株表现为：真叶健康呈深绿色，根伸长至培养基中），将阳性植株转移至MS培养基并采用相同条件培养
10天，然后再转移至土壤并采用相同条件培养植株至结实，收获T1代种子。

[0049] 4、取T1代种子，按照步骤3的方法筛选阳性植株并收获T2代种子。

[0050] 5、取T2代种子，按照步骤3的方法筛选阳性植株。

[0051] 对于某一T1代植株，如果其T2代植株均为阳性植株，该T1代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系。

[0052] 6、将T2代植株自交，获得T3代种子。

[0053] 三、转空载体植株的获得

[0054] 用pCAMBIA-1300载体代替步骤一构建的重组质粒，其它同步骤二，得到转空载体植株。

[0055] 四、表型比较和成活率统计

[0056] 分别将步骤二得到的转基因株系的T3代种子、步骤三得到的转空载体株系的T3代种子、瓦斯莱生态型拟南芥的种子和gcn5突变体的种子（每个株系50粒）进行热胁迫下的表型比较和成活率检测，方法如下：种子消毒后，用无菌水清洗6-7次，平铺于MS培养基，4℃春化3天，然后培养（22℃/18℃、16h光照/8h黑暗、60％-70％湿度）8天，然后培养（即热胁迫处理；38℃、16h光照/8h黑暗、60％-70％湿度）4天，然后培养（22℃/18℃、16h光照/8h黑暗、60％-70％湿度）2天，拍照并统计成活率。照片见图1A。转基因株系与瓦斯莱生态型拟南芥均长势良好，二者之间没有显著差异。转空载体株系与gcn5突变体均长势不佳，二者之间没有显著差异。转基因株系的T3代种子的成活率为92%，瓦斯莱生态型拟南芥的种子的成活率为91%，转空载体株系的T3代种子的成活率为9.6%，gcn5突变体的种子的成活率为9.5%。结果表明，导入TaGCN5基因可以显著增强gcn5突变体的耐高温胁迫能力。

[0057] 分别将步骤二得到的转基因株系的T3代种子、步骤三得到的转空载体株系的T3代种子、瓦斯莱生态型拟南芥的种子和gcn5突变体的种子进行热胁迫下的表型比较，方法如下：种子消毒后，用无菌水清洗6-7次，平铺于MS培养基，4℃春化3天，然后培养（22℃/18℃、16h光照/8h黑暗、60％-70％湿度）8天，然后移栽至培养基质（培养基质为等体积混合的营养土和蛭石）中培养（22℃/18℃、16h光照/8h黑暗、60％-70％湿度）10天，然后培养（即热胁迫处理；38℃、16h光照/8h黑暗、60％-70％湿度）4天，然后培养（22℃/18℃、16h光照/8h黑暗、60％-70％湿度）2天，拍照。照片见图1B。转基因株系与瓦斯莱生态型拟南芥均长势良好，二者之间没有显著差异。转空载体株系与gcn5突变体均长势不佳，二者之间没有显著差异。结果表明，导入TaGCN5基因可以显著增强gcn5突变体的耐高温胁迫能力。

[0058] 五、电导率测定

[0059] 分别将步骤二得到的转基因株系的T3代种子、步骤三得到的转空载体株系的T3代种子、瓦斯莱生态型拟南芥的种子和gcn5突变体的种子（每个株系50粒）进行电导率测定检测，方法如下：

[0060] 1、将种子4℃春化3天后平铺于MS培养基，然后培养（22℃/18℃、16h光照/8h黑暗、60％-70％湿度）8天，然后移栽至土壤中培养（22℃/18℃、16h光照/8h黑暗、60％-70％湿度）14天，选择生长一致，发育良好的植株。

[0061] 2、用打孔器分别从植株的第5片、第6片和第7片叶子上打取(每株取下三片叶子)，用蒸馏水冲洗3次，置于20ml试管中，加入13ml蒸馏水(使整个叶片全部浸没于水中)。

[0062] 3、把试管放在42℃水浴锅中放置1h，然后室温放置24h，然后用电导率仪测定每个试管中溶液的电导率（记下此时电导率的读数为T1），然后离心管用锡箔纸包紧，灭菌（15Psi、121℃、15min），放置24h后再用电导率仪测定此时溶液的电导率（记为T2）。

[0063] 4、按照公式计算CMS(Cell membrane thermostability)值，即细胞膜的稳定性。

[0064] CMS=T1/T2。

[0065] 结果见图2。