一种药物组合物指纹图谱的测定方法

摘要

本发明公开了一种药物组合物指纹图谱的测定方法，通过高效液相色谱法测定该药物组合物的指纹图谱从而有效监控该药物质量。该方法包括以下步骤：（a）供试品溶液制备：取药物适量，置于量瓶中，加入甲醇与水的混合溶液超声溶解，定容，滤过，即为供试品溶液；（b）色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，检测波长240-300nm；（c）测定：吸取上述供试品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到该药物组合物指纹图谱。该检测方法操作方便，效率高效，重复性和稳定性好，易于掌握。

权利要求

1.一种药物组合物指纹图谱的测定方法，其特征在于包括以下步骤：(a)供试品溶液制备：取药物适量，置于量瓶中，加入甲醇与水的混合溶液超声溶解，定容，滤过，即为供试品溶液；

(b)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，检测波长240-300nm；

(c)测定：吸取上述供试品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到该药物组合物指纹图谱；

所述药物组合物选自含有贯叶连翘和刺五加的舒肝解郁胶囊、贯叶连翘提取物或刺五加提取物，所述梯度洗脱程序为：

0-3min时，流动相A为95％的0.1％甲酸水溶液，流动相B为5％的乙腈；

10min时，流动相A为90％的0.1％甲酸水溶液，流动相B为10％的乙腈；

20min时，流动相A为80％的0.1％甲酸水溶液，流动相B为20％的乙腈；

30min时，流动相A为65％的0.1％甲酸水溶液，流动相B为35％的乙腈；

40min时，流动相A为45％的0.1％甲酸水溶液，流动相B为55％的乙腈；

45min时，流动相A为0％的0.1％甲酸水溶液，流动相B为100％的乙腈；

50min时，流动相A为0％的0.1％甲酸水溶液，流动相B为100％的乙腈；

51-60min时，流动相A为95％的0.1％甲酸水溶液，流动相B为5％的乙腈。

2.根据权利要求1所述的药物组合物指纹图谱测定方法，其特征在于：(a)步骤中所述检测波长为240-300nm，流速为0.5ml/min，柱温为25-35℃，进样体积为1-10ul。

3.根据权利要求2所述的药物组合物指纹图谱测定方法，其特征在于：(a)步骤中所述检测波长为265nm，流速为0.5ml/min，柱温为30℃，进样体积为5ul。

4.根据权利要求1所述的药物组合物指纹图谱测定方法，其特征在于：(a)步骤中所述甲醇与水的混合溶液为20％～75％的甲醇溶液。

5.根据权利要求1所述的药物组合物指纹图谱测定方法，其特征在于：(a)步骤中所述供试品溶液制备方法为：取药物0.20～0.25g，置于25ml量瓶中，加入50％CH3OH溶液，超声

30min，溶解，加50％CH3OH定容至刻度，滤过，即得试品样品溶液。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的药物组合物指纹图谱测定方法，其特征在于所测得的舒肝解郁胶囊指纹图谱中含有13个单峰面积占总峰面积百分比超过1％的共有指纹峰，分别为：

1号峰，保留时间RT为12.45，RSD为0.08％，峰面积为365.49，RSD为28.82％；

2号峰，保留时间RT为13.85，RSD为0.14％，峰面积为272.90，RSD为31.95％；

4号峰，保留时间RT为17.40，RSD为0.09％，峰面积为535.48，RSD为25.40％；

5号峰，保留时间RT为17.81，RSD为0.09％，峰面积为543.92，RSD为33.10％；

6号峰，保留时间RT为18.31，RSD为0.08％，峰面积为279.93，RSD为35.21％；

9号峰，保留时间RT为25.02，RSD为0.06％，峰面积为2136.24，RSD为13.35％；

10号峰，保留时间RT为25.70，RSD为0.05％，峰面积为1934.51，RSD为25.88％；

11号峰，保留时间RT为25.97，RSD为0.05％，峰面积为2221.12，RSD为13.79％；

13号峰，保留时间RT为27.18，RSD为0.01％，峰面积为150.16，RSD为19.44％；

14号峰，保留时间RT为27.60，RSD为0.05％，峰面积为804.87，RSD为12.59％；

15号峰，保留时间RT为27.94，RSD为0.05％，峰面积为416.84，RSD为19.74％；

19号峰，保留时间RT为33.70，RSD为0.04％，峰面积为1757.78，RSD为27.66％；

20号峰，保留时间RT为37.51，RSD为0.04％，峰面积为307.31，RSD为16.64％。

7.根据权利要求1-5中任意一项所述的药物组合物指纹图谱测定方法，其特征在于所测得的舒肝解郁胶囊指纹图谱中还含有13个单峰面积占总峰面积百分比未超过1％的共有指纹峰，分别为：

