一种检测耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌的多重PCR方法及试剂盒

摘要

本发明整合了错配扩增突变分析PCR（MAMA-PCR）和多重PCR技术，提供了一种快速检测由于核苷酸点突变引起的耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌的方法及试剂盒。本发明所提供的试剂盒包括具有序列表中SEQ ID №：1-5、SEQ ID №：7所示的核苷酸序列的引物组合物和具有序列表中SEQ ID №：1-6所示核苷酸序列的质控组引物组合物。本发明提供的检测方法及试剂盒可快速从疑似菌中鉴定出耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌，简化了以菌种鉴定和药敏试验为代表的传统检测方法的复杂程序，具有良好的特异性和灵敏度，非常适合基层一线用于快速检测疑似菌，继而提供准确的用药指导。

权利要求

1.一种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的引物组合物，由如下所述引物组成：序列表中SEQ ID No.1所示核苷酸序列的引物、序列表中SEQ ID No.2所示核苷酸序列的引物、序列表中SEQ ID No.3所示核苷酸序列的引物、序列表中SEQ ID No.4所示核苷酸序列的引物、序列表中SEQ ID No.5所示核苷酸序列的引物和序列表中SEQ ID No.7所示核苷酸序列的引物。

2.一种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的引物组合物，由检测组引物组合物和质控组引物组合物组成；

所述检测组引物组合物由如下所述引物组成：序列表中SEQ ID No.1所示核苷酸序列的引物、序列表中SEQ ID No.2所示核苷酸序列的引物、序列表中SEQ ID No.3所示核苷酸序列的引物、序列表中SEQ ID No.4所示核苷酸序列的引物、序列表中SEQ ID No.5所示核苷酸序列的引物和序列表中SEQ ID No.7所示核苷酸序列的引物；

所述质控组引物组合物由如下引物组成：序列表中SEQ ID No.1所示核苷酸序列的引物、序列表中SEQ ID No.2所示核苷酸序列的引物、序列表中SEQ ID No.3所示核苷酸序列的引物、序列表中SEQ ID No.4所示核苷酸序列的引物、序列表中SEQ ID No.5所示核苷酸序列的引物和序列表中SEQ ID No.6所示核苷酸序列的引物。

3.一种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组合物。

4.一种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的PCR试剂，包括检测PCR试剂和质控PCR试剂，其中检测PCR试剂包括如下引物组合物：序列表中SEQ ID No.1-5和SEQ ID No.7所示核苷酸序列的引物组合物；质控PCR试剂包括序列表中SEQ ID No.1-6所示核苷酸序列的引物组合物。

5.权利要求1或2所述的引物组合物、权利要求3所述试剂盒、或权利要求4所述试剂在制备辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的产品中的应用。

6.权利要求1或2所述的引物组合物、权利要求3所述试剂盒、或权利要求4所述试剂在制备待测空肠弯曲杆菌是否发生突变的产品中的应用；

所述突变为待测空肠弯曲杆菌基因组gyrA基因中的第257位核苷酸由C突变为T。

说明书

一种检测耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌的多重PCR方法

及试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速检测耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌的分子生物学技术。

背景技术

[0002] 空肠弯曲杆菌是一种主要的食源性感染病原菌，在许多经济发达国家由空肠弯曲杆菌感染引起的腹泻在细菌性腹泻病中位居榜首。在发展中国家，空肠弯曲杆菌引起的腹泻仅次于大肠杆菌和志贺氏菌。近年来，随着空肠弯曲杆菌耐药性的增强，使其在食物中污染程度增高，由其造成的食物中毒事件迅速增加。世界卫生组织(WTO)已将该病列为最常见的传染病之一，我国的国家食源性疾病监测网于2003年增加了对弯曲菌病的监测。在自然界中，空肠弯曲杆菌广泛存在于鸡，鸭，牛，羊等家禽，家畜以及鸟类的肠道内，构成空肠弯曲杆菌的体外储存宿主。空肠弯曲杆菌污染的肉，奶，蛋以及水源等是空肠弯曲杆菌感染的主要传染源。无论在动物体内还是在人类感染中，目前空肠弯曲杆菌的耐药问题世界性普遍存在，成为空肠弯曲杆菌病预防控制及临床治疗所面临的重要挑战。

[0003] 喹诺酮类药物是治疗空肠弯曲杆菌肠炎中使用最普遍的药，不幸的是90年代后随着其大量的应用，其耐药性迅速增加，耐药菌株也开始传播。不仅人类感染菌株中其耐药比例逐渐增加，在动物中，家畜，家禽及肉类食品分离菌株中，喹诺酮的耐药也逐渐增加。随着喹诺酮类抗性菌种造成感染数量的增多,人类感染空肠弯曲杆菌病例也越来越多。人们在肉用动物生产中使用了大量的喹诺酮类药物,使喹诺酮类药物在食物链中出现造成空肠弯曲杆菌对其产生耐药性。

