聚氨基酸接枝共聚物及其制备方法、可注射性水凝胶

摘要

本发明提供了一种聚氨基酸接枝共聚物及其制备方法、可注射性水凝胶，该聚氨基酸接枝共聚物如式（I）所示。与现有天然聚合物相比，本发明以具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）为主链，其在一定程度上能够模拟天然蛋白质和多肽，具有良好的生物相容性和降解性；该接枝聚合物具有式（II）结构的支链，其含有苯酚结构并且可以调节不同的接枝率，能够在辣根过氧化物酶和过氧化氢的作用下交联，形成条件温和，反应速率容易控制，因此能够制备得到机械强度较高的可注射性水凝胶；并且该接枝共聚物也包含式（III）结构的支链，还可调节不同的接枝率，从而使式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物具有良好的水溶性。

权利要求

1.一种聚氨基酸接枝共聚物，如式(I)所示：

所述-R1具有式(II)结构：

所述-R2具有式(III)结构：

其中，x，y、z与m为聚合度，3≤x≤400；3≤y≤400；0≤z≤900；30≤x+y+z≤

1000；所述m的范围为10≤m≤300。

2.一种聚氨基酸接枝共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将酪胺、具有式(IV)结构的聚乙二醇单甲醚、具有式(V)结构的聚(L-谷氨酸)与有机溶剂混合，在偶联剂的作用下，发生缩合反应，得到式(I)所示的聚氨基酸接枝共聚物；

所述-R1具有式(II)结构；所述-R2具有式(III)结构；

其中，x，y、z、m与n为聚合度，3≤x≤400；3≤y≤400；0≤z≤900；30≤x+y+z≤1000；n＝x+y+z；所述m的范围为10≤m≤300。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酪胺与具有式(V)结构的聚(L-谷氨酸)的羧基的摩尔比为(0.1～0.4)：1。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述具有式(IV)结构的聚乙二醇单甲醚与具有式(V)结构的聚(L-谷氨酸)的羧基的摩尔比为(0.1～0.4)：1。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N′-二环己基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或几种。

6.一种可注射性水凝胶，其特征在于，包括式(I)所示的聚氨基酸接枝共聚物、水性溶剂、辣根过氧化物酶与过氧化氢；

所述-R1具有式(II)结构：

所述-R2具有式(III)结构：

其中，x，y、z与m为聚合度，3≤x≤400；3≤y≤400；0≤z≤900；30≤x+y+z≤

1000；所述m的范围为10≤m≤300。

7.根据权利要求6所述的可注射性水凝胶，其特征在于，所述式(I)所示的聚氨基酸接枝共聚物与水性溶剂混合为2～30wt％的第一混合溶液。

8.根据权利要求6所述的可注射性水凝胶，其特征在于，所述辣根过氧化物酶与水性溶剂混合为0.01mg/mL～2.0mg/mL的第二混合溶液。

9.根据权利要求6所述的可注射性水凝胶，其特征在于，所述过氧化氢与水性溶剂混合为0.1mmol/L～200mmol/L的第三混合溶液。

说明书

聚氨基酸接枝共聚物及其制备方法、可注射性水凝胶

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术、生物医用材料及组织工程技术领域，尤其涉及聚氨基酸接枝共聚物及其制备方法、可注射性水凝胶。

背景技术

[0002] 水凝胶是一类能够快速吸收并保持大量水分的具有交联网络结构的聚合物，在聚合物网络结构中含有亲水基团或亲水的链段，它们在水环境中能够与水结合，这种水凝胶结构使得亲水的小分子能够在其中进行扩散。

[0003] 可注射性水凝胶是近年来出现的新型水凝胶体系，它具有独特的溶液-凝胶转变特性，在成凝胶之前为低粘度的水溶液，便于注射，而当溶液注射到生物体内后，能够原位快速形成水凝胶。

[0004] 可注射性水凝胶便于包载药物、细胞和生物活性分子，而且能适用于修复形状复杂的伤口，以及实现微创治疗，因此，其在局部药物释放与原位组织缺损修复方面具有广泛的应用前景。

[0005] 现有技术公开了多种可注射性水凝胶，如聚乙二醇和聚（L-乳酸）的嵌段共聚物水凝胶，在温度变化时可以实现溶胶和凝胶的可逆变化；聚氧化乙烯-聚氧化丙烯聚合物和聚丙氨酸形成的嵌段共聚物在一定浓度下，也可以形成可注射性水凝胶。但是，现有技术制备的可注射性水凝胶的稳定性差，机械强度低等缺陷限制了其在生物医用领域的应用。

[0006] 基于酶催化交联的可注射性水凝胶由于其形成条件温和、反应速率容易控制、机械强度相对较高以及具有良好的生物相容性等优点，受到越来越多的关注。通常，在辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢（H2O2）的催化作用下，含有苯酚或者苯胺衍生物的聚合物能够形成C-C和C-O键的交联点，进而原位形成水凝胶。

[0007] 目前，基于酶催化交联的水凝胶主要集中在天然的多糖和蛋白质上，如葡萄糖、透明质酸、壳聚糖、藻酸盐、纤维素及明胶等。但天然聚合物成分单一，性能难以调控。

发明内容

[0008] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供聚氨基酸接枝共聚物及其制备方法、可注射性水凝胶，该聚氨基酸接枝共聚物接枝率可控。

[0009] 本发明提供了一种聚氨基酸接枝共聚物，如式（I）所示：

[0010]

[0011] 所述-R1具有式（II）结构：

[0012]

[0013] 所述-R2具有式（III）结构：

[0014]

[0015] 其中，x，y、z与m为聚合度，3≤x≤400；3≤y≤400；0≤z≤900；30≤x+y+z≤1000。

[0016] 优选的，所述m的范围为10≤m≤300。

[0017] 本发明还提供了一种聚氨基酸接枝共聚物的制备方法，包括以下步骤：

[0018] 将酪胺、具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚、具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）与有机溶剂混合，在偶联剂的作用下，发生缩合反应，得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物；所述-R1具有式（II）结构；所述-R2具有式（III）结构；

[0019]

[0020]

[0021] 其中，x，y、z、m与n为聚合度，3≤x≤400；3≤y≤400；0≤z≤900；30≤x+y+z≤1000；n=x+y+z。

[0022] 优选的，所述酪胺与具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）的羧基的摩尔比为（0.1～0.4）：1。

[0023] 优选的，所述具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）的羧基的摩尔比为（0.1～0.4）：1。

[0024] 优选的，所述偶联剂为1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N′-二环己基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或几种。

