一种利用硫酯酶合成Cilengitide的方法

摘要

发明的目的是提供一种Cilengitide的新型的合成方法，即利用硫酯酶（TE）介导的化学酶法催化合成抗肿瘤化合物Cilengitide，在提高了合成效率的同时又降低合成成本。本发明的合成方法与传统的化学合成法相比，在催化时间上缩短了48倍，由原先的32h（化学法）缩短为40min。在得率上由先前的27.2%，提高到了79.3%。因此，该方法使用可以大幅度的提高Cilengtide的合成效率，降低合成成本。

权利要求

1.一种合成Cilengitide的方法，其特征在于，是用硫酯酶来催化底物合成Cilengitide；其特征在于，所述的硫酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的底物为L-asp-D-phe-N-met-L-val-Larg-gly。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的底物的C端连接了BMT。

说明书

一种利用硫酯酶合成Cilengitide的方法

技术领域

[0001] 本发明属于绿色化工和酶催化技术领域，具体涉及一种利用硫酯酶（TE）介导的化学酶法催化合成抗肿瘤化合物Cilengitide的方法。

背景技术

[0002] Cilengitide是含有RGD（arginine–glycine–aspartate）的五环肽。作为整合素抑制因子，也是癌症个体化治疗研究的一个新类别抗新血管生成的孤儿药物，这类药物可以竞争、干扰肿瘤细胞与细胞外基质蛋白（extracellular matrix protein，ECM）的相互作用，阻止内源性配体与之结合，从而抑制肿瘤血管的生成和细胞的增殖、侵袭和转移作用。目前抗肿瘤化合物Cilengitide已经完成了包括胶质瘤（glioblastoma,GBM）在内的多种肿瘤的II-III期临床试验。GBM是最具侵略性的恶性肿瘤，而“Cilengitide”是目前唯一处于III期临床并用于治疗该癌症的整合素拮抗剂。近期结合III期临床的数据，EMA（European Medicines Agency）对Cilengitide做出很高评价，预期不久Cilengitide将通过III期临床评估，作为治疗GBM的特效药走向市场。但与乐观的前期临床研究不同，目前以传统的环肽化学全合成获得的Cilengitide价格十分昂贵（约为35000元/g），这将使得其在未来市场化的推广中障碍重重，进而难以惠及普通大众。同时化学全合成法也存在高污染、高消耗、多副反应和产率低等不足。因此，如何改变Cilengitide现有环肽合成方式，寻找新的合成途径，在提高合成效率的同时又降低合成成本是值得深入研究的一个问题。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种Cilengitide的新型的合成方法，即利用利用硫酯酶（TE）介导的化学酶法催化合成抗肿瘤化合物Cilengitide，在提高了合成效率的同时又降低合成成本。

[0004] 本发明首先提供硫酯酶的一种新用途，是在合成Cilengitide中的应用；

[0005] 本发明还提供一种合成Cilengitide的方法，是用硫酯酶来催化底物合成Cilengitide。

[0006] 上述的底物多肽的序列为：asp-phe-met-val-L-arg-gly；

[0007] 更具体的，底物为L-asp-D-phe-N-met-L-val-L-arg-gly；

[0008] 为了使底物能更好的和TE酶结合，在C端加上了一个BMT（苄硫醇），[0009] 上述的硫酯酶，包含有：

[0010] 1）氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

[0011] 2）与1）中的酶具有同源性，且能用来催化用于合成Cilengitide的底物来合成Cilengitide的酶。

[0012] 上述2）中的同源性，为具有90%以上同源性；优选为95%以上同源性，最佳为98%或以上的同源性。

[0013] 上述的硫酯酶，还包括有其它来源的，与氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶同源性低于60%，也具有催化底物合成Cilengitide的酶，上述的酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5-12。

[0014] 为了增加催化合成的效率，对氨基酸序列为SEQ ID NO:1的硫酯酶进行了突变的改造，改造后的硫酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

[0015] 本发明的合成方法与传统的化学合成法相比，在催化时间上缩短了48倍，由原先的的32h（化学法）缩短为40min。在得率上由先前的27.2%，提高到了79.3%。因此，该方法使用可以大幅度的提高Cilengtide的合成效率，降低合成成本。

附图说明

[0016] 图1：本发明硫酯酶催化合成的Cilengtide的HPLC分析图谱;图中各个峰分别为：Cilengitide线性底物(Su,30min)，水解产物(Hy,17min),环化产物（Cy,19min）。图中，A，B，C为标准品的HLPC图谱；D为没有TE酶加入的催化反应阴性对照图谱；E为TE酶加入的催化反应的图谱;

[0017] 图2：Cilengitide标准品的二级图谱;

[0018] 图3：用于TE催化的Cilengitide线性底物的二级图谱;

