趋化素衍生肽及其表达基因和应用

摘要

一种趋化素衍生肽，为具有如下结构式的多肽：Xaa1-Leu-Gln-Val-Ala-Leu-Glu-Glu-Phe-His；其中，Xaa1为20个L-氨基酸中的任意一个。上述趋化素衍生肽由于其化学本质为多肽，从而克服了传统的天然趋化素及其酶切产物具有的分子量相对较大、制备困难、存在抗原性、稳定性差等缺点，可以大批量生产和开展大动物及人体的实验研究及药物开发。本发明还公开了该趋化素衍生肽的表达基因及其在治疗癌症、肥胖症、脂肪肝、糖尿病、心血管疾病神经系统、生殖以及代谢综合症的应用。

权利要求

1.一种趋化素衍生肽，其特征在于，

所述趋化素衍生肽为如SEQ ID No.1所示的多肽；所述趋化素衍生肽可以与CCRL2受体结合。

说明书

趋化素衍生肽及其表达基因和应用

【技术领域】

[0001] 本发明涉及多肽药物领域，尤其涉及一种趋化素衍生肽及其表达基因和应用。【背景技术】

[0002] 蛋白质是机体内最重要的一类生物大分子，目前被广泛地作为药物用于疾病的治疗（李伟2004）。但是，蛋白质类药物也有缺点，如分子量大、制备困难、存在抗原性、体内易降解等。可喜的是，人们发现某些分子量较小的多肽同样具有类似蛋白质的活性，且功能更显著。这些具有生物活性的多肽在体内含量极少（甚至没有）但效应极强，许多疾病的发生、发展都与它们的失衡有关，药物开发前景非常好，因此，多肽药物的研究与开发已经成了国际上新兴的生物高科技领域，具有极大的市场潜力。

[0003] 至20世纪90年代末，科学家已发现的天然多肽类生理物质已有数万种之多，涉及到激素、神经、细胞生长、生殖、肿瘤病变、神经激素传递质及免疫调节等领域，2006年，全球蛋白质/多肽类药物总销售额已超过600亿美元大关，预计2008年将达到750亿~800亿美元，年增长率达20%以上。尽管多肽的发现已有百年之久，但它作为药物的开发史只有短短20年。在这20年里，世界各国开发上市的多肽类药物至少有100多种，如目前国际市场上畅销的亮丙瑞林、戈瑞林、布舍瑞林、促黄体激素拮抗剂、Fuzeon和利用生物工程手段生产的各种药物（如人生长激素、白间素、人胰岛素、干扰素和集落细胞生长因子等）。据有关方面报道，2006年，全球蛋白质/多肽类药物总销售额已超过600亿美元大关，预计2008年将达到750亿～800亿美元，年增长率达20%以上。多肽类药物业已成为国际市场上一个重要大类。

[0004] 与多数有机小分子药物相比，多肽类药物具有活性高、用药剂量小、毒副作用低、代谢终产物为氨基酸等突出特点；与蛋白质类相比，较小的肽几乎没有免疫原性；可化学合成，产品纯度高，质量可控。可惜的是，生物体内存在相当数量的多肽，目前发现的多肽只有1%或更少。因此，很有必要挖掘和研发新的具有生理活性的多肽，新的多肽可能代表着新的治疗手段。

[0005] 目前，市场上的多肽类药物主要来源于动物组织提取，化学合成和基因重组表达三种生产方式。据了解，由于原料成本降低、规模效益和分离技术的进步，化学多肽合成特别是固相多肽合成成本显著下降。

[0006] 据介绍，与化学合成相比，基因重组方式更适于长肽的制备；而且随着技术的进步，以基因重组方式生产多肽药物的成本也在不断降低。

[0007] 莫尼塔在研究报道中认为，来自动物组织提取的多肽药物将逐步被淘汰，化学合成和基因重组表达将在很长一段时间内成为互为补充的多肽药物生产方式。

[0008] 趋化素（Chemerin），也称作视黄酸受体反应蛋白2(retinoic acid receptor responder2,RARRES2),由他扎罗汀诱导基因2(tazarotene-induced gene2,TIG2)编码，是G蛋白偶联受体chemerin R，也被称为ChemR23或趋化因子受体1（chemokine-like receptor1，CMKLR1）的天然配体(Wittamer et al.2003,Zabel et al.2005)，因具有趋化抗原呈递细胞聚集的作用而得名，也是2007年新确认的脂肪因子(Bozaoglu et al.2007)。近期还发现GPCRs家族成员GPRl和肥大细胞上的CCRL2也是趋化素的受体，但是它们不直接支持趋化作用（chemotaxis）(Barnea et al.2008,Zabel et al.2008)。