3号峰，保留时间RT为16.15，峰面积为79.84，占总峰面积百分比为0.62％；

7号峰，保留时间RT为21.56，峰面积为95.12，占总峰面积百分比为0.76％；

8号峰，保留时间RT为22.81，峰面积为30.48，占总峰面积百分比为0.21％；

12号峰，保留时间RT为26.78，峰面积为45.62，占总峰面积百分比为0.35％；

16号峰，保留时间RT为28.43，峰面积为18.87，占总峰面积百分比为0.13％；

17号峰，保留时间RT为28.78，峰面积为33.07，占总峰面积百分比为0.26％；

18号峰，保留时间RT为29.69，峰面积为55.36，占总峰面积百分比为0.42％；

21号峰，保留时间RT为48.26，峰面积为2.90，占总峰面积百分比为0.02％；

22号峰，保留时间RT为50.50，峰面积为29.03，占总峰面积百分比为0.20％；

23号峰，保留时间RT为51.12，峰面积为1.45，占总峰面积百分比为0.01％；

24号峰，保留时间RT为51.75，峰面积为52.26，占总峰面积百分比为0.36％；

26号峰，保留时间RT为52.35，峰面积为2.90，占总峰面积百分比为0.01％；

25号峰，保留时间RT为52.10，峰面积为1.45，占总峰面积百分比为0.02％。

8.根据权利要求1-5中任意一项所述的药物组合物指纹图谱测定方法，其特征在于所测得的贯叶连翘提取物指纹图谱中共有指纹峰为：

1号峰，保留时间RT为12.58min，峰面积为139.52，占总峰面积百分比为2.06％；

2号峰，保留时间RT为14.02min，峰面积为49.23，占总峰面积百分比为0.73％；

3号峰，保留时间RT为18.07min，峰面积为122.54，占总峰面积百分比为1.81％；

4号峰，保留时间RT为18.50min，峰面积为36.08，占总峰面积百分比为0.53％；

5号峰，保留时间RT为25.19min，峰面积为1345.87，占总峰面积百分比为19.83％；

6号峰，保留时间RT为25.90min，峰面积为1224.44，占总峰面积百分比为18.04％；

7号峰，保留时间RT为26.15min，峰面积为1307.68，占总峰面积百分比为19.27％；

8号峰，保留时间RT为27.78min，峰面积为505.83，占总峰面积百分比为7.45％；

9号峰，保留时间RT为28.09min，峰面积为215.12，占总峰面积百分比为3.17％；

10号峰，保留时间RT为29.01min，峰面积为7.30，占总峰面积百分比为0.11％；

11号峰，保留时间RT为29.81min，峰面积为41.98，占总峰面积百分比为0.62％；

12号峰，保留时间RT为33.87min，峰面积为940.09，占总峰面积百分比为13.85％；

13号峰，保留时间RT为37.72min，峰面积为168.23，占总峰面积百分比为2.48％；

14号峰，保留时间RT为48.24min，峰面积为2.22，占总峰面积百分比为0.03％；

15号峰，保留时间RT为50.72min，峰面积为0.35，占总峰面积百分比为0.01％；

16号峰，保留时间RT为51.07min，峰面积为1.58，占总峰面积百分比为0.02％；

17号峰，保留时间RT为51.83min，峰面积为19.72，占总峰面积百分比为0.29％；

18号峰，保留时间RT为52.48min，峰面积为1.55，占总峰面积百分比为0.02％；

19号峰，保留时间RT为52.96min，峰面积为1.94，占总峰面积百分比为0.03％。

9.根据权利要求1-5中任意一项所述的药物组合物指纹图谱测定方法，其特征在于所测得的刺五加提取物指纹图谱中共有指纹峰为：

1号峰，保留时间RT为12.60min，峰面积为123.82，占总峰面积百分比为5.47％；

2号峰，保留时间RT为14.02min，峰面积为266.82，占总峰面积百分比为11.79％；

3号峰，保留时间RT为16.36min，峰面积为88.02，占总峰面积百分比为3.89％；

4号峰，保留时间RT为17.57min，峰面积为409.19，占总峰面积百分比为18.08％；

5号峰，保留时间RT为18.06min，峰面积为318.40，占总峰面积百分比为14.07％；

6号峰，保留时间RT为18.49min，峰面积为291.64，占总峰面积百分比为12.88％；

7号峰，保留时间RT为21.81min，峰面积为128.95，占总峰面积百分比为5.70％；

8号峰，保留时间RT为22.88min，峰面积为32.84，占总峰面积百分比为1.45％；

9号峰，保留时间RT为25.83min，峰面积为31.10，占总峰面积百分比为1.37％；

10号峰，保留时间RT为27.37min，峰面积为48.01，占总峰面积百分比为2.12％；

11号峰，保留时间RT为28.97min，峰面积为19.72，占总峰面积百分比为0.87％。

说明书

一种药物组合物指纹图谱的测定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种药物组合物的指纹图谱的测定方法。

背景技术

[0002] 中药指纹图谱是借助于波谱或色谱技术获得的中药化学成分的光谱图或色谱图，是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。目前，美国FDA、英国和印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用植物学会均接受色谱指纹图谱的质控方法。由于中药复方指纹图谱整张图谱是由不同峰群组成，每一峰群都代表一组生物信息，且各种生物信息之间的相互协同及拮抗作用，正好体现了中药复方的配伍和组方理论。此外，这些峰群或峰群之间通过对机体主病及主证的治疗，体现了控制某张中药复方指纹图谱，就可确保其相应药效。目前中药指纹图谱的建立方法主要有：光谱法，如紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)；色谱法，如薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、毛细管电泳法；以及其他方法，如x射线衍射法、核磁共振法等。其中高效液相色谱法(HPLC)具有分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点，不受样品挥发度和热稳定性的限制，比气相色谱法等其他方法应用范围更广，是构建指纹图谱的主要方法之一。

[0003] 抑郁症是一种常见的精神疾病，主要表现为情绪低落、兴趣减低、悲观、思维迟缓、自责自罪、饮食睡眠差、担心或感到全身多处不适、严重者可出现自杀念头和行为。目前，抑郁症已迅速成为全球疾病中给人类造成严重负担的第二位重要疾病，对患者及其家属造成的痛苦和对社会造成的损失是其他疾病所无法比拟的。舒肝解郁胶囊是国内首个SFDA批准的用于治疗抑郁的中成药。主要的功效为健脾安神，适用于轻、中度单相抑郁症属肝郁脾虚证者，症见情绪低落、兴趣下降、迟滞、入睡困难、早醒、多梦、紧张不安、急躁易怒、食少纳呆、胸闷、疲乏无力、多汗、疼痛、舌苔白或腻，脉弦或细。该药是在吸取中医有关治疗抑郁的经验基础上，借鉴国内外现代医学治疗抑郁的最新研究成果配方而得。舒肝解郁胶囊的作用机制是通过其有效成分透过血脑屏障对海马神经元的萎缩以及中枢局部组织的生化失调产生重要的保护作用。有临床报道舒肝解郁胶囊对轻中度抑郁有效率为68.10%，远较安慰剂的29.0%高，差异具有统计学意义，临床总体疗效评估也证实了舒肝解郁胶囊抗抑郁疗效明显优于安慰剂，并且其安全性及耐受性良好[舒肝解郁胶囊治疗轻中度抑郁症的随机双盲安慰剂对照研究，孙新宇等，临床研究，2009,18(5)]。因此，舒肝解郁胶囊是一种疗效和安全性俱佳的纯中药制剂。

[0004] 舒肝解郁胶囊由贯叶金丝桃、刺五加两味中药组成。贯叶金丝桃已经有2400年的使用历史，近年来对金丝桃的研究热点放在抗抑郁功效方面。贯叶金丝桃醇提取的主要成分为6类：萘并二蒽酮类（naphthoi-anthrones）、间苯三酚类（phloroglucinols）、黄酮类（flavonoids）、双黄酮类（biflavones）、苯丙烯酸类（phenylpropanes）、原花青素（proanthocyanidins）。另外，还有少量的单宁酸、氧杂蒽酮、挥发油和氨基酸等。刺五加始见于《神农本草经》，2010年版《中国药典》记载其有“益气健脾，补肾安神”的功效。文献报道其主要的化学成分有刺五加皂苷、黄酮类、多糖类、三萜皂苷类、木脂素和咖啡酰奎宁酸类等。由于舒肝解郁胶囊使用的药材贯叶金丝桃和刺五加均具有复杂的化学成分。因此，建立一种舒肝解郁胶囊的指纹图谱测定方法，特别是通过高效液相色谱法测定指纹图谱信息，从药物物质群整体的角度给予其质量控制具有非常重要的意义。