[0025] 本发明还提供了一种可注射性水凝胶，包括式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物、水性溶剂、辣根过氧化物酶与过氧化氢；

[0026]

[0027] 所述-R1具有式（II）结构：

[0028]

[0029] 所述-R2具有式（III）结构：

[0030]

[0031] 其中，x，y、z与m为聚合度，3≤x≤400；3≤y≤400；0≤z≤900；30≤x+y+z≤1000。

[0032] 优选的，所述式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物与水性溶剂混合为含聚氨基酸接枝共聚物2～30wt%的第一混合溶液。

[0033] 优选的，所述辣根过氧化物酶与水性溶剂混合为0.01mg/mL～2.0mg/mL的第二混合溶液。

[0034] 优选的，所述过氧化氢与水性溶剂混合为0.1mmol/L～200mmol/L的第三混合溶液。本发明提供了一种聚氨基酸接枝共聚物及其制备方法、可注射性水凝胶，将酪胺、具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚、式（V）结构的聚（L-谷氨酸）与有机溶剂混合，在偶联剂的作用下，发生缩合反应，即可得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物。与现有天然聚合物相比，本发明以具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）为主链，其在一定程度上能够模拟天然蛋白质和多肽，具有良好的生物相容性和降解性；该接枝聚合物具有式（II）结构的支链，其含有苯酚结构并且可以调节不同的接枝率，能够在辣根过氧化物酶和过氧化氢的作用下交联，形成条件温和，反应速率容易控制，因此能够制备得到机械强度较高的可注射性水凝胶；并且该接枝共聚物也包含式（III）结构的支链，还可调节不同的接枝率，从而使式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物具有良好的水溶性。

附图说明

[0035] 图1为本发明实施例5中制备得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物的核磁共振氢谱图；

[0036] 图2为本发明实施例6中制备得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物的核磁共振氢谱图；

[0037] 图3为本发明实施例7中制备得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物的核磁共振氢谱图；

[0038] 图4为本发明实施例8中制备得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物的核磁共振氢谱图；

[0039] 图5为本发明实施例7中制备得到的可注射性水凝胶凝胶时间随辣根过氧化物酶浓度变化曲线图；

[0040] 图6为本发明实施例7中制备得到的可注射性水凝胶凝胶时间随辣根过氧化物酶浓度变化曲线图；

[0041] 图7为本发明实施例7中制备得到的可注射性水凝胶凝胶时间随辣根过氧化物酶浓度变化曲线图；

[0042] 图8为本发明实施例8中制备得到的可注射性水凝胶凝胶时间随辣根过氧化物酶浓度变化曲线图；

[0043] 图9为本发明实施例8中制备得到的可注射性水凝胶凝胶时间随过氧化氢浓度变化曲线；

[0044] 图10为本发明实施例8中制备得到的可注射性水凝胶动态力学测试图。

具体实施方式

[0045] 本发明提供了一种聚氨基酸接枝共聚物，如式（I）所示：

[0046]

[0047] 所述-R1具有式（II）结构：

[0048]

[0049] 所述-R2具有式（III）结构：

[0050]

[0051] 其中，x，y、z与m为聚合度；3≤x≤400，优选为6≤x≤300，更优选为15≤x≤210；3≤y≤400，优选为6≤y≤300，更优选为15≤y≤210；0≤z≤900，优选为5≤z≤788，更优选为10≤z≤570；30≤x+y+z≤1000，优选为50≤x+y+z≤800，更优选为100≤x+y+z≤600；所述m的范围优选为10≤m≤300，更优选为10≤m≤227。

[0052] 按照本发明，所述R1的重量优选为聚氨基酸接枝共聚物重量的2%～15%，更优选为5%～15%；所述R2的重量优选为聚氨基酸接枝共聚物重量的50%～80%，更优选为60%～70%。

[0053] 本发明聚氨基酸接枝聚合物具有式（II）结构的支链，其含有苯酚结构并且可以调节不同的接枝率，能够在辣根过氧化物酶和过氧化氢的作用下交联，形成条件温和，反应速率容易控制，因此能够制备得到机械强度较高的可注射性水凝胶；并且该接枝共聚物也包含式（III）结构的支链，还可调节不同的接枝率，从而使式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物具有良好的水溶性。

[0054] 本发明还提供了上述式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物的制备方法，包括以下步骤：

[0055] 将酪胺、具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚、具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）与有机溶剂混合，在偶联剂的作用下，发生缩合反应，得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物。

[0056]

[0057] 其中，m与n为聚合物，所述m同上所述，在此不再赘述；所述n=x+y+z。

[0058] 本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

[0059] 本发明聚氨基酸接枝共聚物以具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）为主链，其在一定程度上能够模拟天然蛋白质和多肽，具有良好的生物相容性和降解性。本发明中具有（V）结构的聚（L-谷氨酸）优选按照以下方法进行制备：以正己胺和/或三乙胺为引发剂，将γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐在第一有机溶剂中发生开环聚合反应，然后进行苄基脱保护，得到具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）。

[0060] 所述γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐优选按照以下方法进行制备：γ-苄基-L-谷氨酸酯与双（三氯甲基）碳酸酯进行环化反应，得到γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。所述环化反应优选在无水条件下在第二有机溶剂中进行，所述第二有机溶剂为本领域技术人员熟知的可溶解γ-苄基-L-谷氨酸酯与双（三氯甲基）碳酸酯的有机溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为四氢呋喃；所述γ-苄基-L-谷氨酸酯、双（三氯甲基）碳酸酯与第二有机溶剂优选按照1g：（0.6～0.8）g：（10～15）ml的比例混合；所述环化反应的温度优选为30℃～70℃，更优选为40℃～60℃；所述环化反应的时间优选为0.5～3h，更优选为1～3h；该环化反应优选在惰性气体保护的条件下进行；所述惰性气体为本领域技术人员熟知的惰性气体即可，并无特殊的限制，本发明中优选为氮气。本发明对γ-苄基-L-谷氨酸酯、双（三氯甲基）碳酸酯与第二有机溶剂的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

[0061] 环化反应之后，优选进行提纯处理。所述提纯的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，本发明优选用冷石油醚或正己烷进行沉降，过滤抽干，将固体用乙酸乙酯溶解，冷水洗涤多次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，过滤后用乙酸乙酯和正己烷重结晶，固体真空干燥12～48h，得到γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。

