一种发酵法生产番茄红素的方法

摘要

本发明提供了一种发酵法生产番茄红素的方法，该方法采用三孢布拉氏霉菌（+）和三孢布拉氏霉菌（-）菌株，通过斜面培养：在26-28℃培养箱中培养6-7天；种子培养36-46h后，发酵培养，第一次加入甜菜碱于26-28℃，200-250r/min的条件下发酵培养100-120h，在发酵42h时加阻断剂，同时第二次加入甜菜碱，至发酵结束。过滤发酵液收集湿菌体，经真空冷冻干燥后得到含番茄红素的干菌体。本发明加入甜菜碱后能有效促进菌体的呼吸链系统，提高菌体的氧消耗速率；同时能有效的缓解菌体在发酵过程中受到的渗透压呼吸抑制，加快氧的传递速率，降低能耗；提高了菌体生长率和番茄红素的含量，降低了生产成本。本发明方法操作简单，甜菜碱无任何毒副作用，使用方便、安全，适于工业化生产，有较大的应用价值。

权利要求

1.一种发酵法生产番茄红素的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

1)斜面培养

采用PDA培养基，取去皮马铃薯20g，切成小块，加水1000毫升煮沸20分钟，滤去马铃薯块，滤液加入2g葡萄糖，0.3g K2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.8mg VB1，2g琼脂，溶解后定溶至100ml，倒入试管，115℃灭菌20min，趁热摆斜面，制得固体PDA培养基；分别取三孢布拉氏霉菌(+)和三孢布拉氏霉菌(-)菌株划斜面，在26-28℃培养箱中培养6-7天；

2)种子培养

种子培养基组成为：玉米粉30-60g/L, 黄豆粉18-30g/L, KH2PO4 0.5-2g/L, MgSO4·7H2O 0.5-2g/L，VBl 0.001-0.02g/L, pH 6.5；种子培养基按50-80ml每瓶分装至4个500ml的三角瓶中，8层纱布封口，115℃灭菌20分钟，接种时，三孢布拉氏霉菌(+)和三孢布拉氏霉菌(-)斜面试管各用10ml无菌生理盐水洗下孢子，经玻璃珠打散并过滤后制成孢子悬液；三孢布拉氏霉菌(+)菌孢子悬液每次取1ml接入1瓶种子培养基中；三孢布拉氏霉菌(-)菌孢子悬液每次取4ml，依次接入3瓶种子培养基中，在26-28℃，180-200r/min的条件下培养36-46h，分别得到1瓶三孢布拉氏霉菌(+)菌和3瓶 三孢布拉氏霉菌(-)菌种子液；

3)发酵培养

发酵培养基组成为：玉米粉15-25g/L, 黄豆粉35-50g/L, 棉籽油60-100ml/L, KH2PO4

3-7g/L, MgSO4·7H2O 0.1-2g/L，VBl 0.005-0.1 g/L, pH 6.5；发酵培养基按40-60ml每瓶分装至500ml的三角瓶中，8层纱布封口，115℃灭菌20分钟，将种子液发酵培养得到的三孢布拉氏霉菌“+”菌种培养液和“-”菌种培养液以1:3的比例混合得到混合种子液，含发酵培养基的三角瓶每瓶分别转接5-10ml的混合种子液，含发酵培养基的三角瓶中第一次加入甜菜碱，于26-28℃，200-250r/min的条件下发酵培养100-120h，发酵42h时三角瓶中加阻断剂，同时第二次加入甜菜碱，发酵结束，用纱布过滤发酵液收集湿菌体，经真空冷冻干燥后得到含番茄红素的干菌体；

所述步骤(3)第一次甜菜碱的加入量为发酵培养基接种前发酵培养基体积的

0.05-7g/L；第二次甜菜碱的加入量为发酵42h时发酵液体积的0.1-3.5g/L；所述甜菜碱选自一水甜菜碱、无水甜菜碱或盐酸盐甜菜碱；所述步骤(3)阻断剂为烟碱或咪唑，阻断剂的加入量为发酵液体积的0.7-1.0mg/ml。