[0019] 图4：TE酶催化后产物中环肽的二级图谱；

[0020] 图5：TE酶催化后产物中线性底物的二级图谱。

具体实施方式

[0021] 对于本发明所涉及的术语的解释如下：

[0022] 1、TE：thioesterase中文译为硫酯酶，编号：EC3.1.2.14；

[0023] 2、Cilengitide：一种含有RGD（arginine–glycine–aspartate）的五环肽化合物，为整合素抑制因子。具有抗肿瘤作用。中文常被翻译为“西仑吉肽”或“西伦吉肽”[0024] 3、同源性:是指氨基酸序列间的相似程度。

[0025] 4、BMT：英文“benzyl mercaptane”的缩写中文一般翻译成“苄硫醇”[0026] 5、PPANT：英文“Phosphopanthetein”的缩写中文一般翻译成“磷酸泛酰巯基乙胺”

[0027] 6、SNAC：英文“N-acetylcysteamine”的缩写中文一般译成“乙酰半胱胺”[0028] 7、Thiophenol：中文一般译成“硫酚”

[0029] 8、底物L-asp-D-phe-N-met-L-val-L-arg-gly；其中L、D代表L型氨基酸和D型氨基酸，N-met代表N端进行甲基化修饰；

[0030] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

[0031] 实施例1：硫酯酶原核表达载体的构建

[0032] 1.1引物设计

[0033] 根据GenBank公布的微囊藻硫酯酶基因序列BAA83994设计以下引物。上游引物pET-28TE-F1：5′-ATA GCT AGC ATC TAT GCT CAA GAG ATG AAT-3′，下游引物pET-28TE-R1：5′-TTC AAG CTT TTA CGA CTG TTT TGG GTT GAG-3′。上下游引物分别引入Nde I和Bam HI酶切位点（下划线所示），酶切位点前碱基为保护碱基。引物均由上海英骏生物技术有限公司引物合成。

[0034] 1.2硫酯酶结构域的克隆

[0035] 微囊藻基因组DNA的提取按DNeasy plant Mini Kit50试剂说明书扩增得到的片段约720bp，取割胶回纯后的DNA2□l用于连接反应，体系5□l，全部用于转化。取200□l转化液涂板，培养过夜。随机挑选10个阳性克隆进行鉴定，活化后送至invitrogen公司测序鉴定。测序结果表明所获得的阳性克隆的核苷酸序列与GenBank编号为BAA83994的序列一致。其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，翻译的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

[0036] 1.3硫酯酶载体构建

[0037] 将筛选为阳性克隆的pMD18T-TE及pET28a(+)（Novagen）采用碱裂法小量抽提质粒用于双酶切的质粒。具体操作步骤按照generay质粒微量提取试剂盒（离心柱型）说明书。将纯化后的质粒用Nde I和Bam HI（New England lab）37℃孵育器3h酶切，将酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带，用E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit纯化。取回收片段作重组连接反应，10μl连接过夜，用于转化。取200μl转化液涂板，培养过夜。
随机挑选10个阳性克隆进行鉴定，活化后送至invitrogen公司测序鉴定。

[0038] 1.4硫酯酶体外诱导表达

[0039] 重组表达质粒pET28a-TE转化BL21(DE3)pLysE表达菌株（转化方法按照《分子克隆实验指南》）。挑选单菌落分别接种于5ml含卡那霉素（50μg/ml）LB培养基，37℃过夜培养。各取1.8ml过夜培养物于2ml的菌种保存管中，然后加入200μl的无菌甘油（终浓度10%），混匀后于-70℃保存，剩余菌液作为诱导表达的母液。将上述母液按1:100比例分别接种于5ml含卡那霉素（50μg/ml）M9培养基，37℃培养，测定OD600=0.5～0.7时，取1ml作为诱导前样品，剩余培养液中加入适量IPTG（终浓度0.5mM），于16℃，继续培养6h。

[0040] 1.5硫酯酶诱导产物的纯化

[0041] 将成熟菌液于50ml离心管，4000g，4℃离心20min收集菌体。加5ml column buffer/g重悬菌体，重悬后的菌体于漩涡振荡器连续振荡20min，之后于Precellys24菌体破碎仪中6500rpm4×30s漩涡破碎，12000rpm离心10min后，取上清进行目的蛋白纯化。

[0042] a)用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液（Binding Buffer：20mM Tris-HCl（PH7.9）10mM咪唑0.5M NaCl）；

[0043] b)使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白；

[0044] c)使用Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰（Elution Buffer：20mM Tris-HCl（PH7.9）200～500mM咪唑0.5M NaCl），将流出液收集后备用；

[0045] d)洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），4℃保存；

[0046] e)将梯度洗脱后的流出液用Millipore超滤管（15ml10KD）于5000g水平转子超滤40min，对目的蛋白浓缩后-20℃备用。对诱导产物的全细胞裂解物，空载阴性对照，重组体未诱导阴性对照，流穿液及浓缩目的蛋白用5%浓缩胶和12%分离胶SDS-PAGE检测。