[0062] 本发明以正己胺和/或三乙胺为引发剂，将γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐在第一有机溶剂中发生开环聚合反应。其中，所述引发剂与γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐的摩尔比优选为1：（50～800），更优选为1：（100～600）；所述第一有机溶剂为本领域技术人员熟知的可以溶解正己胺、三乙胺与γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐的有机溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为N,N-二甲基甲酰胺、氯仿与二氧六环中的一种或几种；所述开环聚合反应的温度优选为0℃～40℃，更优选为10℃～30℃；所述开环聚合反应的时间优选为24～72h，更优选为48～72h；本发明中该开环聚合反应优选在惰性气体的保护下进行，该惰性气体优选为氮气。

[0063] 开环聚合反应之后，优选进行纯化处理。该纯化处理优选用乙醚进行沉降，抽滤，得到聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）。

[0064] 得到聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）之后，进行苄基脱保护。本发明对苄基脱保护的方法并没有特殊的限制，可为本领域技术人员熟知的脱去苄基或苄氧羰基的方法即可，本发明优选采用以下方法进行：将得到的聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）用二氯乙酸溶解后，加入氢溴酸与醋酸的混合溶液，室温反应，得到具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）。其中，所述聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）、二氯乙酸与氢溴酸与醋酸混合溶液的比例优选为1g：（5～15）ml：（1～5）ml；所述氢溴酸与醋酸的混合溶液中氢溴酸的体积分数优选为20%～40%；该室温反应的时间优选为1～2h；室温反应之后，优选进行提纯处理，将反应液在乙醚中进行沉降，过滤，将固体溶于N,N-二甲基亚砜中，用相应大小分子量的透析袋在水中透析三天，冻干后得到具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）。

[0065] 将具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）、酪胺、具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与有机溶剂混合，在偶联剂的作用下，发生缩合反应。其中所述具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）的羧基的摩尔比优选为（0.1～0.4）：1，更优选为（0.12～0.38）：1，再优选为（0.15～0.35）：1；所述酪胺与具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）的羧基的摩尔比优选为（0.1～0.4）：1，更优选为（0.12～0.38）：1，再优选为（0.15～0.35）：1；所述偶联剂与具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）的羧基的摩尔比优选为（0.25～
0.8）：1，更优选为（0.3～0.7）：1；本发明中优选以1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N′-二环己基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或几种为偶联剂；所述有机溶剂为本领域技术人员熟知的能够溶解具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）、酪胺、具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与偶联剂的有机溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种。

[0066] 本发明中，上述原料优选按照以下加料顺序进行：将具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）与偶联剂溶于有机溶剂中，室温反应4～12h，再加入酪胺与具有式（IV）结构聚乙二醇单甲醚进行缩合反应。

[0067] 本发明中缩合反应的温度优选为20℃～60℃，更优选为30℃～50℃；所述缩合反应的时间优选为24～72h，更优选为36～56h。

[0068] 缩合反应之后，优选进行纯化处理，将反应液用相应大小分子量的透析袋在水中透析，优选透析2～4天，冷冻干燥后得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物。

[0069] 本发明将不同投料比的酪胺、具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与具有式（V）结构的聚（L-谷氨酸）通过缩合反应，得到不同接枝率的式（I）所示的聚氨基酸接枝聚合物，其可作为具有酶催化交联功能的聚合物凝胶材料，具有良好的水溶性、可调控的成凝胶速率及交联强度，在生物医用领域具有广泛的应用前景。

[0070] 本发明还提供了一种可注射性水凝胶，包括式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物、水性溶剂、辣根过氧化物酶与过氧化氢；其中，所述式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物同上所述，在此不再赘述。

[0071] 可注射性水凝胶中，所述式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物与水性溶剂混合形成混合溶液，优选其与水性溶剂混合为2～30wt%的第一混合溶液，更优选为5%～28%，再优选为8%～25%。

[0072] 本发明可注射性水凝胶中，所述辣根过氧化物酶与过氧化氢均以水性溶剂混合的形式存在。其中，所述辣根过氧化物酶优选与与水性溶剂混合为0.01mg/mL～2.0mg/mL的第二混合溶液，更优选为0.02mg/ml～1.5mg/ml，再优选为0.05mg/ml～1mg/ml；所述过氧化氢优选与水性溶剂混合为0.1mmol/L～200mmol/L的第三混合溶液，更优选为0.2mmol/L～150mmol/L，再优选为0.5mmol/L～100mmol/L。

[0073] 所述水性溶剂为本领域技术人员熟知的水性溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。

[0074] 本发明中，将式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物、辣根过氧化物酶及过氧化氢分别溶于水性溶剂中，得到相应的水溶液，然后将水溶液混合，能够形成C-C和C-O键的交联点，快速形成水凝胶，并可以通过调节酪氨的接枝率、式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物的浓度、辣根过氧化物酶的浓度与过氧化氢的浓度对形成凝胶时间和凝胶的机械强度进行调节；同时，由于式（I）所示的聚氨酸接枝共聚物含有聚乙二醇单甲醚支链，因此具有良好的水溶性。综上所述，本发明提供的水凝胶具有形成条件温和、反应速率容易控制以及机械强度便于调控的优点，并且具有生物相容性和可降解性，可用于生物医用材料领域，尤其在药物控释及组织工程等方面具有广阔的应用前景。

[0075] 为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的聚氨基酸接枝共聚物及其制备方法、可注射性水凝胶进行详细描述。

[0076] 以下实施例中所用的试剂均为市售。

[0077] 实施例1

[0078] 1.1将10g数均分子量为1000的聚乙二醇单甲醚与100ml甲苯于140℃共沸除水，然后减压除去甲苯，加入50ml二氯甲烷溶解得到聚乙二醇单甲醚溶液。在0℃、无水的条件下，在聚乙二醇单甲醚溶液中缓慢加入8ml三乙胺和16ml甲基磺酰氯，0℃反应2h，升至室温搅拌反应24h，反应结束后过滤除去沉淀物，滤液用乙醚沉降，过滤得到固体，室温真空干燥24h后，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。

[0079] 1.2将5g1.1中得到的甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯和5g氯化铵溶于250ml氨水中，室温反应72h，反应结束后，用氯化钠饱和反应液，然后用二氯甲烷萃取反应产物，得到的有机相用质量分数为5%的氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液浓缩后用乙醚沉降，过滤，得到的固体真空干燥24h，得到具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚。