2.根据权利要求1所述的一种发酵法生产番茄红素的方法，其特征在于，所述步骤(3)甜菜碱为盐酸盐甜菜碱。

3.根据权利要求1所述的一种发酵法生产番茄红素的方法，其特征在于，所述步骤(3)第一次甜菜碱的加入量为发酵培养基接种 前发酵培养基体积的1.5-4.5g/L；第二次甜菜碱的加入量为发酵42h时发酵液体积的1-2g/L。

4.根据权利要求1所述的一种发酵法生产番茄红素的方法，其特征在于，所述步骤(3)阻断剂为咪唑，加入量为发酵液体积的0.8mg/ml。

说明书

一种发酵法生产番茄红素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程，具体涉及发酵工程，尤其涉及一种发酵法生产番茄红素的方法。

背景技术

[0002] 番茄红素是一种类胡萝卜素，作为植物所含的一种天然色素，主要存在于茄科植物西红柿的成熟果实中。研究证明番茄红素具有提高人体免疫力、抗癌、抗氧化、降血脂、保护皮肤等功效。随着人们越来越注重绿色、健康，番茄红素不断受到人们的广泛关注，但是，作为功能性天然色素的番茄红素，人类自身不能合成，需通过膳食等方式补充。据美国CMR（客户管理关系）国际公司预测，番茄红素产品销售将年增35%，预计两三年内到达200亿美元的销售量，世界跨国医药巨头和国内的医药巨头们纷纷进军番茄红素产业。

[0003] 当前番茄红素的生产方法主要有天然提取、化学合成、微生物发酵等。目前，已证实天然番茄红素比化学合成的番茄红素更易吸收，而且，化学合成化学物残留的存在，因此，近年来已转向天然产品的开发。从植物原料中提取天然番茄红素易受到条件和产率限制，而微生物发酵法生产天然番茄红素从品质、技术、资源、成本及环境等因素考虑均优于上述两种方法，因而更具应用前景。目前利用微生物发酵法生产番茄红素的不足之处是微生物不能高水平的积累番茄红素，导致发酵产率低、生产成本较高。利用基因工程菌生产番茄红素尚处于实验室阶段，距离工业化生产尚有很大差距，因而，工业上利用发酵促进剂等方式来优化发酵条件，仍是提高番茄红素产量的主要方式。

[0004] 目前工业上主要是利用三孢布拉霉菌发酵生产番茄红素。三孢布拉霉菌是一种高嗜氧菌，发酵过程对氧的需求很大；所使用的培养基固形物含量高、粘度大，使菌体所处外部环境的渗透压增加，而且培养基中还含有8%左右的植物油（为代谢提供双键），致使发酵系统的溶氧速率较低；同时生产过程中往往受到转速等因素的影响菌体聚集成团，导致氧呼吸受阻，造成代谢异常、生物量和代谢产物量降低。为改进此缺陷，已有专利报道在发酵培养基中加入液态烷烃、活性炭来增加氧气含量（CN101555490A）。但是，液态烷烃添加浓度过大会对菌体造成伤害，后期分离提取也要经过脱毒处理，操作繁琐。添加活性炭也存在增加了设备动力损耗、易堵塞管道、前期处理及后提前工序繁琐等问题。

[0005] 甜菜碱，又名N,N,N-三甲基甘氨酸，是一种季胺型水溶性生物碱。因最初从甜菜中提取而得名甜菜碱，纯品为白色片状结晶，有甜味，易吸潮，可速溶于水，易被消化吸收，使用安全，无毒副作用。大量的研究已经证明，在微生物发酵中，甜菜碱除了可以作为甲基供体，参与甲基化反应以及能提高代谢途径中关键酶的酶活，来加快菌体生长速率及代谢物产量外，还能调节细胞膜透性，促进微生物的呼吸链系统，能显著提高菌体的呼吸特性。此外，甜菜碱作为广泛应用的渗透压保护剂，能够调节细胞内外渗透压，降低高渗透压导致的呼吸抑制，加快氧气传递速率，降低能耗，因此是一种优良的发酵助剂。