[0005] 目前对于舒肝解郁胶囊指纹图谱的测定尚未见报道。由于舒肝解郁胶囊所用药材刺五加和贯叶连翘中的药物活性成分都比较多，因此这两种药物同时检测（即检测舒肝解郁胶囊）时得到的指纹图谱必须清晰表现出刺五加和贯叶连翘中各自的有效活性成分，避免不同成分的峰出现重叠，这就给其指纹图谱的建立带来了不小的困难。现有技术中有大量报道刺五加或贯叶连翘指纹图谱的检测方法，然而，我们通过实验得知现有技术关于刺五加或贯叶连翘HPLC指纹图谱检测条件不能用于舒肝解郁胶囊指纹图谱的测定，其存在不能有效分离刺五加和贯叶连翘中各自的有效活性成分，检测时间长，效率低，操作复杂等缺点。例如CN1796992A公开了一种刺五加注射液指纹图谱检测方法，使用0.1％磷酸水溶液为流动相A，30％乙腈水溶液为B进行梯度洗脱，该方法中刺五加主要有效成分紫丁香苷在35分钟以后出峰，所需检测时间较长。罗国安等[刺五加注射液指纹图谱的建立及其在质量控制中的应用,罗国安等，中成药，2006年，第28卷，第1期]对刺五加注射液指纹图谱进行了研究，使用0.2％甲酸水溶液为流动相A，35％乙腈水溶液为B进行梯度洗脱，检测波长270nm，该方法中主要有效成紫丁香苷B在34分钟左右出峰，所需检测时间也较长。国家药典委员会于2011年公示的《刺五加注射液质量标准草案》中的刺五加指纹图谱检测方法以乙腈-水（30：70）为流动相A，0.5%甲酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，检测波长270 nm，其紫丁香苷在40分钟左右出峰，所需检测时间任然较长。刘朝燊[硕士论文，贯叶连翘提取工艺及质量控制体系的构建，中山大学，2004年]中对贯叶连翘提取物指纹图谱进行了研究，采用甲醇为流动相A，水缓冲盐(94.9％水，5％甲醇，0.1％磷酸，三乙胺调pH=4.50)为流动相B，乙腈为流动相C进行梯度洗脱，检测波长254nm，该方法有效将贯叶连翘提取物中活性成分分离，但其流动相配制相对复杂。CN200710118972.0公开了一种贯叶连翘总黄酮制备成的制剂的HPLC指纹图谱检测方法，使用乙腈为流动相A，0.1-1.0％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，该方法中所述贯叶连翘总黄酮中含量最多的有效成分芦丁在23分钟左右出峰，槲皮素在52分钟左右出峰，整个检测时间较长。麻秀芳等[连翘药材化学成分指纹图谱研究，山西林业科技，2011年，第40卷，第1期]开展的贯叶连翘药材化学成分指纹图谱研究，采用1%醋酸水溶液为流动相A，含有1%醋酸的乙腈溶液为甲酸溶液为流动相B，检测波长265 nm，其芦丁在46分钟左右出峰，其检测时间也较长。

发明内容

[0006] 本发明提供了一种药物组合物指纹图谱的测定方法，包括以下步骤：

[0007] （a）供试品溶液制备：取药物适量，置于量瓶中，加入甲醇与水的混合溶液超声溶解，定容，滤过，即为供试品溶液；

[0008] （b）色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，检测波长240-300nm；

[0009] （c）测定：吸取上述供试品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到该药物组合物指纹图谱；

[0010] 所述药物组合物选自舒肝解郁胶囊、贯叶连翘提取物或刺五加提取物。

[0011] 所述（a）步骤中优选检测波长为240-300nm，流速为0.5ml/min，柱温为25-35℃，进样体积为1-10ul；进一步优选检测波长为265nm，流速为0.5ml/min，柱温为30℃，进样体积为5ul；

[0012] 所述（a）步骤中优选甲醇与水的混合溶液为20%~75%的甲醇溶液。

[0013] 所述（a）步骤中优选供试品溶液制备方法为：取药物0.20~0.25g，置于25ml量瓶中，加入50%CH3OH溶液，超声30min，溶解，加50%CH3OH定容至刻度，滤过，即得试品样品溶液。

[0014] 所述（a）步骤中优选色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；

[0015] 梯度洗脱程序为：

[0016] 0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；

[0017] 10min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；

[0018] 20min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；

[0019] 30min时，流动相A为65%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为35%的乙腈；

[0020] 40min时，流动相A为45%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为55%的乙腈；

[0021] 45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；

[0022] 50min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；

[0023] 51-60min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；

[0024] 测得的舒肝解郁胶囊指纹图谱中含有13个单峰面积占总峰面积百分比超过1%的共有指纹峰，分别为：

[0025] 1号峰，保留时间RT为12.45，RSD为0.08%，峰面积为365.49，RSD为28.82%；

[0026] 2号峰，保留时间RT为13.85，RSD为0.14%，峰面积为272.90，RSD为31.95%；

[0027] 4号峰，保留时间RT为17.40，RSD为0.09%，峰面积为535.48，RSD为25.40%；

[0028] 5号峰，保留时间RT为17.81，RSD为0.09%，峰面积为543.92，RSD为33.10%；

[0029] 6号峰，保留时间RT为18.31，RSD为0.08%，峰面积为279.93，RSD为35.21%；

[0030] 9号峰，保留时间RT为25.02，RSD为0.06%，峰面积为2136.24，RSD为13.35%；

[0031] 10号峰，保留时间RT为25.70，RSD为0.05%，峰面积为1934.51，RSD为25.88%；

[0032] 11号峰，保留时间RT为25.97，RSD为0.05%，峰面积为2221.12，RSD为13.79%；

[0033] 13号峰，保留时间RT为27.18，RSD为0.01%，峰面积为150.16，RSD为19.44%；

[0034] 14号峰，保留时间RT为27.60，RSD为0.05%，峰面积为804.87，RSD为12.59%；

[0035] 15号峰，保留时间RT为27.94，RSD为0.05%，峰面积为416.84，RSD为19.74%；

[0036] 19号峰，保留时间RT为33.70，RSD为0.04%，峰面积为1757.78，RSD为27.66%；

[0037] 20号峰，保留时间RT为37.51，RSD为0.04%，峰面积为307.31，RSD为16.64%；所测得的舒肝解郁胶囊指纹图谱中还含有13个单峰面积占总峰面积百分比未超过1%的共有指纹峰，分别为：