[0004] 目前细菌耐药性检测主要是通过基于培养的药物敏感性实验，包括纸片扩散法、最小抑菌浓度(MIC)法等。其中MIC法属于金标准，可以表明细菌对药物的敏感性，从而指导临床治疗。由于上述药物敏感性实验是基于培养的，因此耗时较长，约2-3天才能获得结果，而且灵敏度较差，因此，临床亟需快速灵敏的实验方法来检测细菌耐药性，指导临床治疗方案，控制耐药细菌的传播和扩散。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为了克服传统检测方法的缺陷，提供一种简便、快捷、准确率高的检测耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌的引物组合物及方法，所述方法具体涉及一种整合菌种鉴定多重PCR技术和MAMA-PCR技术的分子生物学方法。

[0006] 本发明提供的一种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的引物对，由如下1）和2）所述引物组成：

[0007] 1）具有序列表中SEQ ID №：5所示的核苷酸序列；

[0008] 2）具有序列表中SEQ ID №：7所示的核苷酸序列。

[0009] 本发明提供的另一种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的引物组合物，由如下所述引物组成：具有序列表中SEQ ID №：1、所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列的引物和具有序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列的引物。

[0010] 本发明提供的再一种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的引物组合物，由检测组引物组合物和质控组引物组合物组成；

[0011] 所述检测组引物组合物由如下所述引物组成：具有序列表中SEQ ID №：1、所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列的引物和具有序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列的引物；

[0012] 所述质控组引物组合物由如下引物组成：具有序列表中SEQ ID №：1、所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列的引物和具有序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列的引物。

[0013] 本发明的另一个目的是提供一种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的试剂盒，所述试剂盒包括上述任一所述的引物对或引物组合物。

[0014] 本发明的还一个目的是提供一种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的PCR试剂，包括检测PCR试剂和质控PCR试剂，其中检测PCR试剂包括如下引物组合物：具有序列表中SEQ ID №：1-5和SEQ ID №：7所示核苷酸序列的引物组合物；质控PCR试剂包括具有序列表中SEQ ID №：1-6所示核苷酸序列的引物组合物。

[0015] 所述检测PCR试剂中，所述具有序列表中SEQ ID №：1-2、SEQ ID №：5和SEQ ID №：7的引物与所述具有序列表中SEQ ID №：3-4的引物的摩尔比为4:3；所述质控PCR试剂中，所述具有序列表中SEQ ID №：1-2、SEQ ID №：5-6的引物与所述具有序列表中SEQ ID №：3-4的引物的摩尔比为4:3。

[0016] 本发明的还一个目的是提供上述任一所述引物对或引物组合物、所述试剂盒、或所述试剂在制备辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的产品中的应用。

[0017] 本发明的还一个目的是提供上述任一所述引物对或引物组合物、所述试剂盒、或所述试剂在制备待测空肠弯曲杆菌是否发生突变的产品中的应用。

[0018] 所述突变为待测空肠弯曲杆菌基因组gyrA基因中第257位核苷酸（从起始密码子的第一个碱基开始计算）由C突变为T。

[0019] 本发明的再一个目的是提供一种辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的方法，包括如下步骤：以待测空肠弯曲杆的基因组DNA为模板，使用上述任一所述的引物对或引物组合物、上述任一所述的试剂盒或PCR试剂，进行PCR扩增。

[0020] 所述方法中，所述PCR扩增条件为：94℃3min，1循环；94℃30s、56℃30s、72℃40s，共计30个循环。

[0021] 所述方法中，所述PCR扩增结果通过凝胶电泳检测；所述凝胶电泳检测条件为110V电压，电泳50min；所述凝胶电泳采用体积百分比为2.5％浓度的琼脂糖凝胶。

[0022] 所述耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌具体指空肠弯曲杆菌基因组gyrA基因中的第257位（从起始密码子的第一个碱基开始计算）核苷酸由C突变为T。

[0023] 所述方法还包括鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的判断标准：当利用所述检测组引物组合物可扩增出358bp、134bp和180bp大小的核酸片段；同时，利用所述质控组引物组合物可扩增出358bp、134bp和237bp大小的核酸片段时，表明待测空肠弯曲杆菌为耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌。

[0024] 本发明具有以下有益效果：它具有检测快速准确，灵敏度好，能一步到位确定待检菌株是否为耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌。由于检测技术很简单，本方法十分适合基层一线检测，并用于指导用药。