[0047] 实施例2：硫酯酶催化合成Cilengitide产物

[0048] 以实施例1制备、表达纯化的硫酯酶蛋白为催化反应酶的来源（硫酯酶可以按照序列进行人工合成）来催化合成Cilengitide产物，催化合成步骤如下：首先设计合成适于硫酯酶催化的Cilengtide的线性多肽底物L-aspartyl-D-phenylalanyl-N-methyl-L-valyl-L-arginyl-glycyl；该底物通过人工合成。用于磷酸缓冲液将其溶解稀释到终浓度为0.5mM线性肽，随后加入实验例1中制备的TE蛋白酶，并用MOPS缓冲液补足到500μl，最终使TE酶与线性底物的浓度比达到1：10。将该混合液置于24℃的温度下孵育6h后立即放入-70℃，使酶催化反应停止，完成Cilengitide产物的合成。随后将反应产物进行冷冻干燥，干燥后反应产物加入适量甲醇重新溶解后，溶解物于12000rpm，离心10min加注到制备型的HPLC，并依据Cilengitide标准品的吸收波长和岀峰时间进行分离制备Cilengitide的纯品（液相条件：4.6×250mn，VYDAC-C18。Solvent C：0.1%acetic acid in100%water；
Solvent D：100%methanol，检测波长：220nm；梯度：D，0～39min40%～90%，40min90%），分离后的Cilengitide进行冷冻干燥，保存待用。

[0049] 将催化反应合成的产物冷冻干燥后，加350μl甲醇溶解，溶解物于12000rpm，离心10min，在40μl溶解物上清加160μl甲醇（稀释5倍）后取10μl上机。液相条 件：4.6×250mn，VYDAC-C18。Solvent C：0.1%acetic acid in100%water；Solvent D：100%methanol，流速：600ul/min；上样体积：10ul；检测波长：220nm；梯度：D，0～39min40%～90%，40min90%。

[0050] 催化后的Cilengitide产物，线性水解Cilengitide及剩余底物均能与标准品的液相出峰时间相一致（图1），Cilengitide标准品一级质谱数据显示其的分子量是589.3（计算值），催化反应产物中的实际观察值为：589.34。Cilengitide线性底物的标准品一级质谱数据显示其分子量为713.5（计算值），催化反应产物中的实际观察值为713.4(表1)。为进一步验证催化产物是否为Cilengitide，分别对Cilengitide标准品、线性肽标准品以及催化后的产物进行MS-MS分析，如图2、3、4和5所示。在40v能量的攻击下，标准品Cilengitide和催化产物中均有特征离子碎片：86.3m/z312.1m/z120.2m/z，所以从一级和二级数据均能证实该催化产物为Cilengitide。对序列为SEQ ID NO：1的酶进行人工合成，其也具有上述的催化合成Cilengitide的能力，催化效果也与重组表达的酶一致。

[0051] 表1：催化产物的一级质谱数据

[0052]

[0053] 实施例3：TE酶环化Cilengitide合成的效率与传统化学法的比较

[0054] 3.1TE酶催化Cilengitide合成

[0055] 在线性肽Cilengitide0.5g Tirs缓冲液：加入过饱和的TE酶，最后用Tris缓冲液补足到1000mL，形成最终的TE催化体系，该催化体系于24℃孵育6h，立即放入-70℃，使酶催化反应停止，反应液应液减压浓缩干燥即得环肽粗品。依据先前Cilengitide在HPLC上的保留时间及MS-MS分析确定的环肽目标主峰在HPLC上的保留时间和相对分子量。用制备型HPLC纯化环肽粗品，计算获得的纯化后的环肽量，并通过其与初始加入的线性肽粗品的量的比值计算TE酶催化获得Cilengitide的得率。

[0056] 3.2传统的化学法催化Cilengitide合成

[0057] 线性肽Cilengitide0.5g溶解于2000mL DCM中，加入缩合计PyBOP1.52g，HOBt0.4g，和DIEA1.2mL，冰浴搅拌反应24h。将反应液减压旋蒸至20mL。分别用10%HCL/H2O（体积比），饱和NaHCO3，饱和NaCL依次萃取（每次2h）后，加入等体积裂解液TFA：TIS：EDT：H2O为95：2:2：1冰浴反应2h。无水乙醚沉淀得环肽粗品。环肽的粗品分离纯化和得率计算方法步骤同上。