[0080] 1.3将150ml干燥后的四氢呋喃加至干燥的反应瓶中，在氮气气氛下，加入10gγ-苄基-L-谷氨酸酯与6g三光气，在氮气保护下，于55℃反应2～3h，反应液澄清后，室温搅拌30min，然后用冷石油醚进行沉淀，过滤抽干，将固体用乙酸乙酯溶解，冷水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜。过滤除去硫酸镁后，将滤液转至干燥的反应瓶中，用乙酸乙酯和正己烷重结晶三次，固体真空干燥24h，得到γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。

[0081] 1.4将2g1.3中得到的γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于20ml已除水的N,N-二甲基甲酰胺中，加入25μL正己胺作为引发剂，在氮气保护的条件下，室温搅拌反应72h，反应结束后，用乙醚沉降，固体真空干燥24h，得到聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）。

[0082] 1.5将1g1.4中得到的聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）溶解于10ml二氯乙酸中，待完全溶解后，加入3ml体积分数为33%氢溴酸的醋酸溶液，室温脱保护反应2h，反应结束后，用乙醚沉降，抽滤后的产物用二甲基亚砜溶解后移入透析袋，透析三天，冷冻干燥，得到聚（L-谷氨酸）。通过核磁计算，其分子量为4600。

[0083] 1.6将1g1.5中得到的聚（L-谷氨酸）溶于50ml二甲基亚砜，然后加入0.35g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl（点在中间，下同））与0.22g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化羧基24h，再加入1g1.2中得到的具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与0.16g酪胺，室温反应24h后，反应液移入透析袋中，透析三天，冷冻干燥，得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物。

[0084] 1.7将1.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物配制成质量浓度为6%～20%的磷酸盐缓冲溶液为第一溶液；将过氧化氢配制成2.45～49mmol/L的磷酸盐缓冲溶液为第二溶液；将辣根过氧化物酶配制成0.0156～0.5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液为第三溶液；将200μL第一溶液、50μL第二溶液、50μL第三溶液充分混合，得到可注射性水凝胶。
采用小管倒置法观察成凝胶情况，以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化。

[0085] 利用核磁共振对1.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物进行分析，得到结果为：聚乙二醇单甲醚的接枝率为12%，酪胺的接枝率为10%，产率为87%。

[0086] 实施例2

[0087] 2.1将10g数均分子量为1000的聚乙二醇单甲醚与100ml甲苯于140℃共沸除水，然后减压除去甲苯，加入50ml二氯甲烷溶解得到聚乙二醇单甲醚溶液。在0℃、无水的条件下，在聚乙二醇单甲醚溶液中缓慢加入8ml三乙胺和16ml甲基磺酰氯，0℃反应2h，升至室温搅拌反应24h，反应结束后过滤除去沉淀物，滤液用乙醚沉降，过滤得到固体，室温真空干燥24h后，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。

[0088] 2.2将5g2.1中得到的甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯和5g氯化铵溶于250ml氨水中，室温反应72h，反应结束后，用氯化钠饱和反应液，然后用二氯甲烷萃取反应产物，得到的有机相用质量分数为5%的氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液浓缩后用乙醚沉降，过滤，得到的固体真空干燥24h，得到具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚。

[0089] 2.3将150ml干燥后的四氢呋喃加至干燥的反应瓶中，在氮气气氛下，加入10gγ-苄基-L-谷氨酸酯与6g三光气，在氮气保护下，于55℃反应2～3h，反应液澄清后，室温搅拌30min，然后用冷石油醚进行沉淀，过滤抽干，将固体用乙酸乙酯溶解，冷水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜。过滤除去硫酸镁后，将滤液转至干燥的反应瓶中，用乙酸乙酯和正己烷重结晶三次，固体真空干燥24h，得到γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。

[0090] 2.4将2g2.3中得到的γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于20ml已除水的N,N-二甲基甲酰胺中，加入25μL正己胺作为引发剂，在氮气保护的条件下，室温搅拌反应72h，反应结束后，用乙醚沉降，固体真空干燥24h，得到聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）。

[0091] 2.5将1g2.4中得到的聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）溶解于10ml二氯乙酸中，待完全溶解后，加入3ml体积分数为33%氢溴酸的醋酸溶液，室温脱保护反应2h，反应结束后，用乙醚沉降，抽滤后的产物用二甲基亚砜溶解后移入透析袋，透析三天，冷冻干燥，得到聚（L-谷氨酸）。通过核磁计算，其分子量为4600。

[0092] 2.6将1g2.5中得到的聚（L-谷氨酸）溶于50ml二甲基亚砜，然后加入0.48g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）与0.29g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化羧基24h，再加入1.24g2.2中得到的具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与
0.22g酪胺，室温反应24h后，反应液移入透析袋中，透析三天，冷冻干燥，得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物。

[0093] 2.7将2.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物配制成质量浓度为6%～20%的磷酸盐缓冲溶液为第一溶液；将过氧化氢配制成2.45～49mmol/L的磷酸盐缓冲溶液为第二溶液；将辣根过氧化物酶配制成0.0156～0.5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液为第三溶液；将200μL第一溶液、50μL第二溶液、50μL第三溶液充分混合，采用小管倒置法观察成凝胶情况，得到可注射性凝胶。以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化。

[0094] 利用核磁共振对2.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物进行分析，得到结果为：聚乙二醇单甲醚的接枝率为15%，酪胺的接枝率为16%，产率为84%。

[0095] 实施例3

[0096] 3.1将10g数均分子量为2000的聚乙二醇单甲醚与100ml甲苯于140℃共沸除水，然后减压除去甲苯，加入50ml二氯甲烷溶解得到聚乙二醇单甲醚溶液。在0℃、无水的条件下，在聚乙二醇单甲醚溶液中缓慢加入4ml三乙胺和8ml甲基磺酰氯，0℃反应2h，升至室温搅拌反应24h，反应结束后过滤除去沉淀物，滤液用乙醚沉降，过滤得到固体，室温真空干燥24h后，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。

[0097] 3.2将5g3.1中得到的甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯和5g氯化铵溶于250ml氨水中，室温反应72h，反应结束后，用氯化钠饱和反应液，然后用二氯甲烷萃取反应产物，得到的有机相用质量分数为5%的氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液浓缩后用乙醚沉降，过滤，得到的固体真空干燥24h，得到具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚。

[0098] 3.3将150ml干燥后的四氢呋喃加至干燥的反应瓶中，在氮气气氛下，加入10gγ-苄基-L-谷氨酸酯与6g三光气，在氮气保护下，于55℃反应2～3h，反应液澄清后，室温搅拌30min，然后用冷石油醚进行沉淀，过滤抽干，将固体用乙酸乙酯溶解，冷水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜。过滤除去硫酸镁后，将滤液转至干燥的反应瓶中，用乙酸乙酯和正己烷重结晶三次，固体真空干燥24h，得到γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。