[0009] 趋化素在人体的多种组织广泛表达，在脂肪组织、肾上腺、肝脏、肺、胰腺、胎盘、卵巢、皮肤等都有表达，其中主要表达于白色脂肪组织、肝脏和肺（综述：王晓娟和颜建英，2010）。趋化素功能广泛，如促进树突细胞、巨噬细胞和NK细胞到炎症位点的趋化作用、抑制促炎介质TNFα和IL-6的合成、增加脂联素的产生、促进脂肪细胞的分化与成熟、提高脂肪细胞对胰岛素的敏感性和葡萄糖的摄取、调节脂解作用、增加TNFβ的合成、提高NFκβ的活性，增加VEGF和MMPs的合成并调节新生血管生成和血管再生等等（Kukla et al.2011）。因此，趋化素在免疫应答、炎症反应、脂肪生成与脂质代谢（涉及肥胖、脂肪肝、糖尿病和代谢综合征）等方面发挥了重要作用，应用前景较好。

[0010] 趋化素在人、小鼠和大鼠等生物中保守性较强。如图1所示，人类TIG2基因表达翻译出来的蛋白质是趋化素前蛋白原，叫“Pre-prochemerin”，有163个氨基酸组成，在N末端有20个氨基酸的信号肽（表1,Du and Leung.2009,Ernst and Sinal.2010）。该信号肽被剪切后形成趋化素前体（prochemerin）。机体在正常状态下各个组织（除外周血白细胞）产生的趋化素以其前体形式proChemerin分泌到细胞外，proChemerin活性很低，在不同蛋白水解酶的作用下产生不同形式的趋化素，具有不同程度的免疫趋化作用（表1,Du and Leung.2009,Ernst and Sinal.2010）。从表1中可看出，到目前为止发现的天然趋化素（Chem21-157，Chem21-155和Chem21-154）及酶切形成的趋化素（Chem21-158、Chem21-156，Chem21-152）都是蛋白质，还没有小于50个氨基酸的多肽。在应用方面曾有他人发明了人重组chemerin蛋白、重组载体和转化体及其制备方法。

[0011] 然而，结合图1可以看出，体内发现的多种天然趋化素(chemerin)及其酶切产物，都是蛋白质，具有分子量相对较大、制备困难、存在抗原性、稳定性差等缺点，很难大批量生产和开展大动物及人体的实验研究及药物开发。

[0012] 表1.趋化素的不同形式及其具有的趋化活性

[0013]

[0014] 参考文献：

[0015] Barnea et al.The genetic design of signaling cascades to record receptor activation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2008.105:64–69.

[0016] Bozaoglu et al.Chemerin is a novel adipokine associated with obesity and metabolic syndrome［J］.Endocrinology,2007,148（10）:4687-4694.[0017] Cash et al.Synthetic chemerin-derived peptides suppress inflammation through ChemR23.J Exp Med.2008;205(4):767-75.

[0018] Du and Leung.Proteolytic regulatory mechanism of chemerin bioactivity.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai).2009;41(12):973-9.[0019] Ernst and Sinal.Chemerin:at the crossroads of inflammation and obesity.Trends Endocrinol Metab.2010;21(11):660-7.

[0020] Goralski et al.Chemerin:a novel adipokine that regulates adipogenesis and adipocyte metabolism［J］.J Biol Chem,2007,282(38):28175-28188.[0021] Kukla et al.Potential role of leptin,adiponectin and the novel adipokines-visfatin,chemerin and vaspin-in chronic hepatitis.Mol Med.2011.doi:10.2119/molmed.2010.00105.

[0022] Wittamer et al.Specific recruitment of antigen-presenting cells by chemerin,a novel processed ligand from human inflammatory fluids.J.Exp.Med.2003.198:977-985.