[0038] 3号峰，保留时间RT为16.15，峰面积为79.84，占总峰面积百分比为0.62%；

[0039] 7号峰，保留时间RT为21.56，峰面积为95.12，占总峰面积百分比为0.76%；

[0040] 8号峰，保留时间RT为22.81，峰面积为30.48，占总峰面积百分比为0.21%；

[0041] 12号峰，保留时间RT为26.78，峰面积为45.62，占总峰面积百分比为0.35%；

[0042] 16号峰，保留时间RT为28.43，峰面积为18.87，占总峰面积百分比为0.13%；

[0043] 17号峰，保留时间RT为28.78，峰面积为33.07，占总峰面积百分比为0.26%；

[0044] 18号峰，保留时间RT为29.69，峰面积为55.36，占总峰面积百分比为0.42%；

[0045] 21号峰，保留时间RT为48.26，峰面积为2.90，占总峰面积百分比为0.02%；

[0046] 22号峰，保留时间RT为50.50，峰面积为29.03，占总峰面积百分比为0.20%；

[0047] 23号峰，保留时间RT为51.12，峰面积为1.45，占总峰面积百分比为0.01%；

[0048] 24号峰，保留时间RT为51.75，峰面积为52.26，占总峰面积百分比为0.36%；

[0049] 26号峰，保留时间RT为52.35，峰面积为2.90，占总峰面积百分比为0.01%；

[0050] 25号峰，保留时间RT为52.10，峰面积为1.45，占总峰面积百分比为0.02%；

[0051] 所测得的贯叶金丝桃提取物指纹图谱中共有指纹峰为：

[0052] 1号峰，保留时间RT为12.58min，峰面积为139.52，占总峰面积百分比为2.06%；

[0053] 2号峰，保留时间RT为14.02min，峰面积为49.23，占总峰面积百分比为0.73%；

[0054] 3号峰，保留时间RT为18.07min，峰面积为122.54，占总峰面积百分比为1.81%；

[0055] 4号峰，保留时间RT为18.50min，峰面积为36.08，占总峰面积百分比为0.53%；

[0056] 5号峰，保留时间RT为25.19min，峰面积为1345.87，占总峰面积百分比为19.83%；

[0057] 6号峰，保留时间RT为25.90min，峰面积为1224.44，占总峰面积百分比为18.04%；

[0058] 7号峰，保留时间RT为26.15min，峰面积为1307.68，占总峰面积百分比为19.27%；

[0059] 8号峰，保留时间RT为27.78min，峰面积为505.83，占总峰面积百分比为7.45%；

[0060] 9号峰，保留时间RT为28.09min，峰面积为215.12，占总峰面积百分比为3.17%；

[0061] 10号峰，保留时间RT为29.01min，峰面积为7.30，占总峰面积百分比为0.11%；

[0062] 11号峰，保留时间RT为29.81min，峰面积为41.98，占总峰面积百分比为0.62%；

[0063] 12号峰，保留时间RT为33.87min，峰面积为940.09，占总峰面积百分比为13.85%；

[0064] 13号峰，保留时间RT为37.72min，峰面积为168.23，占总峰面积百分比为2.48%；

[0065] 14号峰，保留时间RT为48.24min，峰面积为2.22，占总峰面积百分比为0.03%；

[0066] 15号峰，保留时间RT为50.72min，峰面积为0.35，占总峰面积百分比为0.01%；

[0067] 16号峰，保留时间RT为51.07min，峰面积为1.58，占总峰面积百分比为0.02%；

[0068] 17号峰，保留时间RT为51.83min，峰面积为19.72，占总峰面积百分比为0.29%；

[0069] 18号峰，保留时间RT为52.48min，峰面积为1.55，占总峰面积百分比为0.02%；

[0070] 19号峰，保留时间RT为52.96min，峰面积为1.94，占总峰面积百分比为0.03%；

[0071] 所测得的刺五加提取物指纹图谱中共有指纹峰为：

[0072] 1号峰，保留时间RT为12.60min，峰面积为123.82，占总峰面积百分比为5.47%；

[0073] 2号峰，保留时间RT为14.02min，峰面积为266.82，占总峰面积百分比为11.79%；

[0074] 3号峰，保留时间RT为16.36min，峰面积为88.02，占总峰面积百分比为3.89%；

[0075] 4号峰，保留时间RT为17.57min，峰面积为409.19，占总峰面积百分比为18.08%；

[0076] 5号峰，保留时间RT为18.06min，峰面积为318.40，占总峰面积百分比为14.07%；

[0077] 6号峰，保留时间RT为18.49min，峰面积为291.64，占总峰面积百分比为12.88%；

[0078] 7号峰，保留时间RT为21.81min，峰面积为128.95，占总峰面积百分比为5.70%；

[0079] 8号峰，保留时间RT为22.88min，峰面积为32.84，占总峰面积百分比为1.45%；

[0080] 9号峰，保留时间RT为25.83min，峰面积为31.10，占总峰面积百分比为1.37%；

[0081] 10号峰，保留时间RT为27.37min，峰面积为48.01，占总峰面积百分比为2.12%；

[0082] 11号峰，保留时间RT为28.97min，峰面积为19.72，占总峰面积百分比为0.87%。

[0083] 通过以上舒肝解郁胶囊指纹图谱、贯叶金丝桃提取物指纹图谱、刺五加提取物指纹图谱信息可以看出：本发明检测方法得到的舒肝解郁胶囊指纹图谱包含了贯叶金丝桃提取物指纹图谱和刺五加提取物指纹图谱中的共有吸收峰，说明采用本方法检测得到的舒肝解郁胶囊指纹图谱可以客观反应舒肝解郁胶囊内在有效成分的含量和有无，便于全面控制产品质量。

