一种黄龙病菌DNA的快速提取方法

摘要

本发明公开了一种黄龙病菌DNA快速提取方法，包括从感染黄龙病的柑橘叶片、根部、长春花叶片中依次通过冷冻抽干、研磨、加入适量NaOH和石英沙再次研磨、高速离心、无水乙醇沉淀几个步骤将黄龙病菌的DNA分离。本发明简便、安全、快速、成本低廉，提取的DNA溶液可直接用做巢式PCR和定量PCR检测的模板，适用于感染黄龙病的柑橘叶片、根部、长春花叶片等各种组织中黄龙病菌DNA提取，同时本提取方法无需使用Tris饱和酚、氯仿等具有强腐蚀性试剂，可有效保证人身安全。

权利要求

1. 一种黄龙病菌 DNA 的快速提取方法，其特征在于：从感染黄龙病的柑橘叶片、根部、长春花叶片中依次通过冷冻抽干、研磨、加入适量 NaOH 和石英沙再次研磨、高速离心、无水乙醇沉淀几个步骤将黄龙病菌的DNA分离；

包括以下步骤：

（1） 取 0.4 g 叶片中脉或根部样品，剪碎后放入 1.5mL 离心管，冷冻抽干， 用研磨仪磨成粉末；

（2）加入500 μL 0.5 M NaOH 及适量石英沙，放置摇床上 200转/分钟充分混匀 1 小时以上 ；

（3） 沸水浴中放置30 s，取出后加入500 μL 0.5 M pH 8.0 的 Tris-HCl，颠倒混匀数次12000 rpm 离心 10 min ；

（4）取上清液，加入 2 倍体积无水乙醇和 1/10 体积 3 M pH 5.2 醋酸钠沉淀核酸，-20 ℃放置 0.5 h以上 ；

（5）12000 rpm 离心 10 min，弃上清 ；

（6）加入70％的乙醇清洗沉淀，12000 rpm 离心 30 s，弃上清；

（7）重复步骤（6）一次；

（8）12000 rpm离心 2 min， 吸干后自然晾干，然后加入 30~50 μL TE bufer 或 ddH2O溶解，即可得到黄龙病菌DNA。

说明书

一种黄龙病菌DNA的快速提取方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种黄龙病菌DNA快速提取方法，适用于感染黄龙病的柑橘叶片、根部、长春花叶片等各种组织中黄龙病菌DNA提取。

背景技术

[0002] 柑橘黄龙病又称黄梢病，现已在世界上包括亚洲、非洲和美洲的40多个国家和地区发生与流行。我国种植柑橘的19个省中已有11个省（直辖市）的柑橘遭到黄龙病为害，受害面积占柑橘总的栽培面积的80％以上。该病害的病原菌是一种韧皮部杆菌属细菌，可分为3个菌系，亚洲菌系（Candidatus Liberobacter asiaticus），非洲菌系（CandidatusLiberibacter africanus）和美洲菌系（Candidatus Liberobacter amercanus）。该病主要是通过嫁接及带病苗木的进行传播，所以必然严格检疫制度，杜绝和消灭病源是根本措施。目前，国内外普遍利用现代分子生物学方法进行柑橘黄龙病的检测，主要有常规PCR、定量PCR和巢式PCR 3种检测方法。但是无论用哪种PCR方法检测，它都需要以黄龙病菌的DNA作为模板，首先要提取黄龙病菌DNA，而目前采用的提取方法均需使用Tris饱和酚和氯仿等具有强腐蚀性试剂，有可能危害人身安全，而且试验成本高。

发明内容

[0003] 本发明的目的是在减轻黄龙病菌DNA提取过程中对人体的伤害的基础上提高效率，简化提取步骤，为黄龙病的PCR检测提供有效保障。

[0004] 为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：

[0005] 一种黄龙病菌DNA的快速提取方法，其特征在于：从感染黄龙病的柑橘叶片、根部、长春花叶片中依次通过冷冻抽干、研磨、加入适量NaOH和石英沙再次研磨、高速离心、无水乙醇沉淀几个步骤将黄龙病菌的DNA分离。