[0023] Wittamer et al.The C-terminal nonapeptide of mature chemerin activates the chemerin receptor with low nanomolar potency［J］.J Biol Chem,2004,279（11）:9956-9962.

[0024] Zabel et al.Chemoattractants,extracellular proteases,and the integrated host defense response.Exp.Hematol.2006.34:1021-1032.

[0025] Zabeletal.Chemokine-likereceptor 1 expression and chemerin-directed chemotaxis distinguish plasmacytoid from myeloid dendritic cells in human blood.J.Immunol.2005.174:244251.

[0026] Zabel et al.Mast cell-expressed orphan receptor CCRL2 binds chemerin and is requiredfor optimal induction of IgE-mediated passive cutaneous anaphylaxis.J.Exp.Med.2008.205:2207–2220.

[0027] 李伟上海医药200425（3）：119-121。

[0028] 王晓娟和颜建英脂肪细胞因子chemerin的研究进展国际妇产科学杂志（JInt Obstet Gynecol）201037（1）：43-46。【发明内容】

[0029] 基于此，有必要提供一种趋化素衍生肽及其表达基因和应用。

[0030] 一种趋化素衍生肽，为具有如下结构式的多肽：

[0031] Xaa1-Leu-Gln-Val-Ala-Leu-Glu-Glu-Phe-His；

[0032] 其中，Xaa1为20个L-氨基酸中的任意一个。

[0033] 优选的，为具有如下序列的多肽：

[0034] 如SEQ ID No.1所示的多肽，或

[0035] 如SEQ ID No.2所示的多肽。

[0036] 一种表达基因，其表达产物包括上述的趋化素衍生肽。

[0037] 上述的趋化素衍生肽在治疗癌症、肥胖症、脂肪肝、糖尿病、心血管疾病以及代谢综合症药物中的应用。

[0038] 上述趋化素衍生肽由于其化学本质为多肽，从而克服了传统的天然趋化素及其酶切产物具有的分子量相对较大、制备困难、存在抗原性、稳定性差等缺点，可以大批量生产和开展大动物及人体的实验研究及药物开发。【附图说明】

[0039] 图1为趋化素前前体在人类、小鼠和大鼠等生物中的序列；方框中分别标示的是信号肽、具有趋化作用的人Chem149-157和具有抗炎作用的小鼠Chem140-154的序列。

[0040] 图2为不同物种趋化素前前体（Pre-prochemerin）氨基酸的序列比对图。

[0041] 图3为趋化素衍生肽N10与CCRL2受体细胞的同位素结合实验；

[0042] 图4为凝血酶和纤溶酶联合处理鼠重组趋化素蛋白后的质谱分析结果图；

[0043] 图5为定量PCR法检测CCRL2mRNA在大脑皮质、尾壳核、小脑、脊髓、下丘脑和垂体中的表达结果图；

[0044] 图6为定量PCR法检测CCRL2mRNA在睾丸、附睾、输精管、储精囊、前列腺、心脏、肾脏和附睾的脂肪组织中的表达结果图；

[0045] 图7为定量PCR法检测CCRL2mRNA在癌症细胞中的表达结果图。【具体实施方式】

[0046] 近年来为了研究趋化素的活性肽段，人们人工合成了许多趋化素前体羧基末端区域来源的肽段，发现最短的趋化素生物活性肽段是人Chem149-157也被称为人的趋化素C9肽（chemerin9），这个9肽有强的趋化活性(Wittamer et al.2004)；在小鼠中，15个氨基酸组成的趋化素C15肽（Chem140-154），具有抗炎作用(Cash et al.2008)。这说明，来源于趋化素的多肽是有活性的。这一发现提示了我们：发掘体内存在、且有活性的天然趋化素多肽显然为趋化素的应用提供了成本低、工艺简单、稳定性更好的形式，为相关新药的研制提供了新的便捷有效途径。

[0047] 人Chem149-157和小鼠中的Chem140-154，虽然都与CMKLR1和/或GPR1结合，而且具有一定的生物活性，但是存在一定的问题：

[0048] （1）属于人工合成的多肽，酶切位点在不同物种间不具有保守性，提示这两个多肽不是内源性存在的形式；

[0049] （2）没有详细的资料显示这两种多肽与趋化素chemerin的三种受体（CMKLR1、CCRL2、GPR1）之间的关系。因为不同的受体，其生物学功能不尽相同，如果没有阐明与哪个受体结合，就很难确定这两种多肽是三个受体的配基，还是只是某个受体的配基，从而，很难确定两种多肽确切的生物学功能及药用价值。