[0084] 本发明优点如下：

[0085] 1、本发明建立的舒肝解郁胶囊HPLC指纹图谱检测方法及其指纹图谱，对于其有效成分贯叶金丝桃和刺五加大部分药理活性物质进行了有效表征，实现了最大可能的对其化学成分进行检测。提供了一种通过整体的指纹图谱信息对舒肝解郁胶囊质量进行评价的方法，避免了只测定其中一、二个化学成分就对舒肝解郁胶囊整体质量判断的片面性，使得舒肝解郁胶囊质量控制更加客观和准确；

[0086] 2、本发明所提供的指纹图谱检测方法其刺五加主要有效成分在22分钟之前出峰，贯叶连翘主要成分在24分钟后出峰，两种药材各自有效成分的峰分离性好；

[0087] 3、本发明所提供的指纹图谱检测方法所需检测时间合理，主要活性成分的峰在40分钟内出峰，并且峰强度都较大，因此使得检测效率高效；

[0088] 4、本发明所提供的指纹图谱检测方法其重复性和稳定性好；

[0089] 5、本发明所提供的指纹图谱检测方法避免了在流动相中使用磷酸，使其能够在经高效液相色谱检测后直接与质谱仪联用，有效确定相关物质的结构，更好的监控相关药物的质量。附图说明：

[0090] 图1有效成分对照品HPLC色谱图

[0091] 其中：峰1为紫丁香苷，峰2为绿原酸，峰3为芦丁，峰4为金丝桃苷，峰5为异嗪吡啶，峰6为槲皮苷，峰7为槲皮素。

[0092] 图2空白基线HPLC色谱图

[0093] 图3舒肝解郁胶囊HPLC指纹图谱

[0094] 图4舒肝解郁胶囊HPLC指纹图谱（局部放大图）

[0095] 图5舒肝解郁胶囊HPLC指纹图谱（局部放大图）

[0096] 图6贯叶金丝桃提取物HPLC指纹图谱

[0097] 图7刺五加提取物HPLC指纹图谱

[0098] 图8不同批次舒肝解郁胶囊HPLC指纹图谱（10个批次）

[0099] 图9实施例三HPLC色谱图

具体实施方式

[0100] 实施例一 贯叶金丝桃指纹图谱的测定

[0101] 1、试 剂：乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)、甲 酸为 分析 纯（Sigma aldrich Company Inc.USA)、纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）。

[0102] 2、仪 器：Agilent Infinity 1290(CA,USA) 与 Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(San Jose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。

[0103] 3、贯叶金丝桃提取物样品制备：取实施例五制备得到的贯叶金丝桃提取物，称量0.22g，置于25ml量瓶中，加入50%CH3OH溶液，超声30min，溶解，加50%CH3OH定容至刻度，滤过，即得贯叶金丝桃提取物样品溶液；

[0104] 4、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为：

[0105] 0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；

[0106] 10min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；

[0107] 20min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；

[0108] 30min时，流动相A为65%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为35%的乙腈；

[0109] 40min时，流动相A为45%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为55%的乙腈；

[0110] 45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；

[0111] 50min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；

[0112] 51-60min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；

[0113] 检测波长265nm，流速为0.5ml/min，柱温为30℃，进样体积为5ul；

[0114] 5、测定：吸取上述贯叶金丝桃提取物样品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到贯叶金丝桃提取物指纹图谱（见附图6），其中共有指纹峰为：

[0115] 1号峰，保留时间RT为12.58min，峰面积为139.52，占总峰面积百分比为2.06%；

[0116] 2号峰，保留时间RT为14.02min，峰面积为49.23，占总峰面积百分比为0.73%；

[0117] 3号峰，保留时间RT为18.07min，峰面积为122.54，占总峰面积百分比为1.81%；

[0118] 4号峰，保留时间RT为18.50min，峰面积为36.08，占总峰面积百分比为0.53%；

[0119] 5号峰，保留时间RT为25.19min，峰面积为1345.87，占总峰面积百分比为19.83%；

[0120] 6号峰，保留时间RT为25.90min，峰面积为1224.44，占总峰面积百分比为18.04%；

[0121] 7号峰，保留时间RT为26.15min，峰面积为1307.68，占总峰面积百分比为19.27%；

[0122] 8号峰，保留时间RT为27.78min，峰面积为505.83，占总峰面积百分比为7.45%；

[0123] 9号峰，保留时间RT为28.09min，峰面积为215.12，占总峰面积百分比为3.17%；

[0124] 10号峰，保留时间RT为29.01min，峰面积为7.30，占总峰面积百分比为0.11%；

[0125] 11号峰，保留时间RT为29.81min，峰面积为41.98，占总峰面积百分比为0.62%；

[0126] 12号峰，保留时间RT为33.87min，峰面积为940.09，占总峰面积百分比为13.85%；

[0127] 13号峰，保留时间RT为37.72min，峰面积为168.23，占总峰面积百分比为2.48%；

[0128] 14号峰，保留时间RT为48.24min，峰面积为2.22，占总峰面积百分比为0.03%；

[0129] 15号峰，保留时间RT为50.72min，峰面积为0.35，占总峰面积百分比为0.01%；

[0130] 16号峰，保留时间RT为51.07min，峰面积为1.58，占总峰面积百分比为0.02%；

[0131] 17号峰，保留时间RT为51.83min，峰面积为19.72，占总峰面积百分比为0.29%；

[0132] 18号峰，保留时间RT为52.48min，峰面积为1.55，占总峰面积百分比为0.02%；

[0133] 19号峰，保留时间RT为52.96min，峰面积为1.94，占总峰面积百分比为0.03%。

[0134] 实施例二 刺五加提取物指纹图谱的测定

[0135] 1、试 剂：乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)、甲 酸为 分析 纯（Sigma aldrich Company Inc.USA)、纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）。

[0136] 2、仪 器：Agilent Infinity 1290(CA,USA) 与 Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(San Jose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。

[0137] 3、刺五加提取物样品制备：取实施例六制备得到的刺五加提取物，称量0.20g，置于25ml量瓶中，加入50%CH3OH溶液，超声30min，溶解，加50%CH3OH定容至刻度，滤过，即得刺五加提取物样品溶液；

[0138] 4、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为：

[0139] 0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；

[0140] 10min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；

[0141] 20min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；

[0142] 30min时，流动相A为65%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为35%的乙腈；

[0143] 40min时，流动相A为45%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为55%的乙腈；

[0144] 45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；

[0145] 50min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；

[0146] 51-60min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；

[0147] 检测波长265nm，流速为0.5ml/min，柱温为30℃，进样体积为5ul；

[0148] 5、测定：吸取上述刺五加提取物样品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到刺五加提取物指纹图谱（见附图7），其中共有指纹峰为：