[0099] 3.4将2g3.3中得到的γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于20ml已除水的N,N-二甲基甲酰胺中，加入6μL正己胺作为引发剂，在氮气保护的条件下，室温搅拌反应72h，反应结束后，用乙醚沉降，固体真空干燥24h，得到聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）。

[0100] 3.5将1g3.4中得到的聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）溶解于10ml二氯乙酸中，待完全溶解后，加入3ml体积分数为33%氢溴酸的醋酸溶液，室温脱保护反应2h，反应结束后，用乙醚沉降，抽滤后的产物用二甲基亚砜溶解后移入透析袋，透析三天，冷冻干燥，得到聚（L-谷氨酸）。通过核磁计算，其分子量为21000。

[0101] 3.6将1g3.5中得到的聚（L-谷氨酸）溶于50ml二甲基亚砜，然后加入0.45g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）与0.27g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化羧基24h，再加入2.32g3.2中得到的具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与
0.2g酪胺，室温反应24h后，反应液移入透析袋中，透析三天，冷冻干燥，得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物。

[0102] 3.7将3.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物配制成质量浓度为6%～20%的磷酸盐缓冲溶液为第一溶液；将过氧化氢配制成2.45～49mmol/L的磷酸盐缓冲溶液为第二溶液；将辣根过氧化物酶配制成0.0156～0.5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液为第三溶液；将200μL第一溶液、50μL第二溶液、50μL第三溶液充分混合，采用小管倒置法观察成凝胶情况，以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化。

[0103] 利用核磁共振对3.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物进行分析，得到结果为：聚乙二醇单甲醚的接枝率为16%，酪胺的接枝率为14%，产率为89%。

[0104] 实施例4

[0105] 4.1将10g数均分子量为2000的聚乙二醇单甲醚与100ml甲苯于140℃共沸除水，然后减压除去甲苯，加入50ml二氯甲烷溶解得到聚乙二醇单甲醚溶液。在0℃、无水的条件下，在聚乙二醇单甲醚溶液中缓慢加入4ml三乙胺和8ml甲基磺酰氯，0℃反应2h，升至室温搅拌反应24h，反应结束后过滤除去沉淀物，滤液用乙醚沉降，过滤得到固体，室温真空干燥24h后，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。

[0106] 4.2将5g4.1中得到的甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯和5g氯化铵溶于250ml氨水中，室温反应72h，反应结束后，用氯化钠饱和反应液，然后用二氯甲烷萃取反应产物，得到的有机相用质量分数为5%的氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液浓缩后用乙醚沉降，过滤，得到的固体真空干燥24h，得到具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚。

[0107] 4.3将150ml干燥后的四氢呋喃加至干燥的反应瓶中，在氮气气氛下，加入10gγ-苄基-L-谷氨酸酯与6g三光气，在氮气保护下，于55℃反应2～3h，反应液澄清后，室温搅拌30min，然后用冷石油醚进行沉淀，过滤抽干，将固体用乙酸乙酯溶解，冷水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜。过滤除去硫酸镁后，将滤液转至干燥的反应瓶中，用乙酸乙酯和正己烷重结晶三次，固体真空干燥24h，得到γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。

[0108] 4.4将2g4.3中得到的γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于20ml已除水的N,N-二甲基甲酰胺中，加入6μL正己胺作为引发剂，在氮气保护的条件下，室温搅拌反应72h，反应结束后，用乙醚沉降，固体真空干燥24h，得到聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）。

[0109] 4.5将1g4.4中得到的聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）溶解于10ml二氯乙酸中，待完全溶解后，加入3ml体积分数为33%氢溴酸的醋酸溶液，室温脱保护反应2h，反应结束后，用乙醚沉降，抽滤后的产物用二甲基亚砜溶解后移入透析袋，透析三天，冷冻干燥，得到聚（L-谷氨酸）。通过核磁计算，其分子量为21000。

[0110] 4.6将1g4.5中得到的聚（L-谷氨酸）溶于50ml二甲基亚砜，然后加入0.60g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）与0.36g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化羧基24h，再加入3.1g4.2中得到的具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与
0.27g酪胺，室温反应24h后，反应液移入透析袋中，透析三天，冷冻干燥，得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物。

[0111] 4.7将4.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物配制成质量浓度为6%～20%的磷酸盐缓冲溶液为第一溶液；将过氧化氢配制成2.45～49mmol/L的磷酸盐缓冲溶液为第二溶液；将辣根过氧化物酶配制成0.0156～0.5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液为第三溶液；将200μL第一溶液、50μL第二溶液、50μL第三溶液充分混合，采用小管倒置法观察成凝胶情况，以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化。

[0112] 利用核磁共振对4.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物进行分析，得到结果为：聚乙二醇单甲醚的接枝率为21%，酪胺的接枝率为19%，产率为82%。

[0113] 实施例5

[0114] 5.1将10g数均分子量为2000的聚乙二醇单甲醚与100ml甲苯于140℃共沸除水，然后减压除去甲苯，加入50ml二氯甲烷溶解得到聚乙二醇单甲醚溶液。在0℃、无水的条件下，在聚乙二醇单甲醚溶液中缓慢加入4ml三乙胺和8ml甲基磺酰氯，0℃反应2h，升至室温搅拌反应24h，反应结束后过滤除去沉淀物，滤液用乙醚沉降，过滤得到固体，室温真空干燥24h后，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。

[0115] 5.2将5g5.1中得到的甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯和5g氯化铵溶于250ml氨水中，室温反应72h，反应结束后，用氯化钠饱和反应液，然后用二氯甲烷萃取反应产物，得到的有机相用质量分数为5%的氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液浓缩后用乙醚沉降，过滤，得到的固体真空干燥24h，得到具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚。

[0116] 5.3将150ml干燥后的四氢呋喃加至干燥的反应瓶中，在氮气气氛下，加入10gγ-苄基-L-谷氨酸酯与6g三光气，在氮气保护下，于55℃反应2～3h，反应液澄清后，室温搅拌30min，然后用冷石油醚进行沉淀，过滤抽干，将固体用乙酸乙酯溶解，冷水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜。过滤除去硫酸镁后，将滤液转至干燥的反应瓶中，用乙酸乙酯和正己烷重结晶三次，固体真空干燥24h，得到γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。

[0117] 5.4将2g5.3中得到的γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于20ml已除水的二氧六环中，加入4μL三乙胺作为引发剂，在氮气保护的条件下，室温搅拌反应72h，反应结束后，用乙醚沉降，固体真空干燥24h，得到聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）。