[0006] 甜菜碱作为发酵助剂的作用已经得到广泛的证实和应用。赵琳琳等研究甜菜碱对脱氮假单胞杆菌发酵产VB12的影响证实，在脱氮假单胞菌产VB12的发酵过程中，甜菜碱显著提升了VB12的产量，其原因，一是甜菜碱对菌体的氧利用有快速的刺激作用，缓解高渗透压对细胞呼吸代谢的刺激作用；二是甜菜碱能提高VB12合成途径关键酶的活性。甜菜碱对各种氨基酸的发酵的影响在CN101235401等专利中得到证实。因而，如何利用甜菜碱提高三孢布拉氏霉菌液体深层次发酵生产番茄红素的产量是关注的热点。

发明内容

[0007] 本发明所要解决的技术问题在于提高三孢布拉氏霉菌液体深层次发酵生产番茄红素的产量，研究设计加入甜菜碱的方法。

[0008] 本发明提供了一种发酵法生产番茄红素的方法。具体地，提供了一种加入一定数量的甜菜碱，发酵法生产番茄红素的方法。

[0009] 本发明方法包括下列步骤：

[0010] 1）斜面培养

[0011] 采用PDA培养基，取去皮马铃薯20g，切成小块，加水1000毫升煮沸20分钟，滤去马铃薯块，滤液加入2g葡萄糖，0.3g K2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.8mg VB1，2g琼脂，溶解后定溶至100ml，倒入试管，115℃灭菌20min，趁热摆斜面，制得固体PDA培养基；分别取三孢布拉氏霉菌（+）和三孢布拉氏霉菌（-）菌株划斜面，在26-28℃培养箱中培养6-7天；

[0012] 2）种子培养

[0013] 种子培养基组成为：玉米 粉30-60g/L,黄豆粉18-30g/L,KH2P040.5-2g/L,MgSO4·7H2O0.5-2g/L，VBl0.001-0.02g/L,pH6.5；种子培养基按50-80ml每瓶分装至4个500ml的三角瓶中，8层纱布封口，115℃灭菌20分钟，接种时，三孢布拉氏霉菌（+）和三孢布拉氏霉菌（-）斜面试管各用10ml无菌生理盐水洗下孢子，经玻璃珠打散并过滤后制成孢子悬液；三孢布拉氏霉菌（+）菌孢子悬液每次取1ml接入1瓶种子培养基中；三孢布拉氏霉菌（-）菌孢子悬液每次取4ml，依次接入3瓶种子培养基中，在26-28℃，180-200r/min的条件下培养36-46h，分别得到1瓶三孢布拉氏霉菌（+）菌和3瓶三孢布拉氏霉菌（-）菌种子液；

[0014] 3）发酵培养

[0015] 发酵培养基组成为：玉米粉15-25g/L,黄豆粉35-50g/L,棉籽油60-100ml/L,KH2P043-7g/L,MgSO4·7H2O0.1-2g/L，VBl0.005-0.1g/L,pH6.5；发酵培养基按40-60ml每瓶分装至500ml的三角瓶中，8层纱布封口，115℃灭菌20分钟，将种子液发酵培养得到的三孢布拉氏霉菌“+”菌种培养液和“-”菌种培养液以1:3的比例混合得到混合种子液，含发酵培养基的三角瓶每瓶分别转接5-10ml的混合种子液，含发酵培养基的三角瓶中第一次加入甜菜碱，于26-28℃，200-250r/min的条件下发酵培养100-120h，发酵42h时三角瓶中加阻断剂，同时第二次加入甜菜碱，发酵结束，过滤发酵液收集湿菌体，经真空冷冻干燥后得到三孢布拉氏霉菌干菌体。