[0149] 1号峰，保留时间RT为12.60min，峰面积为123.82，占总峰面积百分比为5.47%；

[0150] 2号峰，保留时间RT为14.02min，峰面积为266.82，占总峰面积百分比为11.79%；

[0151] 3号峰，保留时间RT为16.36min，峰面积为88.02，占总峰面积百分比为3.89%；

[0152] 4号峰，保留时间RT为17.57min，峰面积为409.19，占总峰面积百分比为18.08%；

[0153] 5号峰，保留时间RT为18.06min，峰面积为318.40，占总峰面积百分比为14.07%；

[0154] 6号峰，保留时间RT为18.49min，峰面积为291.64，占总峰面积百分比为12.88%；

[0155] 7号峰，保留时间RT为21.81min，峰面积为128.95，占总峰面积百分比为5.70%；

[0156] 8号峰，保留时间RT为22.88min，峰面积为32.84，占总峰面积百分比为1.45%；

[0157] 9号峰，保留时间RT为25.83min，峰面积为31.10，占总峰面积百分比为1.37%；

[0158] 10号峰，保留时间RT为27.37min，峰面积为48.01，占总峰面积百分比为2.12%；

[0159] 11号峰，保留时间RT为28.97min，峰面积为19.72，占总峰面积百分比为0.87%；

[0160] 实施例三 舒肝解郁胶囊指纹图谱检测

[0161] 1、样品：取实施例四制备的舒肝解郁胶囊样品，批号：110902。

[0162] 2、试 剂：乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)、甲 酸为 分析 纯（Sigma aldrich Company Inc.USA)、纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）、醋酸铵（广东光华化学厂有限公司，中国）。

[0163] 3、仪 器：Agilent Infinity 1290(CA,USA) 与 Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(San Jose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。

[0164] 4、舒肝解郁胶囊样品溶液制备：取舒肝解郁胶囊样品胶囊内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%CH3OH约20ml，超声30min，加50%CH3OH至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。

[0165] 5、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（Eclipse Plus C18，5um，250*4.6mm，Agilent）；流动相以0.5%甲酸和20mM醋酸铵水溶液（0.5%HCOOH，20mMNH4Ac）为流动相A，为乙腈流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为：

[0166] 0-3min时，95%的流动相A，5%的流动相B

[0167] 20min时，85%的流动相A，15%的流动相B

[0168] 40min时，80%的流动相A，20%的流动相B

[0169] 55min时，55%的流动相A，45%的流动相B

[0170] 65min时，30%的流动相A，70%的流动相B

[0171] 75min时，0%的流动相A，100%的流动相B

[0172] 85min时，0%的流动相A，100%的流动相B

[0173] 86-94min时，95%的流动相A，5%的流动相B

[0174] 流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为265nm，进样体积：5ul。

[0175] 6、结果：上述条件检测方法需要较长的梯度时间才能检测出所有有效成分，总时间长达94min。检测结果见图7。

[0176] 该方法同本发明实验方法对比见表1：

[0177] 表1 对比例同本发明检测方法对比

[0178]

[0179] 从上表可明显看出：这两个主要成分峰面积基本一致，但峰高方面本发明方法至少是对比例方法的2倍右左，且本发明方法流动相配制简单，甲酸比例为0.1%，对质谱检测干扰很小。

[0180] 实施例四 舒肝解郁胶囊的制备

[0181] 本发明所涉及的舒肝解郁胶囊主要由贯叶金丝桃提取物和刺五加提取物组成。该药物的制备方法优选为贯叶金丝桃1800g，刺五加1500g，以上两味药材，贯叶金丝桃加75%乙醇回流提取两次，第一次10倍量，第二次8倍量，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.10（70℃），喷雾干燥得干浸膏粉；刺五加加8倍量水，煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.18（70℃）的浸膏，喷雾干燥得干浸膏粉。取上述两种干浸膏粉，加入适量辅料（预胶化淀粉52g，滑石粉18g，硬脂酸镁2g）混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。

[0182] 实施例五 贯叶金丝桃提取物的制备

[0183] 贯叶金丝桃提取物的制备：贯叶金丝桃药材1800g粉碎后用75%乙醇回流提取两次，第一次10倍量75%乙醇，第二次8倍量75%乙醇，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.10（70℃），喷雾干燥得贯叶金丝桃提取物

[0184] 实施例六 刺五加提取物的制备

[0185] 刺五加提取物的制备：取刺五加药材1500g粉碎，加8倍量水，煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.18（70℃）的浸膏，喷雾干燥得刺五加提取物。

[0186] 实施例七 舒肝解郁胶囊指纹图谱检测

[0187] （1）舒肝解郁胶囊的指纹图谱的测定

[0188] 1、样品：取实施例四制备的舒肝解郁胶囊样品，批号：110902。

[0189] 2、试 剂：乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)、甲 酸为 分析 纯（Sigma aldrich Company Inc.USA)、纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）

[0190] 3、仪 器：Agilent Infinity 1290(CA,USA) 与 Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(San Jose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。

[0191] 4、舒肝解郁胶囊样品溶液制备：取舒肝解郁胶囊样品内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%CH3OH约20ml，超声30min，加50%CH3OH至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。

[0192] 5、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（Eclipse Plus C18，5um，250*4.6mm，Agilent）；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，按梯度洗脱，洗脱程序如下：

[0193] 0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；

[0194] 10min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；

[0195] 20min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；

[0196] 30min时，流动相A为65%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为35%的乙腈；

[0197] 40min时，流动相A为45%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为55%的乙腈；

