具备双向启动子诱捕及质粒拯救功能的双元Ti质粒及其构建方法

摘要

本发明涉及一种植物及部分真菌T?DNA转化和T?DNA插入突变体库构建所使用的双元Ti质粒载体及其构建方法。首先，在质粒T?DNA区的两端都整合了绿色荧光蛋白报告基因sGFP的启动子捕获模块，并对两端sGFP开放阅读框之前的核酸序列进行了优化调整；其次，质粒拯救的功能模块也通过酶切位点整合到目标质粒中；最后，质粒整合了用于筛选转化子的潮霉素抗性基因，并且该基因及其启动子可以通过Sac I酶切位点进行自由替换，以适应不同的筛选目的和物种。双元Ti质粒载体的选择及其各模块的配置和优化会对转基因的效率、基因克隆及相关基因功能验证的便利性产生很大的影响。通过将多种质粒功能模块有机的整合到一个质粒上，既扩大了质粒的适用范围，又提高了筛选及克隆目标功能基因的效率，为找寻有益基因及其功能验证提供了一个很好的分子工具。

权利要求

1.一种通过农杆菌介导的可用于大丽轮枝菌T-DNA转化和T-DNA插入突变体库构建的Ti质粒，即双向启动子诱捕质粒1300-LBsGFP-HYG-Cm-ori-RBsGFP，其特征在于：在T-DNA区域的左边界和右边界附近，均含有绿色荧光蛋白sGFP为报告基因的启动子捕获序列，以提高在大丽轮枝菌中克隆有益基因或靶标基因的效率；该双向启动子诱捕质粒的构建方法如下：A.对pCAMBIA 1300原始质粒的左边界进行改造，去除原CaMV35S启动子驱动的潮霉素抗性模块；利用引物对pCAMBIA 1300原始质粒进行左边界序列的扩增，将PCR扩增产物通过BstX I和Sac II酶切位点整合到pCAMBIA 1300质粒上，即得到1300左边界改造质粒；

B.分别利用两对引物，对gGFP质粒进行PCR扩增，分别得到两条各1kb大小的无启动子的sGFP表达盒；经测序验证无误后，分别采用BstX I、Sac II和Pme I、HindIII酶切位点将两个片段连接到1300左边界改造质粒的左边界和右边界上，得到1300-LBsGFP-RBsGFP质粒；另外，在该质粒两端的sGFP开放阅读框之前的核酸序列进行了优化调整，以尽可能的减少在sGFP的起始密码子ATG之前出现相同读码方式的终止密码子，从而最大可能的提高了报告基因sGFP表达的概率；

C.将来源于pCB1004质粒的氯霉素抗性盒以及colE1质粒复制子位点作为质粒拯救模块加入到1300-LBsGFP-RBsGFP质粒上，即首先通过引物从pCB1004质粒上获得氯霉素抗性盒以及colE1复制起始位点片段，然后将该片段克隆至pMD18T载体上进行测序验证；验证正确后，用BamH I和Sal I位点将目标片段切下，并通过相同的酶切位点整合到1300-LBsGFP-RBsGFP质粒上，获得1300-LBsGFP-Cm-ori-RBsGFP质粒；

D.利用1300-HYG-sGFP质粒为模板，通过引物进行PCR后获得包括启动子、编码序列和终止子序列的潮霉素抗性盒；连接T载体测序验证正确后，将该序列通过Sac I位点整合到

1300-LBsGFP-Cm-ori-RBsGFP质粒上，获得最终的双向启动子诱捕质粒1300-LBsGFP-HYG-Cm-ori-RBsGFP。

说明书

具备双向启动子诱捕及质粒拯救功能的双元Ti质粒及其构建

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种植物及部分真菌T-DNA转化和T-DNA插入突变体库构建所使用的双元Ti质粒载体及其构建方法，属于分子品种改良及转基因技术领域。

背景技术

[0002] 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种革兰氏阴性细菌，它能够通过感染植物伤口，将其Ti质粒(Tumor inducing plasmid)上一段含有植物激素和冠瘿碱合成酶基因的DNA转移并整合至受体植物的基因组中，最终诱发植物产生肿瘤。经研究发现，Ti质粒中存在2个独立的区域：一个是T-DNA区(transferred DNA region)，含致瘤基因；另一个是vir区(virlence region)，在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。基于Ti质粒的结构特点，将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，在T-DNA区域加入适当的选择标记和多克隆位点，并使其能在农杆菌和大肠杆菌中复制，这个改造后的载体被称为双元Ti载体。此外，vir区被重新整合到一个已经除去T-DNA的Ti质粒中，在农杆菌中作为辅助质粒，通过反式激活使T-DNA整合到植物细胞基因组中。双元Ti载体从最早的利用至今已有20年，期间发展了十多个系列几十种载体，已成为植物、真菌基因工程中最重要的转化载体。