[0016] 本发明方法所述步骤（3）甜菜碱选自一水甜菜碱、无水甜菜碱或盐酸盐甜菜碱，优选盐酸盐甜菜碱。

[0017] 所述步骤（3）第一次甜菜碱的加入量为发酵培养基接种前发酵培养基体积的0.05-7g/L，优选1.5-4.5g/L；第二次甜菜碱的加入量为发酵42h时发酵液体积的0.1-3.5g/L，优选1-2g/L。

[0018] 所述步骤（3）阻断剂为烟碱或咪唑，阻断剂的加入量为发酵42h时发酵液体积的的0.7-1.0mg/ml。优选阻断剂为咪唑，加入量为发酵42h时发酵液体积的0.8mg/ml。

[0019] 本发明方法使用的菌种来源：

[0020] 本发明生产番茄红素的菌种为三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）,分三孢布拉氏霉菌“+”和三孢布拉氏霉菌“-”两种菌株，购自美国模式培养物集存库（ATCC）,菌号为14059（+）和14060（-）。

[0021] HPLC测定本发明得到的番茄红素含量比不加甜菜碱的对照组提高72%-95%。另外选择在发酵42h第二次加甜菜碱，是经过多次试验选择确定的，并且在加阻断剂的同时加入，更利于操作。

[0022] 本发明的效果在于：加入甜菜碱后能有效促进菌体的呼吸链系统，提高菌体的氧消耗速率；同时能有效的缓解菌体在发酵过程中受到的渗透压呼吸抑制，加快氧的传递速率，降低能耗；而且甜菜碱本身是一种优良的甲基供体，能有效的提供甲基参与代谢过程中的甲基化反应，从而促进并加快了菌体代谢反应速率，提高了菌体生长率和番茄红素的产量，降低了生产成本。本发明工艺操作简单，而且甜菜碱本身是由生物体在逆境条件下产生的保护剂，无任何毒副作用，使用安全。本发明方法适于工业化生产，有较大的应用价值。

具体实施方式

[0023] 以下实施例使用的菌种来源：

[0024] 本发明生产番茄红素的菌种为三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）,分三孢布拉氏霉菌“+”和三孢布拉氏霉菌“-”两种菌株，购自美国模式培养物集存库（ATCC）,菌号为三孢布拉氏霉菌）14059（+）和三孢布拉氏霉菌14060（-）。

[0025] 实施例1

[0026] ⑴种子培养

[0027] 种子培养基组成为：玉米粉47g/L,黄豆粉23g/L,KH2P040.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L，VBl0.01g/L,pH6.5。种子培养基按60ml每瓶分装至4个500ml的三角瓶中，8层纱布封口，115℃灭菌20分钟。接种时，三孢布拉氏霉菌（+）菌和三孢布拉氏霉菌（-）菌斜面每支试管统一用10ml无菌生理盐水洗下孢子，经玻璃珠打散并过滤后制成孢子悬液；三孢布拉氏霉菌（+）菌孢子悬液每次取1ml接入1瓶种子培养基中；三孢布拉氏霉菌（-）菌孢子悬液每次取4ml，依次接入3瓶种子培养基中。在26-28℃，180-200r/min的条件下培养36-44h，得到1瓶三孢布拉氏霉菌（+）菌种子液和3瓶三孢布拉氏霉菌（-）菌种子液。

