一种在贝类幼虫中定量检测甲状腺激素的方法

摘要

本发明涉及生物学领域，具体说是一种简单快速准确的测定贝类中的甲状腺激素含量的方法。该方法包括如下步骤：将幼虫样品用研磨成粉末状；低温干燥，分成AB两部分，将A部分样品准确称量干重后，加入NaOH溶液，浸润1h以上，提取甲状腺激素，离心上清用于定量检测甲状腺激素的含量；将B部分样品准确称量干重后加入细胞裂解液和PMSF室温放置1h以上，裂解细胞释放蛋白；用于检测样品中总蛋白含量；将数据整合，计算出幼虫中每克蛋白含甲状腺激素x克，即x g/g protein。本发明提供的方法能简单，快速，准确的测定出贝类中的甲状腺激素含量。预处理步骤简单，无毒操作。适用于两种甲状腺激素的定量检测。

权利要求

1.一种在贝类幼虫中定量检测甲状腺激素的方法，其特征在于:该方法包括如下步骤：

1）将幼虫样品用液氮研磨法研磨成粉末状；

2）研磨后进行低温干燥，分成AB两部分分别用于以下步骤；

3）将A部分样品准确称量干重后，按固定比例加入0.01mol/L NaOH溶液，2-8℃下充分浸润1h以上提取甲状腺激素；

4）8000-12000rpm离心5-10min，取上清；

5）取步骤4）中的上清，用于定量检测甲状腺激素的含量；即总甲状腺素T4和总3，5，

3′-三碘甲腺原氨酸T3；

6）将B部分样品准确称量干重后加入细胞裂解液和PMSF室温放置1h以上，裂解细胞释放蛋白；

7）将步骤6）中裂解细胞释放蛋白用于检测样品中总蛋白含量；

8）将数据整合，计算出幼虫中每克蛋白含甲状腺激素x克，即xg/gprotein。

2.根据权利要求1所述在贝类幼虫中定量检测甲状腺激素的方法，其特征在于：步骤

1）中所述的幼虫样品在液氮中冷冻成固体后，用研钵研磨成粉末状。

3.根据权利要求1所述在贝类幼虫中定量检测甲状腺激素的方法，其特征在于：步骤

2）中所述低温干燥是指用冷冻干燥仪-20℃至-50℃避光条件下干燥8-12h至完全干燥。

4.根据权利要求1所述在贝类幼虫中定量检测甲状腺激素的方法，其特征在于：步骤

3）中所述固定比例是指按照每1g干重中加入5ml的0.01mol/LNaOH溶液。

5.根据权利要求1所述在贝类幼虫中定量检测甲状腺素的方法，其特征在于：步骤5）中所述定量检测总的甲状腺素的含量是采用罗氏2010全自动生化分析仪定量检测甲状腺素的含量。

6.根据权利要求1所述在贝类幼虫中定量检测甲状腺激素的方法，其特征在于：步骤

6）中细胞裂解液和PMSF的加入量能够使样品完全裂解即可。

7.根据权利要求1所述在贝类幼虫中定量检测甲状腺激素的方法，其特征在于：步骤

7）中所述检测样品中总蛋白含量是采用BCA蛋白测定试剂盒检测样品中总蛋白含量。

说明书

一种在贝类幼虫中定量检测甲状腺激素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物学领域，具体说是一种简单快速准确的测定贝类中的甲状腺激素含量的方法。

背景技术

[0002] 甲状腺激素包含甲状腺素(T4)和3，5，3′-三碘甲腺原氨酸(T3)在脊椎动物中广泛存在，对生长发育，能量代谢和变态有重要作用。人类中与甲状腺激素相关的疾病很多，如呆小症，甲状腺肿大，甲亢等。为预防，诊断，治疗这些疾病，在人等高等动物中已经有一套非常成熟的检测手段，如放射性免疫，酶联免疫，电化学发光法等。