[0003] 利用根癌农杆菌介导的植物以及部分真菌的遗传转化方法是目前广泛使用的也是最重要的转基因技术手段。通过这一技术，结合其它的分子生物学方法，既可以实现对某个基因的克隆和功能研究，也可以将优秀的外源基因导入所研究的生物材料，实现对生物品种的改良。其中，双元Ti质粒载体的选择及其各模块的配置和优化将会对转基因的效率、基因克隆及相关功能研究的便利性产生很大的影响。为了增加现有双元Ti质粒的功能及其适用范围，本专利将多种质粒功能模块(包括启动子捕获模块，质粒拯救模块)整合到一个载体上，以提高对真菌及植物功能基因克隆和研究的效率和准确率。

[0004] 在真核生物的基因组中，有很多区域都是不含基因或者不影响基因表达的，而T-DNA整合到基因组的位置又是随机的，由此造成了很多的无表型或无意义的T-DNA插入，导致后续的突变表型筛选工作十分繁琐。采用启动子捕获技术(Promoter Trap)的质粒载体则可以很大程度上缓解这一问题。该技术是在双元Ti质粒载体的T-DNA区域的边界附近构建一个无启动子的报告基因，该模块和选择标记基因一起组成捕获载体。T-DNA区两侧的报告基因只要插入到受启动子启动的区域或与未知基因发生正确的融合表达，该报告基因就被激活，而有报告基因表达的转基因材料将得到优先研究。这项技术由于可以避免无意义的插入突变，已经在动物、植物、真菌和细菌的功能基因克隆当中得到了广泛的应用。传统的启动子捕获载体通常都只在T-DNA区边界的一端有一个启动子捕获模块，而为了提高启动子捕获的成功率，本专利在载体T-DNA区的两端都整合了无启动子的绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，以下简称sGFP)报告基因的捕获模块，并对两端sGFP开放阅读框之前的核酸序列进行了优化调整，以尽可能的减少在sGFP的起始密码子ATG之前出现相同读码方式的终止密码子(包括：TAA、TGA和TAG)，从而最大可能的提高了报告基因sGFP表达的概率。

[0005] 质粒拯救技术(Plasmid rescue)是指在T-DNA区域加上一个质粒复制起始位点和一个抗生素选择标记，使得当整个或部分T-DNA区域自我环化时，可以作为一个独立的质粒在大肠杆菌中复制和保存。利用这一特点，就可以很方便的获取到T-DNA插入位点的侧翼序列：采用合适的限制性内切酶消化含有T-DNA插入的基因组DNA后，直接用连接酶对酶切产物进行连接自环化，然后将连接产物转化大肠杆菌，通过对应抗性筛选获得阳性克隆，最后，将提取的质粒进行测序分析即可得到T-DNA的侧翼序列。质粒拯救的方法可以比较直接，不受分离侧翼序列的分子量大小的制约，其目的性和准确性都很强，作为一种克隆基因的方法被广泛用于果蝇、真菌、哺乳动物和拟南芥中。通过该技术，可以便捷地获得单拷贝、甚至多拷贝插入的T-DNA侧翼序列。

发明内容

[0006] 传统的用于突变体库构建的T-DNA插入载体要么没有启动子捕获模块，要么只有一个，而且也很少出现启动子捕获模块和质粒拯救模块同时出现在一个载体当中的情况。而本发明为了提高启动子捕获的成功率，将双元载体T区的左右边界都进行了改造，使得左右边界同时具有启动子捕获的功能；另外，还将左右边界sGFP开放阅读框之前的核酸序列进行了优化调整，尽可能的减少在sGFP的起始密码子ATG之前出现相同读码方式的终止密码子(包括：TAA、TGA和TAG)，以达到增加成功捕获启动子的概率。时为方便获取T-DNA插入位点的侧翼序列，质粒拯救(plasmid rescue)功能也被加入到改造的载体当中。这样，使得原本功能单一的双元Ti质粒载体在重新改造过后，同时具备了多项功能。另外，为了便于应用于植物材料或者替换不同的抗生素筛选标记，抗生素抗性基因及其启动子模块也可以通过Sac I酶切位点进行自由替换。