[0118] 5.5将1g5.4中得到的聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）溶解于10ml二氯乙酸中，待完全溶解后，加入3ml体积分数为33%氢溴酸的醋酸溶液，室温脱保护反应2h，反应结束后，用乙醚沉降，抽滤后的产物用二甲基亚砜溶解后移入透析袋，透析三天，冷冻干燥，得到聚（L-谷氨酸）。通过粘度法测试，其分子量为110000。

[0119] 5.6将1g5.5中得到的聚（L-谷氨酸）溶于50ml二甲基亚砜，然后加入0.45g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）与0.27g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化羧基24h，再加入2.32g5.2中得到的具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与
0.20g酪胺，室温反应24h后，反应液移入透析袋中，透析三天，冷冻干燥，得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物。

[0120] 5.7将5.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物配制成质量浓度为6%～20%的磷酸盐缓冲溶液为第一溶液；将过氧化氢配制成2.45～49mmol/L的磷酸盐缓冲溶液为第二溶液；将辣根过氧化物酶配制成0.0156～0.5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液为第三溶液；将200μL第一溶液、50μL第二溶液、50μL第三溶液充分混合，采用小管倒置法观察成凝胶情况，以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化。

[0121] 利用核磁共振对5.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物进行分析，得到其核磁共振氢谱图，如图1所示；得到结果为：聚乙二醇单甲醚的接枝率为14%，酪胺的接枝率为15%，产率为79%。

[0122] 实施例6

[0123] 6.1将10g数均分子量为2000的聚乙二醇单甲醚与100ml甲苯于140℃共沸除水，然后减压除去甲苯，加入50ml二氯甲烷溶解得到聚乙二醇单甲醚溶液。在0℃、无水的条件下，在聚乙二醇单甲醚溶液中缓慢加入4ml三乙胺和8ml甲基磺酰氯，0℃反应2h，升至室温搅拌反应24h，反应结束后过滤除去沉淀物，滤液用乙醚沉降，过滤得到固体，室温真空干燥24h后，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。

[0124] 6.2将5g6.1中得到的甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯和5g氯化铵溶于250ml氨水中，室温反应72h，反应结束后，用氯化钠饱和反应液，然后用二氯甲烷萃取反应产物，得到的有机相用质量分数为5%的氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液浓缩后用乙醚沉降，过滤，得到的固体真空干燥24h，得到具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚。

[0125] 6.3将150ml干燥后的四氢呋喃加至干燥的反应瓶中，在氮气气氛下，加入10gγ-苄基-L-谷氨酸酯与6g三光气，在氮气保护下，于55℃反应2～3h，反应液澄清后，室温搅拌30min，然后用冷石油醚进行沉淀，过滤抽干，将固体用乙酸乙酯溶解，冷水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜。过滤除去硫酸镁后，将滤液转至干燥的反应瓶中，用乙酸乙酯和正己烷重结晶三次，固体真空干燥24h，得到γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。

[0126] 6.4将2g6.3中得到的γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于20ml已除水的二氧六环中，加入4μL三乙胺作为引发剂，在氮气保护的条件下，室温搅拌反应72h，反应结束后，用乙醚沉降，固体真空干燥24h，得到聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）。

[0127] 6.5将1g6.4中得到的聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）溶解于10ml二氯乙酸中，待完全溶解后，加入3ml体积分数为33%氢溴酸的醋酸溶液，室温脱保护反应2h，反应结束后，用乙醚沉降，抽滤后的产物用二甲基亚砜溶解后移入透析袋，透析三天，冷冻干燥，得到聚（L-谷氨酸）。通过粘度法测试，其分子量为110000。

[0128] 6.6将1g6.5中得到的聚（L-谷氨酸）溶于50ml二甲基亚砜，然后加入0.60g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）与0.36g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化羧基24h，再加入3.1g6.2中得到的具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与
0.27g酪胺，室温反应24h后，反应液移入透析袋中，透析三天，冷冻干燥，得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物。

[0129] 6.7将6.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物配制成质量浓度为6%～20%的磷酸盐缓冲溶液为第一溶液；将过氧化氢配制成2.45～49mmol/L的磷酸盐缓冲溶液为第二溶液；将辣根过氧化物酶配制成0.0156～0.5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液为第三溶液；将200μL第一溶液、50μL第二溶液、50μL第三溶液充分混合，采用小管倒置法观察成凝胶情况，以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化。

[0130] 利用核磁共振对6.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物进行分析，得到其核磁共振氢谱图，如图2所示；得到结果为：聚乙二醇单甲醚的接枝率为21%，酪胺的接枝率为20%，产率为85%。

[0131] 实施例7

[0132] 7.1将10g数均分子量为2000的聚乙二醇单甲醚与100ml甲苯于140℃共沸除水，然后减压除去甲苯，加入50ml二氯甲烷溶解得到聚乙二醇单甲醚溶液。在0℃、无水的条件下，在聚乙二醇单甲醚溶液中缓慢加入4ml三乙胺和8ml甲基磺酰氯，0℃反应2h，升至室温搅拌反应24h，反应结束后过滤除去沉淀物，滤液用乙醚沉降，过滤得到固体，室温真空干燥24h后，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。

[0133] 7.2将5g7.1中得到的甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯和5g氯化铵溶于250ml氨水中，室温反应72h，反应结束后，用氯化钠饱和反应液，然后用二氯甲烷萃取反应产物，得到的有机相用质量分数为5%的氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液浓缩后用乙醚沉降，过滤，得到的固体真空干燥24h，得到具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚。

[0134] 7.3将150ml干燥后的四氢呋喃加至干燥的反应瓶中，在氮气气氛下，加入10gγ-苄基-L-谷氨酸酯与6g三光气，在氮气保护下，于55℃反应2～3h，反应液澄清后，室温搅拌30min，然后用冷石油醚进行沉淀，过滤抽干，将固体用乙酸乙酯溶解，冷水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜。过滤除去硫酸镁后，将滤液转至干燥的反应瓶中，用乙酸乙酯和正己烷重结晶三次，固体真空干燥24h，得到γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。

[0135] 7.4将2g7.3中得到的γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于20ml已除水的二氧六环中，加入4μL三乙胺作为引发剂，在氮气保护的条件下，室温搅拌反应72h，反应结束后，用乙醚沉降，固体真空干燥24h，得到聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）。