[0003] 近年来对甲状腺激素的进化研究是一个热点。但甲状腺激素在冠轮动物分支，特别是在贝类中的研究鲜见。在研究过程中直接检测其含量是其功能研究中最有力的手段之一。但放射性免疫，酶联免疫，电化学发光法都是以动物血清为检测目标，不能直接适用于组织中或无法获得血清的样本中甲状腺激素含量的检测。如果借用该检测系统，必须对样品进行预处理。而样品预处理的方法流程能直接决定最终检测结果是否准确；其中，在2011年06月30日王韶辉，文昌鱼类脊椎动物甲状腺-肝轴的证明，万方学位论文中公开了一种检测文昌鱼内柱中T3和T4含量的方法和在2006年12月31日Andereas Heyland等在文章“Thyroid hormone metabolism and peroxidase function in tow non-chordate animals.Journal of Experimental Zoology,”中公开了一种检测海胆幼虫中甲状腺激素的方法。

[0004] 在贝类幼虫中检测甲状腺激素有其特有的难度：1、贝类的卵或幼虫通常很小，需要收集大量的幼虫，收集同时会混有大量的海水，则不能以湿重为单位。2、幼虫发育过程中出现贝壳，不同时期中贝壳所占的体重的比例不同，均一化方法最好采用每克蛋白中含甲状腺激素x克(x g/g protein)。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对贝类幼虫样品中含有海水，且不同发育时期含壳量不同，不容易均一化等问题。提供一种快速，简单的样品预处理方法结合对人的甲状腺激素检测系统，实现对贝类幼虫样品中甲状腺激素的定量检测。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0007] 一种在贝类幼虫中定量检测甲状腺激素的方法，该方法包括如下步骤：

[0008] 1)将幼虫样品用液氮研磨法研磨成粉末状；

[0009] 2)研磨后进行低温干燥，分成AB两部分分别用于以下步骤；

[0010] 3)将A部分样品准确称量干重后，按固定比例加入0.01mol/L NaOH溶液，2-8℃下充分浸润1h以上提取甲状腺激素；

[0011] 4)8000-12000rpm离心5-10min，取上清；

[0012] 5)取步骤4)中的上清，用于定量检测甲状腺激素的含量，即总甲状腺素T4(x g/g干重)和总3，5，3′-三碘甲腺原氨酸T3(x g/g干重)；

[0013] 6)将B部分样品准确称量干重后加入细胞裂解液和PMSF室温放置1h以上，裂解细胞释放蛋白；

[0014] 7)将步骤6)中裂解细胞释放蛋白用于检测样品中总蛋白含量x g protein/g干重；

[0015] 8)将数据整合，计算出幼虫中每克蛋白含甲状腺激素x克(x g/g protein)。

[0016] 步骤1)中所述的含水幼虫样品在液氮中冷冻成固体后，用研钵研磨成粉末状。

[0017] 步骤2)中所述低温干燥是指用冷冻干燥仪-20℃至-50℃避光条件下干燥8-12h至完全干燥。

[0018] 步骤3)中所述固定比例是指按照每1g干重中加入5ml的0.01mol/L NaOH溶液。

[0019] 步骤5)中所述定量检测总的甲状腺素的含量是采用罗氏2010全自动生化分析仪定量检测甲状腺素的含量。

[0020] 步骤6)中细胞裂解液和PMSF的加入量能够使样品完全裂解即可。

[0021] 步骤7)中所述检测样品中总蛋白含量是采用BCA蛋白测定试剂盒检测样品中总蛋白含量。

[0022] 本发明具有以下优点：

[0023] 1.本发明提供的方法能简单，快速，准确的测定出贝类中的甲状腺激素含量。

[0024] 2.本发明提供的方法中的样品预处理步骤简单，无毒操作。

[0025] 3.本发明提供的方法能适用于两种甲状腺激素的定量检测，即甲状腺素T4(x g/g protein)和3，5，3′-三碘甲腺原氨酸T3(x g/g protein)。附图说明：

[0026] 图1为T4标准品色谱峰图，出峰时间为11.957min。

[0027] 图2为T3标准品色谱峰图，出峰时间为7.505min。

[0028] 图3为牡蛎幼虫样品色谱峰图，A峰:11.901min，B峰:7.535min。

具体实施方式

[0029] 下面的实施例中将以长牡蛎为实验对象对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。以下甲状腺素用T4简写表示，3，5，3′-三碘甲腺原氨酸用T3简写表示[0030] 实施例一