[0028] ⑵发酵培养

[0029] 发酵培养基组成为：玉米粉18g/L,黄豆粉42.5g/L,棉籽油85ml/L,KH2P045.5g/L,MgSO4·7H2O1g/L，VBl0.02g/L,pH6.5。发酵培养基按50ml每瓶分装至6个500ml的三角瓶中，8层纱布封口，115℃灭菌20分钟。将种子液发酵培养得到的三孢布拉氏霉菌（+）（-）菌种培养液以1:3的比例混合得到混合种子液。6个含发酵培养基的三角瓶每瓶分别转接8ml的混合种子液，其中3个含发酵培养基的三角瓶中按1.5g/L的量加入一水甜菜碱0.075g，作为实验组。另外3个三角瓶不加甜菜碱，作为空白组。分别于26-28℃，200-250r/min的条件下发酵培养120h结束。发酵42h时加入0.046g咪唑作为阻断剂,同时实验组的3个三角瓶中按1.5g/L的量第二次加入一水甜菜碱0.087g。

[0030] ⑶含量测定

[0031] 番茄红素含量测定（HPLC法）

[0032] （含量测定参考文献：王航等。发酵法生产番茄红素培养方法的改进及优化。北京工业大学学报，2006,33（5）：38-40）

[0033] 发酵120h结束后，用纱布过滤发酵液收集湿菌体，经真空冷冻干燥后得到含番茄红素的干菌体。用研磨法粉碎干菌体，准确称取0.1g干菌粉，加入50ml石油醚静置萃取直至菌体无色为止，取5ml经过滤的萃取液用高效液相色谱法测定番茄红素的含量。其中，实验组番茄红素的平均含量为1.13g/L，空白组为0.654g/L，即添加甜菜碱的实验组的番茄红素含量比对照组提高72.8%。

[0034] 对比例1：

[0035] ⑴种子培养（同实施例1）

[0036] ⑵发酵培养

[0037] 同实施例1。不同之处在于，第二次添加甜菜碱的时间不同。实施例1在发酵42h加阻断剂的同时，第二次添加甜菜碱。而对比例1在42h时只加入阻断剂,在第60h时第二次添加甜菜碱，即发酵60h时，实验组的3个三角瓶中按1.5g/L的量第二次加入一水甜菜碱0.087g。

[0038] ⑶含量测定

[0039] 测定方法同实施例1。结果：实验组番茄红素的平均含量为1.03g/L，空白组为0.653g/L，即添加甜菜碱的实验组的番茄红素含量比对照组提高57.7%。

[0040] 对比例2：

[0041] ⑴种子培养（同实施例1）

[0042] ⑵发酵培养

[0043] 同实施例1。不同之处在于，第二次添加甜菜碱的时间不同。实施例1在发酵42h加阻断剂的同时，第二次添加甜菜碱。而对比例1在42h时只加入阻断剂,本实施例在第72h时第二次添加甜菜碱，即发酵72h时，实验组的3个三角瓶中按1.5g/L的量第二次加入一水甜菜碱0.087g。

[0044] ⑶含量测定

[0045] 测定方法同实施例1。结果：实验组番茄红素的平均含量为1.01g/L，空白组为0.653g/L，即添加甜菜碱的实验组的番茄红素含量比对照组提高54.7%。

[0046] 通过对比例1和2说明：本发明方法选择在第42h时第二次添加甜菜碱，番茄红素含量可提高72.8%；优于其他时间的第二次添加甜菜碱。

[0047] 实施例2：

[0048] ⑴种子培养（同实施例1）

[0049] ⑶发酵培养

[0050] 发酵培养基组成为：玉米粉18g/L,黄豆粉42.5g/L,棉籽油85ml/L,KH2P045.5g/L,MgSO4·7H2O1g/L，VBl0.02g/L,pH6.5。发酵培养基按50ml每瓶分装至6个500ml的三角瓶中，8层纱布封口，115℃灭菌20分钟。将种子液发酵培养得到的三孢布拉氏霉菌（+）和三孢布拉氏霉菌（-）菌种培养液以1:3的比例混合得到混合种子液。6个含发酵培养基的三角瓶每瓶分别转接8ml的混合种子液，其中3个含发酵培养基的三角瓶中按3g/L的量加入一水甜菜碱0.15g，作为实验组。另外3个三角瓶不加甜菜碱，作为空白组。分别于26-28℃，200-250r/min的条件下发酵培养120h结束。发酵42h时加入0.046g咪唑作为阻断剂,同时实验组的3个三角瓶不添加甜菜碱。