[0136] 7.5将1g7.4中得到的聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）溶解于10ml二氯乙酸中，待完全溶解后，加入3ml体积分数为33%氢溴酸的醋酸溶液，室温脱保护反应2h，反应结束后，用乙醚沉降，抽滤后的产物用二甲基亚砜溶解后移入透析袋，透析三天，冷冻干燥，得到聚（L-谷氨酸）。通过粘度法测试，其分子量为110000。

[0137] 7.6将1g7.5中得到的聚（L-谷氨酸）溶于50ml二甲基亚砜，然后加入0.74g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）与0.45g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化羧基24h，再加入3.9g7.2中得到的具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与
0.34g酪胺，室温反应24h后，反应液移入透析袋中，透析三天，冷冻干燥，得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物。

[0138] 7.7将7.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物配制成质量浓度为6%～20%的磷酸盐缓冲溶液为第一溶液；将过氧化氢配制成2.45～49mmol/L的磷酸盐缓冲溶液为第二溶液；将辣根过氧化物酶配制成0.0156～0.5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液为第三溶液；将200μL第一溶液、50μL第二溶液、50μL第三溶液充分混合，采用小管倒置法观察成凝胶情况，以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化。

[0139] 当聚氨基酸接枝共聚物质量浓度为5%，过氧化氢浓度为4.9mmol/L时，得到可注射性水凝胶凝胶时间随辣根过氧化物酶浓度变化曲线，如图5所示。由图5可知，该聚氨基酸接枝共聚物能够快速形成水凝胶，且成凝胶时间可调控。

[0140] 当聚氨基酸接枝共聚物质量浓度为10%，过氧化氢浓度为4.9mmol/L时，得到可注射性水凝胶凝胶时间随辣根过氧化物酶浓度变化曲线，如图6所示。由图6可知，该聚氨基酸接枝共聚物能够快速形成水凝胶，且成凝胶时间可调控。

[0141] 当聚氨基酸接枝共聚物质量浓度为15%，过氧化氢浓度为4.9mmol/L时，得到可注射性水凝胶凝胶时间随辣根过氧化物酶浓度变化曲线，如图7所示。由图7可知，该聚氨基酸接枝共聚物能够快速形成水凝胶，且成凝胶时间可调控。

[0142] 利用核磁共振对7.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物进行分析，得到其核磁共振氢谱图，如图3所示；得到结果为：聚乙二醇单甲醚的接枝率为26%，酪胺的接枝率为24%，产率为86%。

[0143] 实施例8

[0144] 8.1将10g数均分子量为2000的聚乙二醇单甲醚与100ml甲苯于140℃共沸除水，然后减压除去甲苯，加入50ml二氯甲烷溶解得到聚乙二醇单甲醚溶液。在0℃、无水的条件下，在聚乙二醇单甲醚溶液中缓慢加入4ml三乙胺和8ml甲基磺酰氯，0℃反应2h，升至室温搅拌反应24h，反应结束后过滤除去沉淀物，滤液用乙醚沉降，过滤得到固体，室温真空干燥24h后，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。

[0145] 8.2将5g8.1中得到的甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯和5g氯化铵溶于250ml氨水中，室温反应72h，反应结束后，用氯化钠饱和反应液，然后用二氯甲烷萃取反应产物，得到的有机相用质量分数为5%的氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液浓缩后用乙醚沉降，过滤，得到的固体真空干燥24h，得到具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚。

[0146] 8.3将150ml干燥后的四氢呋喃加至干燥的反应瓶中，在氮气气氛下，加入10gγ-苄基-L-谷氨酸酯与6g三光气，在氮气保护下，于55℃反应2～3h，反应液澄清后，室温搅拌30min，然后用冷石油醚进行沉淀，过滤抽干，将固体用乙酸乙酯溶解，冷水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜。过滤除去硫酸镁后，将滤液转至干燥的反应瓶中，用乙酸乙酯和正己烷重结晶三次，固体真空干燥24h，得到γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。

[0147] 8.4将2g8.3中得到的γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于20ml已除水的二氧六环中，加入4μL三乙胺作为引发剂，在氮气保护的条件下，室温搅拌反应72h，反应结束后，用乙醚沉降，固体真空干燥24h，得到聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）。

[0148] 8.5将1g8.4中得到的聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）溶解于10ml二氯乙酸中，待完全溶解后，加入3ml体积分数为33%氢溴酸的醋酸溶液，室温脱保护反应2h，反应结束后，用乙醚沉降，抽滤后的产物用二甲基亚砜溶解后移入透析袋，透析三天，冷冻干燥，得到聚（L-谷氨酸）。通过粘度法测试，其分子量为110000。

[0149] 8.6将1g8.5中得到的聚（L-谷氨酸）溶于50ml二甲基亚砜，然后加入0.89g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）与0.53g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化羧基24h，再加入4.6g8.2中得到的具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与
0.4g酪胺，室温反应24h后，反应液移入透析袋中，透析三天，冷冻干燥，得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物。

[0150] 8.7将8.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物配制成质量浓度为6%～20%的磷酸盐缓冲溶液为第一溶液；将过氧化氢配制成2.45～49mmol/L的磷酸盐缓冲溶液为第二溶液；将辣根过氧化物酶配制成0.0156～0.5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液为第三溶液；将200μL第一溶液、50μL第二溶液、50μL第三溶液充分混合，采用小管倒置法观察成凝胶情况，以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化。

[0151] 当聚氨基酸接枝共聚物质量浓度为10%，过氧化氢浓度为24.5mmol/L时，得到可注射性水凝胶凝胶时间随辣根过氧化物酶浓度变化曲线，如图8所示。由图8可知，该聚氨基酸接枝共聚物能够快速形成水凝胶，且成凝胶时间可调控。

[0152] 当聚氨基酸接枝共聚物质量浓度为10%，辣根过氧化物酶浓度为0.5mg/ml时，得到可注射性水凝胶凝胶时间随过氧化氢浓度变化曲线，如图9所示。由图9可知，该聚氨基酸接枝共聚物能够快速形成水凝胶，且成凝胶时间可调控。

[0153] 当聚氨基酸接枝共聚物质量浓度为10%，辣根过氧化物酶浓度为0.5mg/ml，过氧化氢浓度为24.5mmol/L时，利用流变仪测量可注射水凝胶立体储能模量随时间的变化情况，得到其动态力学测试图，如图10所示。由图10可知，该聚氨基酸接枝共聚物能够快速形成水凝胶，且凝胶强度可调控。