[0007] 构建该载体的技术路线如下：

[0008] 1.将具有质粒的大肠杆菌菌株活化、摇菌，并提取质粒。

[0009] 2.对pCAMBIA1300原始质粒的左边界进行改造，去除原来的CaMV35S启动子驱动的潮霉素抗性模块。之后将聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，以下简称PCR)扩增的不含启动子的sGFP+终止子序列分别整合到1300左边界改造载体的左边界和右边界，获得1300-LBsGFP-RBsGFP。

[0010] 3.将质粒拯救模块加入到1300-LBsGFP-RBsGFP载体上。质粒拯救载体模块包括氯霉素抗性序列盒和colE1来源的复制起始位点，获得1300-LBsGFP-Cm-ori-RBsGFP质粒。

[0011] 4.通过PCR获得潮霉素抗性盒(包括启动子、编码序列和终止子)序列，将该序列通过Sac I位点整合到1300-LBsGFP-Cm-ori-RBsGFP质粒上，获得最终的质粒载体1300-LBsGFP-HYG-Cm-ori-RBsGFP。

[0012] 本质粒的有益效果是提高了启动子捕获的成功率，并可以利用质粒拯救功能获方便准确地获得T区插入位点的侧翼序列。另外，也可以很方便的利用载体上的酶切位点，更换选择标记基因及其启动子，从而增加本质粒载体的适用范围。

附图说明

[0013] 图1.双向启动子诱捕质粒载体1300-LBsGFP-HYG-Cm-ori-RBsGFP构建流程示意图。

[0014] 图2.大丽轮枝菌转化子在50μg/ml潮霉素PDA平板上生长。

[0015] 图3.双向诱捕质粒载体1300-LBsGFP-HYG-Cm-ori-RBsGFP荧光功能模块的验证。选择了具有代表性的6个菌株进行荧光观察和拍照，分别是：A.54D11；B.59D7；C.54F3；
D.54G3；E.60C7；F.1B4。荧光观察时，显微镜设定参数如下：曝光时间1.5秒，增益2倍。

[0016] 图4.双向诱捕质粒载体1300-LBsGFP-HYG-Cm-ori-RBsGFP质粒拯救功能模块的验证。A图为两个T-DNA插入位点的右边界的核苷酸序列比对分析；B图为两个T-DNA插入位点在大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)第5号染色体上的位置。序列分析网址：http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/verticillium_dahliae/MultiHome.html

具体实施方式

[0017] 1.双向诱捕载体1300-LBGFP-HYG-Cm-ori-RBGFP的构建步骤实例，按照各模块的整合顺序，结合附图和表1，将流程描述如下：

[0018] A.将原始pCAMBIA1300质粒载体上潮霉素抗性基因CaMV35S启动子替换为TrpC启动子，并将gGFP上的sGFP表达模块整合到该载体上，就获得了1300-HYG-sGFP质粒。将上述所有相关质粒转化到大肠杆菌DH5a中，并保存于-80℃冰箱。使用时，将具有所需质粒载体的大肠杆菌菌株活化、摇菌，并提取质粒。

[0019] B.对pCAMBIA1300原始质粒的左边界进行改造，去除原CaMV35S启动子驱动的潮霉素抗性模块。利用引物1对pCAMBIA1300原始质粒进行左边界序列的扩增，将PCR扩增产物(约300bp，详见序列1)连接至T载体上进行测序，结果正确后用内切酶BstX I和Sac II将目的片段切下。同时，用相同的酶对pCAMBIA1300原始质粒进行酶切，并回收较大片段的核酸序列(即质粒的基本骨架约6.6kb)，将该骨架和上述PCR产物用核酸连接酶进行连接，得到1300左边界改造质粒(6.9kb，详见序列2)。

[0020] C.分别利用引物2和引物3，对gGFP质粒进行PCR扩增，分别得到两条各1kb大小的无启动子的sGFP表达盒(sGFP基因+终止子，详见序列3和4)。经测序验证无误后，分别采用BstX I、Sac II和Pme I、HindIII酶切位点将两个片段连接到1300左边界改造质粒的左边界和右边界上，得到约8.7kb的1300-LBsGFP-RBsGFP质粒(详见序列5)。