[0031] 高效液相色谱法(HPLC)在牡蛎中定性测定甲状腺激素。

[0032] 为确保牡蛎中的甲状腺激素与人的甲状腺激素是同一物质，本发明人采用高效液相色谱法对牡蛎中甲状腺激素进行了定性的分析。方法条件参照【Samanidou,V.F.,H.G.Gika,et al.(2000)."Rapid Hplc Analysis of Thyroid Gland Hormones Tri-Iodothyronine(T3)and Thyroxine(T4)in Human Biological Fluids after Spe."Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies 23(5):681-692.】。本发明使用高效液相色谱仪(岛津,LC-20A)，YMC-Pack ODS-AQ色谱柱(YMC公司)，流动相(色谱过程中携带待测组分向前移动的物质)为含有2％乙酸的CH3OH-H2O(体积比为
65:35)。上样量20ul，流速1mL/min，240nm紫外光检测。

[0033] 取过量标准品T4(Sigma，货号：T1775)和T3(Sigma，货号：T2877)，用2-5ml提取液(0.01mol/L NaOH溶液)配制T4，T3饱和溶液，与流动相1:1混合后上样。T4峰图见图1，T3峰图见图2。样品处理方法同实施例二，与流动相1:1混合后上样。样品峰图见图3。

[0034] 实验结果：T4标准品的出峰时间为11.957min；T3标准品的出峰时间为7.505min。样品中包含2个标准品对应的特征峰(A:11.901，B:7.535)。则可以判定，牡蛎幼虫中含有甲状腺激素T4，T3且与人中的甲状腺激素T4，T3是同一物质。因此可以借助用于检测人血清中甲状腺激素含量的系统来检测牡蛎中的甲状腺激素含量。本发明中采用了电化学发光法，用罗氏2010全自动生化分析仪(Roche公司，型号：Elecsys 2010)定量检测甲状腺激素的含量。

[0035] 实施例二

[0036] 牡蛎中甲状腺激素T4，T3的检测。

[0037] 样品的采集：在牡蛎育苗场采集牡蛎幼虫，体积1ml左右。直接用液氮冻存后转入-80℃冰箱保存，保存时间尽量不超过3个月。本发明采用的是保存2月的样品。

[0038] 样品信息如下表：

[0039] 表一、牡蛎发育幼虫取样信息表

[0040]

[0041] 样品预处理后检测：

[0042] 将含水幼虫样品Bla和U7在液氮中冷冻成固体后，用研钵研磨成粉末状；

[0043] 1)将研磨后的粉末状样品放在5ml EP管中，用冷冻干燥仪(北京博医康，型号：FD-1-50)-50℃避光条件下干燥10h至完全干燥，各样品分成AB两部分BlaA，BlaB，U7A，U7B分别用于以下步骤；

[0044] 2)用万分之一天平(OHAUS公司，型号：AR124CN)准确称量A部分样品(BlaA：0.1536g，U7A：0.2815g)，按每1g干重中加入5ml的0.01mol/L NaOH溶液V ml(V＝干重*5ml)，4℃下充分浸润1h提取甲状腺激素；

[0045] 3)10000rpm离心5min，取上清；

[0046] 4)取步骤4)中的上清，用罗氏2010全自动生化分析仪定量检测甲状腺激素的含量，即总T4和总T3；

[0047] 用罗氏2010全自动生化分析仪(Roche公司，型号：Elecsys 2010)定量检测甲状腺激素的含量，每个样品检测2次。为了消除本底值的影响，每次检测都设置一个空白对照，即0.01mol/L NaOH溶液，计算前先扣除本底值。根据说明书进行如下操作：

[0048] i.总甲状腺素(T4，thyroxine)的检测：

[0049] a)试剂(均来自Roche公司的甲状腺素T4试剂盒，货号：12017709)：

[0050] M：链霉亲和素包被的微粒(透明瓶盖)，1瓶，12ml。粒子浓度0.72mg/ml，生物素结合能力：470ng生物素/mg粒子。含防腐剂。

[0051] R1：钌标记的羊抗T4多克隆抗体(灰盖)，1瓶，18ml。浓度100ng/ml，ANS 1mg/ml，磷酸缓冲液0.1mol/l，pH7.4。含防腐剂。