[0006] 具体包括以下步骤：

[0007] （1）取0.4 g叶片中脉或根部样品，剪碎后放入1．5mL离心管，冷冻抽干，用研磨仪磨成粉末；

[0008] （2）加入500 μL 0.5 M NaOH及适量石英沙，放置摇床上200转/分钟充分混匀1小时以上；

[0009] （3）沸水浴中放置30 s，取出后加入500 μL 0.5 M pH 8.0的Tris-HCl，颠倒混匀数次，12000 rpm离心 10 min；

[0010] （4）取上清液，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积3 M pH 5.2 醋酸钠沉淀核酸，-20 ℃放置0.5 h以上；

[0011] （5）12000 rpm离心10 min，弃上清；

[0012] （6）加入70％的乙醇清洗沉淀，12000 rpm离心30 s，弃上清；

[0013] （7）重复步骤（6）一次；

[0014] （8）12000 rpm离心2 min，吸干后自然晾干，然后加入30~50 μL TE bufer或ddH2O溶解，即可得到黄龙病菌DNA。

[0015] 本发明的有益效果是：通过在样品中加入适量石英沙研磨加速黄龙病菌细胞裂解，使核酸充分释放出来，从而有效提高黄龙病菌DNA得率；不同于常规DNA提取方法，无需使用Tris饱和酚和氯仿等具有强腐蚀性试剂，可有效保证人身安全，同时大大节约了试验成本。

附图说明

[0016] 图1为黄龙病菌DNA凝胶电泳检测结果，其中M: marker，1-17: 不同感染黄龙病的柑橘叶片样品，“ ”: 黄龙病菌DNA。

[0017] 图2为 nest PCR扩增结果。

具体实施方式

[0018] 以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明不止限于此。

[0019] 实施例1

[0020] 供试样品为福州市晋安区埔党省农科院果树研究所试验地采集的具有典型黄龙病症状的柑橘叶片，从中提取黄龙病菌DNA，具体操作如下：

[0021] （1）取0.4 g叶片中脉，剪碎后放入1．5mL离心管，冷冻抽干，用研磨仪磨成粉末；

[0022] （2）加入500 μL 0.5 M NaOH及适量石英沙，放置摇床上200转/分钟充分混匀1小时以上；

[0023] （3）沸水浴中放置30 s，取出后加入500 μL 0.5 M pH 8.0的Tris-HCl，颠倒混匀数次，12000 rpm离心 10 min；

[0024] （4）取上清液，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积3 M pH 5.2 醋酸钠沉淀核酸，-20 ℃放置0.5 h以上；

[0025] （5）12000 rpm离心10 min，弃上清；

[0026] （6）加入70％的乙醇清洗沉淀，12000 rpm离心30 s，弃上清；

[0027] （7）重复步骤（6）一次；

[0028] （8）12000 rpm离心2 min，吸干后自然晾干，然后加入30~50 μL TE bufer溶解，即可得到黄龙病菌DNA。

[0029] 实验结果：

[0030] （1）黄龙病菌DNA浓度检测

[0031] 提取的黄龙病菌DNA浓度检测结果，见表1。

[0032]

[0033] 由表1可知，用上述方法提取的DNA浓度为98.6-1028.1 ng/μl，纯度（A260nm/A280nm）为1.51-1.99，完全符合后续的PCR检测要求。

[0034] （2）黄龙病菌DNA凝胶电泳检测

[0035] 提取的黄龙病菌DNA进行凝胶电泳检测，结果如图1所示。由图1可知，样品1、2、3、4、7和16号在箭头所指的位置均有一条明显的亮带，说明这些样品的DNA均有提到，其余样品在箭头所指处未看到明显的条带可能是由于提取的浓度偏低，跑胶无法检测出来的缘故。

[0036] （3）黄龙病菌DNA的nest PCR扩增

[0037] 以提取的黄龙病菌DNA为模板，进行nest PCR扩增，结果如图2所示。由图2可知，除4号样品外，其余样品均能扩增到与目的片段大小一致（798bp）的条带，说明上述方法提取的黄龙病菌DNA完全可用于nest PCR检测。