[0198] 45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；

[0199] 50min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；

[0200] 51-60min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；

[0201] 流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为265nm，进样体积：5ul。

[0202] 6、指纹图谱数据：

[0203] 测得的舒肝解郁胶囊指纹图谱中含有13个单峰面积占总峰面积百分比超过1%的共有指纹峰，分别为：

[0204] 1号峰，保留时间RT为12.48，峰面积为371.40，占总峰面积百分比为2.76%；

[0205] 2号峰，保留时间RT为13.83，峰面积为272.07，占总峰面积百分比为2.12%；

[0206] 4号峰，保留时间RT为17.41，峰面积为541.52，占总峰面积百分比为4.13%；

[0207] 5号峰，保留时间RT为17.80，峰面积为543.00，占总峰面积百分比为4.23%；

[0208] 6号峰，保留时间RT为18.31，峰面积为279.62，占总峰面积百分比为2.19%；

[0209] 9号峰，保留时间RT为25.02，峰面积为2125.66，占总峰面积百分比为16.24%；

[0210] 10号峰，保留时间RT为25.71，峰面积为1948.00，占总峰面积百分比为14.50%；

[0211] 11号峰，保留时间RT为25.97，峰面积为2228.14，占总峰面积百分比为16.83%；

[0212] 13号峰，保留时间RT为27.19，峰面积为150.37，占总峰面积百分比为1.14%；

[0213] 14号峰，保留时间RT为27.61，峰面积为802.03，占总峰面积百分比为6.05%；

[0214] 15号峰，保留时间RT为27.95，峰面积为418.13，占总峰面积百分比为3.13%；

[0215] 19号峰，保留时间RT为33.72，峰面积为1770.37，占总峰面积百分比为13.16%；

[0216] 20号峰，保留时间RT为37.55，峰面积为305.84，占总峰面积百分比为2.32%；

[0217] 所测得的舒肝解郁胶囊指纹图谱中还含有13个单峰面积占总峰面积百分比未超过1%的共有指纹峰，分别为：

[0218] 3号峰，保留时间RT为16.19，峰面积为80.94，占总峰面积百分比为0.63%；

[0219] 7号峰，保留时间RT为21.56，峰面积为94.02，占总峰面积百分比为0.75%；

[0220] 8号峰，保留时间RT为22.81，峰面积为26.89，占总峰面积百分比为0.21%；

[0221] 12号峰，保留时间RT为26.77，峰面积为45.73，占总峰面积百分比为0.34%；

[0222] 16号峰，保留时间RT为28.43，峰面积为18.36，占总峰面积百分比为0.14%；

[0223] 17号峰，保留时间RT为28.78，峰面积为32.90，占总峰面积百分比为0.26%；

[0224] 18号峰，保留时间RT为29.69，峰面积为54.41，占总峰面积百分比为0.41%；

[0225] 21号峰，保留时间RT为48.25，峰面积为5.21，占总峰面积百分比为0.05%；

[0226] 22号峰，保留时间RT为50.49，峰面积为22.19，占总峰面积百分比为0.17%；

[0227] 23号峰，保留时间RT为51.21，峰面积为1.05，占总峰面积百分比为0.01%；

[0228] 24号峰，保留时间RT为51.75，峰面积为39.80，占总峰面积百分比为0.31%；

[0229] 25号峰，保留时间RT为52.39，峰面积为2.69，占总峰面积百分比为0.02%；

[0230] 26号峰，保留时间RT为52.84，峰面积为36.58，占总峰面积百分比为0.29%。

[0231] （2）舒肝解郁胶囊指纹图谱中有效成分的鉴定

[0232] 本发明还对上述得到的舒肝解郁胶囊指纹图谱中化合物的结构进行了研究，通过液相色谱-电喷雾离子阱质谱分析方法以及和有效成分对照品液相色谱数据对比，鉴定了上述舒肝解郁胶囊指纹图谱中22个共有吸收峰的化学成分，即通过将色谱峰的保留时间同有效成分对照品的保留时间对比，以及将其质谱数据同文献的质谱数据进行对比，最终确认其结构。其中有6个化合物是通过与有效成分对照品保留时间进行对照从而确证结构的。

[0233] 其中对照品的高效液相色谱测定方法为：

[0234] 1）有效成分对照品：分别是金丝桃苷（批号111521-2001004）、芦丁（批号100080-200707）、紫丁香苷（批号111574-200502）、绿原酸（批号110753-200413）、槲皮素（批号100081-200406）、槲皮苷（批号111538-200302）和异嗪吡啶（批号110837-201005）、均购自中国药品生物制品检定所。

[0235] 2）有效成分对照品溶液的制备：分别取适量的对照品，置加入50%甲醇水1ml的EP管中，超声10min，即得。

[0236] 3）液相色谱条件和测定方法同本实施例中“舒肝解郁胶囊的指纹图谱的测定”中的液相色谱条件和测定方法相同。

[0237] 4）有效成分对照品HPLC色谱图详见附图1。

[0238] 其中液相色谱-电喷雾离子阱质谱分析方法为：将有高效液相色谱仪的紫外检测器出来的溶液经过分流，进入质谱仪进行物质测；质谱仪检测条件优选为：质谱仪流速为0.2ml/min。电喷雾电离，正离子模式和负离子模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气。正离子模式下：喷雾电压3.6kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为10V，透镜电压为80V。负离子模式下：喷雾电压5kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为-10V，透镜电压为-100V。全扫描质量范围：210-1000amu。二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响应度强度最高的3个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev。

[0239] 所述液相色谱-电喷雾离子阱质谱分析方法测定结果详见表2。

[0240] 表2 舒肝解郁胶囊化合物鉴定表

[0241]

[0242]

[0243] 注：“/”表示该化合物在相应的离子模式下没响应，“a”表示化合物通过与对照品对比确定结构。

[0244] 被鉴定的22个化合物结构如下：

[0245]

[0246]

[0247] 其中上述化合物名称为：1、新绿原酸（Neochlorogenic acid）；2、紫丁香苷（Eleutheroside B/syringoside）；3、Chlorogenic acid（绿原酸）；4、1’-咖啡酰奎宁酸(1’-O-caffeoylquinic acid)；5、3’,5’-二咖啡酰奎宁酸(3’,5’-O-dicaffeoylquinic acid)；6、刺五加苷E(Eleutheroside E)；7、芦丁（Rutin）；8、金丝桃苷（Hyperoside）；9、异 槲 皮 苷（Isoquercitrin）；10、异 嗪 吡 啶（Isofaxidin）；11、1’,5’- 二 咖 啡酰 奎 宁 酸 (1’,5’-O-dicaffeoylquinic acid)；12、槲 皮 素 -3-β-D-阿 拉 伯 糖（Quercetin-3-β-D-arabinose）；13、槲皮苷（Quercitrin）；14、4’,5’-二咖啡酰奎宁酸(4’,5’-O-dicaffeoylquinic acid)；15、乙酰氧基金丝桃苷(Acetyl-hyperoside)；
16、槲皮素（Quercetin）；17、I3,II8穗花杉双黄酮（I3,II8-Biapigenin）；18、原伪金丝桃素(Protopseudohypericin)；19、贯叶金丝桃素(Hyperforin)；20、加贯叶金丝桃素(Adhyperforin)；21、金丝桃素（Hypericin）；22、伪金丝桃素(Pseudohypericin)。