[0052] R2：生物素化的T4(黑盖)，1瓶，18ml。浓度20ng/ml，磷酸缓冲液0.1mol/l，pH7.4。含防腐剂。

[0053] b)采用竞争法原理，整个过程18分钟完成。

[0054] 第1步：15μl样品、钌标记的羊抗T4多克隆抗体和ANS，后者使样品中的T4从结合蛋白质上释放出来.。

[0055] 第2步：加入链霉亲和素包被的微粒和生物素化的T4。后者占据标记抗体上仍然游离的结合位点，形成抗体-半抗原复合物。形成的免疫复合物通过生物素、链酶亲和素之间的反应结合到微粒上。

[0056] 第3步：反应混和液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。

[0057] 检测结果由机器自动从标准曲线上查出。此曲线由仪器通过2点定标校正，由从试剂条形码扫描入仪器的原版标准曲线而得。检测得Bla：70.462ng/ml，U7：3.691ng/ml。

[0058] 总三碘甲腺原氨酸(T3,triiodothyronine)的检测：

[0059] a)试剂(均来自Roche公司的三碘甲腺原氨酸T3试剂盒，货号：11731360)：

[0060] M：链霉亲和素包被的微粒(透明瓶盖)，1瓶，12ml。粒子浓度0.72mg/ml，生物素结合能力：470ng生物素/mg粒子。含防腐剂。

[0061] R1：钌标记的羊抗T3多克隆抗体(灰盖)，1瓶，16ml。浓度75ng/ml，ANS 0.08mg/ml，磷酸缓冲液0.1mol/l，pH7.4。含防腐剂。

[0062] R2：生物素化的T3(黑盖)，1瓶，16ml。生物素化的T3浓度3ng/ml，ANS 0.8mg/ml，磷酸缓冲液0.1mol/l，pH7.4。含防腐剂。

[0063] b)采用竞争法原理，整个过程18分钟完成。

[0064] 第1步：30μl样品、钌标记的羊抗T3多克隆抗体和ANS，后者释放结合的T3。

[0065] 第2步：加入链霉亲和素包被的微粒和生物素化的T3。后者占据标记抗体上仍然游离的结合位点，形成抗体-半抗原复合物。形成的免疫复合物通过生物素、链酶亲和素之间的反应结合到微粒上。

[0066] 第3步：反应混和液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。

[0067] 检测结果由机器自动从标准曲线上查出。此曲线由仪器通过2点定标校正，由从试剂条形码扫描入仪器的原版标准曲线而得。检测得Bla：4.059ng/ml，U7：0.176ng/ml。

[0068] 6)将B部分样品用万分之一天平(OHAUS公司，型号：AR124CN)准确称量幼虫粉末干重(Bla：0.0198g，U7：0.0206g)，在粉末中加入1ml高效RIPA组织/细胞裂解液(Solarbio公司，货号：R0010)和10ul PMSF(Solarbio公司，货号：R0010)室温放置1h，裂解细胞释放蛋白。

[0069] 7)用BCA蛋白测定试剂盒(近岸蛋白科技有限公司，货号：PA002，以下试剂均由该试剂盒提供)检测与发育时期样品相对应的样品中总蛋白含量。标准品和样品均设置2个重复。

[0070] 按说明书提供的步骤操作，简要如下：

[0071] a)取适量2mg/ml蛋白标准，用0.9％NaCl稀释至终浓度为1.0mg/ml。稀释后的1.0mg/ml蛋白标准可放入-20℃冰箱长期保存。

[0072] b)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内使用。

[0073] c)将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。

[0074] d)Bla和U7样品先分别稀释10，2倍，加20μl到96孔板的样品孔中。

[0075] e)各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30分钟。

[0076] f)用酶标仪(BioTek instruments,Inc公司，型号Eon，)测定A562。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。测得样品中蛋白含量分别为Bla：33.05％，U7：6.14％。

[0077] 8)将数据整合，计算出幼虫中每克蛋白含甲状腺激素x克(x g/g protein)。

[0078] V＝干重*5ml；C:甲状腺激素浓度(ng/ml)；R：回收率，见实施例三；

[0079] P：蛋白含量

[0080] T4＝CT4*V/干重/RT4/P＝5*CT4/RT4/P ng/(g protein)