[0051] ⑶含量测定

[0052] 发酵结束后，用纱布过滤发酵液收集湿菌体，经真空冷冻干燥后得到含番茄红素的干菌体。用研磨法粉碎干菌体，准确称取0.1g干菌粉，加入50ml石油醚静置萃取直至菌体无色为止，取5ml经过滤的萃取液用高效液相色谱法测定番茄红素的含量。其中，实验组番茄红素的平均含量为0.997g/L，空白组为0.657g/L，即添加甜菜碱的实验组的番茄红素含量比对照组提高51.2%。

[0053] 实施例3：

[0054] ⑴种子培养（同实施例1）

[0055] ⑷发酵培养

[0056] 发酵培养基组成为：玉米粉18g/L,黄豆粉42.5g/L,棉籽油85ml/L,KH2P045.5g/L,MgSO4·7H2O1g/L，VBl0.02g/L,pH6.5。发酵培养基按50ml每瓶分装至6个500ml的三角瓶中，8层纱布封口，115℃灭菌20分钟。将种子液发酵培养得到的三孢布拉氏霉菌（+）和三孢布拉氏霉菌（-）菌种培养液以1:3的比例混合得到混合种子液。6个含发酵培养基的三角瓶每瓶分别转接8ml的混合种子液，其中3个含发酵培养基的三角瓶中按3g/L的量加入盐酸盐甜菜碱0.15g，作为实验组。另外3个三角瓶不加甜菜碱，作为空白组。分别于26-28℃，200-250r/min的条件下发酵培养120h结束。发酵42h时加入0.046g咪唑作为阻断剂,同时实验组的3个三角瓶中按1.5g/L的量第二次加入盐酸盐甜菜碱0.087g。

[0057] ⑶含量测定

[0058] 发酵结束后，用纱布过滤发酵液收集湿菌体，经真空冷冻干燥后得到含番茄红素的干菌体。用研磨法粉碎干菌体，准确称取0.1g干菌粉，加入50ml石油醚静置萃取直至菌体无色为止，取5ml经过滤的萃取液用高效液相色谱法测定番茄红素的含量。其中，实验组番茄红素的平均含量为1.36g/L，空白组为0.657g/L，即添加甜菜碱的实验组的番茄红素含量比对照组提高1.07倍。

[0059] 实施例4：

[0060] ⑴种子培养（同实施例1）

[0061] ⑸发酵培养

[0062] 发酵培养基组成为：玉米粉18g/L,黄豆粉42.5g/L,棉籽油85ml/L,KH2P045.5g/L,MgSO4·7H2O1g/L，VBl0.02g/L,pH6.5。发酵培养基按50ml每瓶分装至6个500ml的三角瓶中，8层纱布封口，115℃灭菌20分钟。将种子液发酵培养得到的三孢布拉氏霉菌（+）和三孢布拉氏霉菌（-）菌种培养液以1:3的比例混合得到混合种子液。6个含发酵培养基的三角瓶每瓶分别转接8ml的混合种子液，其中3个含发酵培养基的三角瓶中按3g/L的量加入盐酸盐甜菜碱0.15g，作为实验组。另外3个三角瓶不加甜菜碱，作为空白组。分别于26-28℃，200-250r/min的条件下发酵培养120h结束。发酵42h时加入0.046g咪唑作为阻断剂,同时实验组的3个三角瓶中按3g/L的量第二次加入盐酸盐甜菜碱0.174g。

[0063] ⑶含量测定

[0064] 发酵结束后，用纱布过滤发酵液收集湿菌体，经真空冷冻干燥后得到含番茄红素