[0248] 实施例八 舒肝解郁胶囊指纹图谱检测

[0249] 1、样品：按照实施例四制备的舒肝解郁胶囊，批号100701。

[0250] 2、试 剂：乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)、甲 酸为 分析 纯（Sigma aldrich Company Inc.USA)、纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）

[0251] 3、仪 器：Agilent Infinity 1290(CA,USA) 与 Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(San Jose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。

[0252] 4、舒肝解郁胶囊样品溶液制备：取舒肝解郁胶囊样品内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%CH3OH约20ml，超声30min，加50%CH3OH至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。

[0253] 5、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（Eclipse Plus C18，5um，250*4.6mm，Agilent）；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，按梯度洗脱，洗脱程序如下：

[0254] 0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；

[0255] 10min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；

[0256] 20min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；

[0257] 30min时，流动相A为65%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为35%的乙腈；

[0258] 40min时，流动相A为45%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为55%的乙腈；

[0259] 45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；

[0260] 50min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；

[0261] 51-60min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；

[0262] 流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为265nm，进样体积：5ul。

[0263] 6、检测

[0264] （1）溶液稳定性实验

[0265] 按照上述方法，测定提取后溶液在4℃条件下，放置0、4、16和48h的溶液稳定性，测定结果见表3：

[0266] 表3 溶液稳定性实验结果

[0267]

[0268] 以上结果显示所有成分峰面积的RSD%<3%，证明该溶液在4℃条件下48h内稳定。

[0269] （2）重现性实验

[0270] 按上述试验方法，平行测定6份，测定结果见表4：

[0271] 表4 重现性实验结果

[0272]峰号 平均保留时间 平均保留时间RSD% 平均峰面积 峰面积RSD% 单峰占总峰面积百分比
1 12.47min 0.03% 248.88 1.55% 1.96%
2 13.89min 0.01% 330.14 1.81% 2.60%
3 16.2min 0.02% 120.63 2.33% 0.95%
4 17.42min 0.04% 694.57 2.54% 5.47%
5 17.82min 0.01% 864.72 1.98% 6.81%
6 18.31min 0.01% 444.43 1.57% 3.50%
7 21.44min 0.03% 151.10 1.83% 1.19%
8 22.8min 0.02% 27.94 2.01% 0.22%
9 25.04min 0.04% 1890.71 2.51% 14.89%
10 25.73min 0.01% 1762.46 0.67% 13.88%
11 25.98min 0.01% 1823.41 0.84% 14.36%
12 26.75min 0.03% 44.44 1.62% 0.35%
13 27.2min 0.04% 153.64 2.80% 1.21%
14 27.63min 0.01% 754.25 0.76% 5.94%
15 27.94min 0.01% 275.54 0.47% 2.17%
16 28.42min 0.03% 21.59 2.20% 0.17%
17 28.78min 0.01% 55.87 2.76% 0.44%
18 29.69min 0.01% 58.41 1.77% 0.46%
19 33.71min 0.03% 1285.02 2.73% 10.12%
20 37.52min 0.01% 252.69 0.57% 1.99%
21 48.23min 0.01% 5.71 1.97% 0.05%
22 50.48min 0.03% 23.29 2.43% 0.18%
23 51.22min 0.01% 1.16 2.57% 0.01%
24 51.74min 0.01% 42.02 1.72% 0.33%
25 52.44min 0.03% 2.95 2.78% 0.02%
26 52.83min 0.01% 35.02 1.57% 0.28%

[0273] 以上结果显示平行6份样品间峰面积的RSD%<3%，证明该方法重现性良好。

[0274] 同时本申请发明人考察获知，当采用甲酸水-乙腈体系作为流动相时更适合于高效液相色谱-质谱联用检测舒肝解郁胶囊，舒肝解郁胶囊中刺五加和贯叶连翘的主要活性物质能达到较理想的分离，没有重叠，且峰形优异。

[0275] 本申请发明人通过二极管阵列检测器（DAD检测器检测）检测舒肝解郁吸收波长，发现舒肝解郁中的各个成分在200-400nm范围内有吸收，其在240-300nm处均有吸收，均适合作为检测波长条件，其中当检测波长为265nm时样品中的各个成分均有吸收且主要化合物具有较强吸收。

[0276] 本申请发明人还考察了不同提取液对待测品的提取效果对检测结果的影响，包括水、乙醇水溶液以及甲醇水溶液。结果显示乙醇水溶液提取的效果不如水和甲醇水溶液：例如75%CH3OH提取样品的各峰峰高和峰面积均明显大于75%CH3CH2OH提取的样品。当使用水或含有甲醇的水溶液（含量包括75%CH3OH、50%CH3OH、25%CH3OH）时，样品的检测结果均可以，其中当使用50%CH3OH时，其检测效果最好。

[0277] 实施例九 舒肝解郁胶囊的指纹图谱

[0278] 1、样品：实施例四制备的舒肝解郁胶囊各批次样品（批号100601、100603、100701、100702、100703、100704、100705、100801、100802、100901、100902、101002、110412、
110601、110511、110705、110803、110903、111003、111111、111113、111122、111203、111204、
111205、111206、111207、111208、111211、111212）

[0279] 2、试 剂：乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)、甲 酸为 分析 纯（Sigma aldrich Company Inc.USA)、纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）

[0280] 3、仪 器：Agilent Infinity 1290(CA,USA) 与 Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(San Jose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。

[0281] 4、舒肝解郁胶囊供试品溶液制备：分别取实施例四制备的舒肝解郁胶囊各批次样品内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%CH3OH约20ml，超声30min，加50%CH3OH至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。

[0282] 5、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（Eclipse Plus C18，5um，250*4.6mm，Agilent）；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，按梯度洗脱，洗脱程序如下：

[0283] 0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；

[0284] 10min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；

[0285] 20min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；

[0286] 30min时，流动相A为65%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为35%的乙腈；

[0287] 40min时，流动相A为45%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为55%的乙腈；

[0288] 45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；

[0289] 50min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；

[0290] 51-60min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；

[0291] 流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为265nm，进样体积：5ul。

[0292] 6、数据分析

[0293] 共对30批舒肝解郁胶囊进行了指纹图谱检测，其相似度在90%以上。所有图谱平均保留时间、峰面积平均值以及RSD数据见表5。其中十批次检测谱图见图8。

[0294] 表5 舒肝解郁胶囊指纹图谱检测结果（30批次）

[0295]

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