[0058] 3.3TE酶催化和传统化学法催化效率比较

[0059] 计算两种催化方法的结果显示（表2）：TE酶催化Cilengitide合成所需催化时间为6h，获得最终催化产物0.34g，得率为68%。而传统化学催化Cilengitide合成所需催化时间为32h，获得最终催化产物0.136g，得率为27.2%。比较两种催化方法，可以明显看到TE酶催化法较传统的化学催化法不论是在催化时间还是在催化产物的得率上均有显著提高。

[0060] 表2：化学催化法与TE酶催化法效率的比较

[0061]催化方法 催化时间 产物得率
化学催化法 32h 27.2%
TE酶催化法 6h 68%

[0062] 实施例4：TE酶突变体催化Cilengitide合成

[0063] 为进一步缩短TE酶催化Cilengitide合成的催化时间，提高催化效率；对来自于微囊藻的TE酶的催化位点附近主要用于容纳底物的口袋区进行了突变，以便增加酶与底物的结合亲和力，提高催化效率，缩短催化时间。选择对TE酶氨基酸序列的R101G和R141G两点突变，突变后的酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

[0064] 突变后的TE酶的表达，纯化以及对Cilengitide的催化合成方法同前。最终突变体对Cilengitide的催化结果显示（表3）：相比野生型TE酶，突变型TE酶对底物具有更高的亲和力，使得的TE酶可迅速和底物结合并发生后续的催化环化作用。相比野生型TE酶，TE酶的突变体催化时间缩短到40min，相应的产物的得率也从野生型的68%提高到79.3%。

[0065] 表3：TE酶和TE酶突变体对Cilengitide的催化效果比较

[0066]酶的类别 催化时间 产物得率
野生型TE酶SEQ ID NO：1 6h 68%

[0067]突变型TE酶SEQ ID NO：3 40min 79.3%

[0068] 实施例5：不同来源的硫酯酶对Cilengitide的催化合成

[0069] 除先前的微囊藻来源的TE外，从自然界中选取了8种其它微生物来源的TE酶，分别为：念珠藻（Nostoc sp.PCC7120）来源的TE酶，氨基酸序列为SEQ ID NO：5；节球藻（Nodularia spumigena）来源的TE酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：6；链霉菌（Streptomyces thioluteus HKI-227）来源的TE酶，氨基酸序列为SEQ ID NO：
7；青霉菌（Penicillium chrysogenum）来源的TE酶，氨基酸序列为SEQ ID NO：8；
粘细菌（Sorangium cellulosum）来源的TE，氨基酸序列为SEQ ID NO：9；放线菌（Actinoplanes teichomyceticus）来源的TE酶，氨基酸序列为SEQ ID NO：10；堆囊菌（Angiococcus disciformis）来源的TE酶，氨基酸序列为SEQ ID NO：11；交替假单胞菌（Pseudoaltermonas sp.NJ631）来源的TE酶，氨基酸序列为SEQ ID NO：12。上述的不同来源的硫酯酶氨基酸序列，与微囊藻来源的硫酯酶虽然相似度较低，但也具有相似的催化线性肽底物环化的功能，最终对各来源的TE酶对Cilengitide的催化结果比较显示见表4。

[0070] 表4：不同来源的TE酶对Cilengitide的催化效果比较

[0071]TE酶的来源 催化时间 产物得率
微囊藻野生型 6h 68%
微囊藻突变型 40min 79.3%
念珠藻 4h 53%
节球藻 5h 56.3%
链霉菌 3.5h 48%
青霉菌 7h 61.2%
粘细菌 7.4h 54.6%
放线菌 5.4h 58%
堆囊菌 9h 37%
交替假单胞菌 2h 49%

[0072] 从上表可以看出，其他来源的TE酶均能对Cilengitide产生催化反应。但相对微囊藻来源的TE突变体对Cilengitide的催化结果，其他来源的TE酶不论是在催化时间，还是在催化产物得率上看都没微囊藻来源的TE酶突变体好。

[0073] 实施例5：微囊藻来源的TE突变体对不同C端修饰的底物的催化效率评估[0074] 为了选择更适合微囊藻来源的TE酶催化的底物，除先前对底物C端进行BMT修饰外，又对底物的C端进行PPANT、SNAC以及Thiophenol的修饰，并通过微囊藻来源的TE突变体对这些不同C端修饰的底物进行催化并评估其催化效率。结果显示见表5。

[0075] 表5：TE酶突变体对不同C端修饰线性多肽底物的催化效果比较

[0076]C端修饰成份 催化时间 产物得率
BMT 40min 79.3%
PPANT 1h 70.2%
SNAC 4h 57.1%
Thiophenol 3.5h 67%

[0077] 从上表可以看出，TE酶均能对这些C端修饰的底物进行催化反应。但相对BMT修饰底物，其三种C端修饰不论是在催化时间，还是在催化产物得率上都没BMT修饰的底物的效果好。这也进一步说明C端BMT修饰后的线性多肽底物更适合TE酶催化形成Cilengitide。