[0081] BlaT4＝5*CT4/RT4/P＝5*70.462/57.65％/33.05％＝1849.07ng/(g protein)[0082] U7T4＝5*CT4/RT4/P＝5*3.691/57.65％/6.14％＝521.37ng/(g protein)[0083] T3＝CT3*V/干重/RT3/P＝5*CT3/RT3/P ng/(g protein)

[0084] BlaT3＝5*CT3/RT3/P＝5*4.059/27.22％/33.05％＝225.60ng/(g protein)[0085] U7T3＝5*CT3/RT3/P＝5*0.176/27.22％/6.14％＝52.65ng/(g protein)[0086] 实施例三

[0087] 甲状腺激素回收效率的评估

[0088] 采用浸泡加标方式，在液氮研磨后按每个样品加入T4和T3标准溶液，按实施例二中的方法进行预处理后检测T4和T3含量。

[0089] 标准品溶液的配置：用万分之一天平称取约0.0010g T4(Sigma公司，货号：T1775)和T3(Sigma公司，货号：T2877)，用提取液(0.01mol/L NaOH溶液)溶解后，将浓度分别调整为1000ng/ml和50ng/ml作为加标使用液。将上述加标使用液稀释10倍后，用罗氏2010全自动生化分析仪检测其浓度，得到T4加标使用液浓度为1201.36ng/ml，T3加标使用液浓度为36.42ng/ml。

[0090] 浸泡加标：将壳顶期样品U7研磨后冻干，均分成3份(C,D,E)，取100ul T4和100ul T3加标使用液加入到D,E样品中，浸泡后冻干。用万分之一天平称重(C：0.1613g，D：0.1960g，E：0.1845g)。按实施例二中的方法进行处理后检测C,D,E中甲状腺激素含量。
检测结果：

[0091] CCT4＝2.716ng/ml，CDT4＝71.332ng/ml，CET4＝72.622ng/ml，CCT3＝0ng/ml，CDT3＝0.964ng/ml，CET3＝1.019ng/ml。

[0092] C:甲状腺激素浓度(ng/ml)；

[0093] 并按下式进行回收率(R)计算：

[0094] RT4＝(CT4-CCT4)/120.136*100％

[0095] RT3＝(CT3-CCT3)/3.642*100％

[0096] 计算得T4，T3的回收率分别为57.65％±0.76％，27.22％±1.07％。

[0097] 对比例

[0098] 在研究鱼类发育过程中甲状腺素的作用时，采用的了一套较为复杂的样品预处理流程，即甲醇-氯仿提取法，参考文献【Tagawa,M.and T.Hirano(1987)."Presence of Thyroxine in Eggs and Changes in Its Content during Early Development of Chum Salmon,Oncorhynchus-Keta."General and Comparative Endocrinology 68(1):129-135.】。简述如下：

[0099] 鱼类幼鱼中甲状腺素T4的检测方法

[0100] 1)取0.2-1.0g卵或幼鱼(湿重)加2ml冰甲醇用匀浆的方式破碎。

[0101] 2)将匀浆后的样品转入离心管，用1ml的冰甲醇涮洗匀浆器2次后转移入同一离心管。

[0102] 3)2000rpm离心10min，取出上清。

[0103] 4)剩下的残渣用2ml冰甲醇再提取一次，离心将上清加入到前一次的上清中。

[0104] 5)在上述上清中加入14ml氯仿和4ml 0.05％CaCl2振荡10sec充分混匀。

[0105] 6)3000rpm离心10min，取出上层(水层)37℃真空过夜干燥。

[0106] 7)用1.0ml含有0.1％明胶的0.11M巴比妥缓冲液(pH＝8.6)复溶。

[0107] 8)用RIA的方法检测甲状腺素的含量。

[0108] 9)最后计算出每个卵或幼鱼中含有甲状腺素x克。

[0109] 该方法有操作步骤较多；氯仿有毒；每个卵或幼鱼中含有甲状腺素x克的计算方式不适用于贝类幼虫；放射免疫法(RIA)需要用到放射性物质，对人体有害的缺点。

[0110] 相比之下，本发明采用了更加简洁的样品预处理方法，结合可自动化操作的电化学发光法检测贝类中的甲状腺激素。整个过程无毒操作，样品预处理后即可送往当地医学检验单位用罗氏2010全自动生化分析仪检测，方便快捷。