[0021] D.将来源于pBC1004质粒的氯霉素抗性盒以及质粒复制子位点作为质粒拯救模块加入到1300-LBsGFP-RBsGFP载体上。首先通过引物4从pBC1004质粒上获得氯霉素抗性盒以及colE1复制起始位点片段(约2kb，详见序列6)，然后将该片段克隆至pMD18T载体上进行测序验证。验证正确后，用BamH I和Sal I位点将目标片段切下，并通过相同的酶切位点整合到1300-LBsGFP-RBsGFP质粒上，获得约11kb大小的1300-LBsGFP-Cm-ori-RBsGFP质粒(详见序列7)。

[0022] E.以申请人之前构建的1300-HYG-sGFP质粒为模板，通过引物5进行PCR后获得潮霉素抗性盒(包括启动子、编码序列和终止子)序列，约1.5kb(详见序列8)。连接T载体测序验证正确后，将该序列通过Sac I位点整合到1300-LBsGFP-Cm-ori-RBsGFP质粒上，获得最终的质粒载体1300-LBsGFP-HYG-Cm-ori-RBsGFP(即双向启动子诱捕载体，大小约为12.3kb，详见序列9)。

[0023] F.利用引物6、引物7分别对构建好的质粒载体进行T区的左边界区和右边界区的测序，测序完成后将两个区域进行拼接，最终获得完整的1300-LBsGFP-HYG-Cm-ori-RBsGFP质粒T-DNA区域的核酸序列。测序结果表明，所得载体各个模块位置和顺序与预期的最终目的载体完全一致(图1)。

[0024] 2.双向启动子诱捕载体应用实例

[0025] 将构建好的质粒载体进行了突变体库的构建，同时，对载体的不同功能模块进行了功能验证，结果表明，与我们当初设计的预期完全一致。

[0026] A.利用构建好的1300-LBsGFP-HYG-Cm-ori-RBsGFP质粒，结合农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT)，对从棉花当中分离的土传植物病原真菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)进行了T-DNA插入突变体库的构建，目前已经获得了超过6000个的T-DNA插入转化子。通过对其中20个转化子的基因组DNA的PCR鉴定，均能够检测到载体T-DNA区域的片段，说明改造后载体的T区在转化过程中可以和其原始载体一样，能够正常的转移、整合到受体基因组当中。另外，转化子能够在浓度为50μg/ml潮霉素PDA平板上生长，说明潮霉素抗性基因盒模块功能正常(图2)。

[0027] B.6000个T-DNA插入转化子突变体库构建完成后，申请人随机选取了1000个转化子，培养于液体察氏培养基当中，25℃，150rpm培养一周后，在荧光显微镜下逐个进行荧光观察，最终找到了19个带有荧光的转化子，其中，申请人选出了6个具有荧光的材料作为代表(图3)。所用荧光显微镜及其配置为Nikon ECLIPSE80i(东京，日本)，拍摄CCD型号为Nikon Digital Camera DS-Fil(东京，日本)，高压汞灯光源型号为Nikon C-SHG1(东京，日本)，激发光波长为450～490纳米。拍摄荧光时，显微镜设定参数如下：曝光时间1.5秒，增益2倍。

[0028] C.双向诱捕质粒载体1300-LBsGFP-HYG-Cm-ori-RBsGFP中有质粒拯救模块，该模块可以快速准确地获得T-DNA插入的基因组侧翼序列，申请人对该模块的功能进行了也验证(图4)。一个随机选择的T-DNA插入突变转化子2B6被选择进行了质粒拯救。将转化子2B6接种到液体PDA培养基中，25℃，150rpm培养；一周后，收集菌丝体，用CTAB法提取基因组DNA，经琼脂糖电泳检测和紫外分光光度计检测基因组质量；取适量基因组DNA进行BamH I彻底酶切，然后试剂盒回收酶切产物(试剂盒名称)；取适量回收产物，加入T4DNA连接酶，16℃连接反应24小时；最后，取适量连接产物进行大肠杆菌的转化，将转化后的大肠杆菌涂布于含有10μg/ml氯霉素的固体LB培养基平板上，37℃培养24小时，提取阳性克隆的质粒。用引物8对氯霉素筛选长出的单克隆进行PCR扩增并测序，获得T-DNA右边界区旁侧序列，结果表明，2B6突变体中含有两个T-DNA插入拷贝，而且它们的插入位点靠的很近，仅相差9个核苷酸(图4)。A图为两个T-DNA插入位点的右边界的核苷酸序列比对分析；B图为两个T-DNA插入位点在大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)第5号染色体上的位置。序列分析网址：http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/verticillium_dahliae/MultiHome.html。

[0029] 表1.具体实施方式中所使用到的各引物列表及其相关说明

[0030]

[0031] 注：下划线“_”表示酶切位点。