[0154] 利用核磁共振对8.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物进行分析，得到其核磁共振氢谱图，如图4所示；得到结果为：聚乙二醇单甲醚的接枝率为31%，酪胺的接枝率为29%，产率为76%。

[0155] 实施例9

[0156] 9.1将10g数均分子量为5000的聚乙二醇单甲醚与100ml甲苯于140℃共沸除水，然后减压除去甲苯，加入50ml二氯甲烷溶解得到聚乙二醇单甲醚溶液。在0℃、无水的条件下，在聚乙二醇单甲醚溶液中缓慢加入1.6ml三乙胺和3.2ml甲基磺酰氯，0℃反应2h，升至室温搅拌反应24h，反应结束后过滤除去沉淀物，滤液用乙醚沉降，过滤得到固体，室温真空干燥24h后，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。

[0157] 9.2将5g9.1中得到的甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯和5g氯化铵溶于250ml氨水中，室温反应72h，反应结束后，用氯化钠饱和反应液，然后用二氯甲烷萃取反应产物，得到的有机相用质量分数为5%的氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液浓缩后用乙醚沉降，过滤，得到的固体真空干燥24h，得到具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚。

[0158] 9.3将150ml干燥后的四氢呋喃加至干燥的反应瓶中，在氮气气氛下，加入10gγ-苄基-L-谷氨酸酯与6g三光气，在氮气保护下，于55℃反应2～3h，反应液澄清后，室温搅拌30min，然后用冷石油醚进行沉淀，过滤抽干，将固体用乙酸乙酯溶解，冷水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜。过滤除去硫酸镁后，将滤液转至干燥的反应瓶中，用乙酸乙酯和正己烷重结晶三次，固体真空干燥24h，得到γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。

[0159] 9.4将2g9.3中得到的γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于20ml已除水的二氧六环中，加入4μL三乙胺作为引发剂，在氮气保护的条件下，室温搅拌反应72h，反应结束后，用乙醚沉降，固体真空干燥24h，得到聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）。

[0160] 9.5将1g9.4中得到的聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）溶解于10ml二氯乙酸中，待完全溶解后，加入3ml体积分数为33%氢溴酸的醋酸溶液，室温脱保护反应2h，反应结束后，用乙醚沉降，抽滤后的产物用二甲基亚砜溶解后移入透析袋，透析三天，冷冻干燥，得到聚（L-谷氨酸）。通过粘度法测试，其分子量为110000。

[0161] 9.6将1g9.5中得到的聚（L-谷氨酸）溶于50ml二甲基亚砜，然后加入0.6g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）与0.36g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化羧基24h，再加入7.75g9.2中得到的具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与
0.27g酪胺，室温反应24h后，反应液移入透析袋中，透析三天，冷冻干燥，得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物。

[0162] 9.7将9.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物配制成质量浓度为6%～20%的磷酸盐缓冲溶液为第一溶液；将过氧化氢配制成2.45～49mmol/L的磷酸盐缓冲溶液为第二溶液；将辣根过氧化物酶配制成0.0156～0.5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液为第三溶液；将200μL第一溶液、50μL第二溶液、50μL第三溶液充分混合，采用小管倒置法观察成凝胶情况，以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化。

[0163] 利用核磁共振对9.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物进行分析，得到结果为：聚乙二醇单甲醚的接枝率为19%，酪胺的接枝率为20%，产率为81%。

[0164] 实施例10

[0165] 10.1将10g数均分子量为5000的聚乙二醇单甲醚与100ml甲苯于140℃共沸除水，然后减压除去甲苯，加入50ml二氯甲烷溶解得到聚乙二醇单甲醚溶液。在0℃、无水的条件下，在聚乙二醇单甲醚溶液中缓慢加入1.6ml三乙胺和3.2ml甲基磺酰氯，0℃反应2h，升至室温搅拌反应24h，反应结束后过滤除去沉淀物，滤液用乙醚沉降，过滤得到固体，室温真空干燥24h后，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。

[0166] 10.2将5g10.1中得到的甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯和5g氯化铵溶于250ml氨水中，室温反应72h，反应结束后，用氯化钠饱和反应液，然后用二氯甲烷萃取反应产物，得到的有机相用质量分数为5%的氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，滤液浓缩后用乙醚沉降，过滤，得到的固体真空干燥24h，得到具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚。

[0167] 10.3将150ml干燥后的四氢呋喃加至干燥的反应瓶中，在氮气气氛下，加入10gγ-苄基-L-谷氨酸酯与6g三光气，在氮气保护下，于55℃反应2～3h，反应液澄清后，室温搅拌30min，然后用冷石油醚进行沉淀，过滤抽干，将固体用乙酸乙酯溶解，冷水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜。过滤除去硫酸镁后，将滤液转至干燥的反应瓶中，用乙酸乙酯和正己烷重结晶三次，固体真空干燥24h，得到γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。

[0168] 10.4将2g10.3中得到的γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于20ml已除水的二氧六环中，加入4μL三乙胺作为引发剂，在氮气保护的条件下，室温搅拌反应72h，反应结束后，用乙醚沉降，固体真空干燥24h，得到聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）。

[0169] 10.5将1g10.4中得到的聚（γ-苄基-L-谷氨酸酯）溶解于10ml二氯乙酸中，待完全溶解后，加入3ml体积分数为33%氢溴酸的醋酸溶液，室温脱保护反应2h，反应结束后，用乙醚沉降，抽滤后的产物用二甲基亚砜溶解后移入透析袋，透析三天，冷冻干燥，得到聚（L-谷氨酸）。通过粘度法测试，其分子量为110000。

[0170] 10.6将1g10.5中得到的聚（L-谷氨酸）溶于50ml二甲基亚砜，然后加入1.0g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）与0.55g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化羧基24h，再加入11.6g10.2中得到的具有式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚与
0.4g酪胺，室温反应24h后，反应液移入透析袋中，透析三天，冷冻干燥，得到式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物。

[0171] 10.7将10.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物配制成质量浓度为6%～20%的磷酸盐缓冲溶液为第一溶液；将过氧化氢配制成2.45～49mmol/L的磷酸盐缓冲溶液为第二溶液；将辣根过氧化物酶配制成0.0156～0.5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液为第三溶液；将200μL第一溶液、50μL第二溶液、50μL第三溶液充分混合，采用小管倒置法观察成凝胶情况，以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化。

[0172] 利用核磁共振对10.6中得到的式（I）所示的聚氨基酸接枝共聚物进行分析，得到结果为：聚乙二醇单甲醚的接枝率为31%，酪胺的接枝率为32%，产率为87%。

[0173] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。