附图说明

[0025] 图1为整合错配扩增突变分析PCR（MAMA-PCR）和菌种鉴定多重PCR技术快速检测耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌的结果图；其中，左右两边M泳道为DL2000DNAMarker；1号、2号泳道为不加DNA模板的空白对照；3号、4号泳道为加入某耐喹诺酮类抗生素的沙门氏菌模板的结果；5号、6号泳道为加入沙门氏菌ATCC13311模板的结果；7号、8号泳道为加入某结肠弯曲菌模板的结果；9号、10号泳道为加入某耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌DH69模板的结果；11号、12号泳道为加入对喹诺酮类药物敏感的空肠弯曲杆菌模式菌株NCTC11168模板；13号、14号泳道为加入对喹诺酮类药物敏感的空肠弯曲杆菌标准质控菌株ATCC33560模板；此外，编号为奇数的泳道为检测组，编号为偶数的泳道为质控组。

[0026] 图2为整合错配扩增突变分析PCR（MAMA-PCR）和菌种鉴定多重PCR技术快速检测耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌验证效果实施例结果图，其中，1号、2号泳道为不加DNA模板的空白对照；3号、4号泳道为加入ZP11的DNA模板的结果；5号、6号泳道为加入HT8的DNA模板的结果；7号、8号泳道为加入LY10的DNA模板的结果；9号、10号泳道为加入LY17的DNA模板的结果；11号、12号泳道为加入SX4的DNA模板的结果；13号、14号泳道为加入PL66S的DNA模板的结果；15号、16号泳道为加入LY121的DNA模板的结果；17号、18号泳道为加入ZP74的DNA模板的结果；19号、20号泳道为加入不耐药的空肠弯曲杆菌标准质控菌株ATCC33560的DNA模板的结果；此外，编号为奇数的泳道为检测组，编号为偶数的泳道为质控组。

[0027] 图3为整合错配扩增突变分析PCR（MAMA-PCR）和菌种鉴定多重PCR技术快速检测耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌的结果图，其中，A1-A3泳道使用的是引物1和2、引物3和4、以及引物5和6，作为质控引物扩增结果，产物大小分别为134bp、237bp、358bp；B1-B3泳道使用的是引物1和2、引物3和4、以及引物5和7，作为检测组2的多重PCR扩增结果，产物大小分别为134bp、180bp、358bp。C1-C3泳道使用的是引物1和2、引物3和4、以及引物5和8，作为检测组1的多重PCR扩增结果，产物大小分别为134bp、180bp、358bp；此外泳道A1、B1、C1为不加DNA模板的空白对照；泳道A2、B2、C2为加入对喹诺酮类药物敏感的空肠弯曲杆菌模式菌株NCTC11168的DNA模板的结果；泳道A3、B3、C3为加入某耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌DH69模板的结果。

具体实施方式

[0028] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0029] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0030] 实施例1、整合错配扩增突变分析PCR（MAMA-PCR）和菌种鉴定多重PCR技术快速检测耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌

[0031] 待测菌株：

[0032] 耐喹诺酮类抗生素的沙门氏菌（编号为395，为本实验室自己从中国采集的菌株，经药敏实验确证其为耐喹诺酮类抗生素的沙门氏菌）、沙门氏菌ATCC13311（购自美国标准生物品收藏中心）、结肠弯曲菌（编号为TA-60，为本实验室自己从中国采集的菌株，经药敏实验确证其为耐喹诺酮类抗生素的结肠弯曲菌）、耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌DH69、喹诺酮类药物敏感的空肠弯曲杆菌模式菌株11168（编号为NCTC11168）、喹诺酮类药物敏感（不耐药）的空肠弯曲杆菌标准质控菌株33560（编号为ATCC33560）。

[0033] 耐喹诺 酮类抗生 素空肠 弯曲杆 菌ZP11、HT8、LY10、LY17、SX4、PL66S、LY121、ZP74（参 考 文 献：Xia Chen,Gao-Wa Naren,Congming Wu,Yang Wang,Lei Dai,Li-Ning Xia,Peng-jie Luo,Qingjing Zhang,Jian-Zhong Shen.Prevalence and antimicrobial resistance of Campylobacter isolates in broilers from China.Vet Microbiol.2010.144:133-139；陈霞.山东省肉鸡源耐药弯曲菌流行病学调查及其对喹诺酮和氨基糖苷类耐药机制研究.[博士学位论文].北京.中国农业大学.2011。公众可从中国农业大学获得这些菌株）。

[0034] （一）PCR反应模板的制备

[0035] 使用TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒，按照试剂盒说明书的方法提取上述各待测菌株的基因组DNA。

[0036] （二）PCR引物序列的设计与合成

[0037] 分别以上述提取的各待测菌株的基因组DNA为模板，每个菌株设置阳性质控组和检测组两个多重PCR反应，阳性质控组和检测组多重PCR反应所用引物如下所示：

[0038] 1、人工合成下述阳性质控组引物：

[0039] 1）扩增弯曲杆菌属特异性基因16s rRNA基因的引物对：

[0040] 引物1（16s F）：5’GGCATATACAATGAGACGCAATACC3’

[0041] 引物2（16s R）：5’TCACCGTAGCATGGCTGATCTA3’

[0042] 2）扩增空肠弯曲杆菌菌种特异性基因hipO基因的引物对：

[0043] 引物3（hipO-F）：5’CAGATATGGATGCTTTGCCTTTGC3’

[0044] 引物4（hipO-R）：5’CCACCTCTTCCAATAACTTCAATGC3’

[0045] 3）扩增含QRDR突变热点的gyrA基因的引物对：

[0046] 引物5（gyrA-F）：5’ATAGGTCGTGCTTTGCCTGAC3’

[0047] 引物6（gyrA-R）：5’GTTGCCTTGTCCTGTAATACTTGG3’

[0048] 上述引物1-引物6的核苷酸序列依次见序列表中SEQ ID №：1-SEQ ID №：6。

[0049] 2、人工合成下述检测组引物：

[0050] 1）扩增弯曲杆菌属特异性基因16s r RNA基因的引物对：

[0051] 引物1（16s F）：5’GGCATATACAATGAGACGCAATACC3’

[0052] 引物2（16s R）：5’TCACCGTAGCATGGCTGATCTA3’

[0053] 2）扩增空肠弯曲杆菌菌种特异性基因hipO基因的引物对：

[0054] 引物3（hipO-F）：5’CAGATATGGATGCTTTGCCTTTGC3’

[0055] 引物4（hipO-R）：5’CCACCTCTTCCAATAACTTCAATGC3’

[0056] 3）用于检测突变位点的MAMA-PCR引物：

[0057] 引物5（gyrA-F）：5’ATAGGTCGTGCTTTGCCTGAC3’

[0058] 引物8（MAMA-2）：5’CAAAGCATCATAAACTGCCA3’

[0059] 上述引物8的核苷酸序列见序列表中SEQ ID№：7。

[0060] 上述引物1和2可扩增得到的16s rRNA基因片段的核苷酸序列见序列表中SEQ ID №：8所示，共134bp；引物3和4可扩增得到的hipO基因片段的核苷酸序列见序列表中SEQ ID №：9所示，共358bp；引物5和6可扩增得到的gyrA基因片段的核苷酸序列见序列表中SEQ ID №：10所示，共237bp；用于检测突变位点的MAMA-PCR引物对5和8，可扩增得到的gyrA基因片段的核苷酸序列见序列表中SEQ ID №：11所示，共180bp。

[0061] （三）PCR反应体系和反应条件

[0062] 多重PCR反应体系采用TIANGEN公司的2×Taq PCR MasterMix 试剂，该反应体系中引物的加入量关系为：阳性质控组和检测组中引物1-2和引物5、6、8的用量与引物3-4加入量的摩尔比为4:3。

[0063] 质控组、检测组的多重PCR反应体系均为25ul反应体系，具体如下：

[0064] 质控组：

[0065]

[0066] 检测组：

[0067]

[0068] 质控组和检测组的多重PCR反应条件为：94℃ 3min ，1循环；94℃ 30s、56℃30s、72℃ 40s，共计30个循环。

[0069] （四）PCR结果检测及菌株鉴定结果

[0070] 上述PCR结果通过体积百分比为2.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶电泳检测条件为110V电压，电泳50min后观察结果。

[0071] 当利用检测组引物可扩增出358bp、134bp和180bp大小的核酸片段；同时，利用质控组引物可扩增出358bp、134bp和237bp大小的核酸片段时，表明待测菌株为耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌。

[0072] 质控组和检测组的菌株鉴定结果见图1和图2。图1结果表明本发明设计合成的MAMA-PCR和多重PCR引物，可特异、灵敏的鉴定出待检菌株是否为耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌。图2结果表明，使用本方法所得检测的结果与文献报道的一致。图1和图2结果说明本方法可靠。

[0073] 对比例1、整合错配扩增突变分析PCR（MAMA-PCR）和菌种鉴定多重PCR技术快速检测耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌

[0074] 采用与实施例1相同的方法，检测喹诺酮类药物敏感的空肠弯曲杆菌模式菌株NCTC11168和某耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌DH69，不同的是，将实施例1中待测菌株替换为本对比例的NCTC11168和DH69，作为检测组1；将实施例1中的引物8替换为下述引物7，将待测菌株替换为NCTC11168和DH69，作为检测组2，其它条件均不变：

[0075] 引物7（MAMA-1）：5’CAAAGCATCATAAACTGCAA3’；

[0076] 上述引物7的核苷酸序列见序列表中SEQ ID №：12。

[0077] 对比例1的检测结果见图3。图3结果显示，在多重PCR体系中，使用检测组2的引物的检测结果中，扩增出的带有突变位点的条带非常弱。图3结果表明，使用检测组1的引物的检测效果要明显好于使用检测组2的引物。