[0050] 利用生物信息学工具，根据多肽/蛋白质激素具有的特点，并结合发明人多年在发现新的多肽/蛋白质激素方面的知识和经验的积累，从而发掘了体内存在的、内源性的、且具有生物学活性的、天然的、新的趋化素衍生肽，记为N10。这种多肽安全性更高、结合的受体及生物活性更确切、成本低、工艺简单、稳定性更好，是天然趋化素的替代品，既可以替代天然趋化素进行深入的机能、机理的研究，也可以替代天然趋化素进行深入的药物学研究；为已知的三个受体的新药靶点的寻找提供了新工具，为相关新药的研制提供了新途径。

[0051] 由图2可以看出，在不同物种中，不同物种趋化素前前体（Pre-prochemerin）氨基酸的序列很保守。其中，灰色背景部分分别为新发现的N10的序列。

[0052] 以人趋化素衍生肽N10为例进行简单说明，其序列如下所示：Gly29-Leu30-Gln31-Val32-Ala33-Leu34-Glu35-Glu36-Phe37-His38。

[0053] 对于人趋化素衍生肽N10，第29氨基酸的序列可以换成相近氨基酸序列，对趋化素衍生肽N10的生物学活性影响不会很大；但是Leu30-Gln31-Val32-Ala33-Leu34-Glu35-Glu36-Phe37-His38的序列很保守，不能更换，如果更换了氨基酸序列，很可能会影响其生物学活性。

[0054] 基于此，提供一种趋化素衍生肽N10，为具有如下结构式的多肽：

[0055] Xaa1-Leu-Gln-Val-Ala-Leu-Glu-Glu-Phe-His；

[0056] 其中，Xaa1为10个L-氨基酸中的任意一个。

[0057] 这种趋化素衍生肽N10在各个不同物种中的序列如下所示：

[0058] 人趋化素衍生肽N10（G29-H38）：GLQVALEEFH，为SEQ ID No.1所示的多肽；

[0059] 猩猩趋化素衍生肽N10（G29-H38）：GLQVALEEFH，为SEQ ID No.1所示的多肽；

[0060] 猴趋化素衍生肽N10（G29-H38）：GLQVALEEFH，为SEQ ID No.1所示的多肽；

[0061] 兔趋化素衍生肽N10（G29-H38）：GLQVALEEFH，为SEQ ID No.1所示的多肽；

[0062] 狗趋化素衍生肽N10（G29-H38）：GLQVALEEFH，为SEQ ID No.1所示的多肽；

[0063] 猪趋化素衍生肽N10（G29-H38）：GLQVALEEFH，为SEQ ID No.1所示的多肽；

[0064] 牛趋化素衍生肽N10（G29-H38）：GLQVALEEFH，为SEQ ID No.1所示的多肽；

[0065] 大鼠趋化素衍生肽N10（G31-H40）：GLQVALEEFH，为SEQ ID No.1所示的多肽；

[0066] 仓鼠趋化素衍生肽N10（G31-H40）：GLQVALEEFH，为SEQ ID No.1所示的多肽；

[0067] 小鼠趋化素衍生肽N10（S31-H40）：SLQVALEEFH，为SEQ ID No.2所示的多肽。

[0068] 趋化素衍生肽N10可以根据其序列，在体外合成制得。也可以采用合成其表达基因，在其他生物体内表达后纯化得到。

[0069] 同时还提供一种表达基因，其表达产物包括趋化素衍生肽N10。

[0070] 已有的研究显示，趋化素与三个受体CMKLR1、CCRL2及GPR1在炎症反应、趋化作用、癌症、肥胖症、脂肪肝、糖尿病、心血管疾病以及代谢综合症中均有作用。今后，越来越多的研究会挖掘出三个受体，CMKLR1、CCRL2及GPR1，更多、更确切的生物学功能。

[0071] 趋化素衍生肽N10与碘标的人趋化素，与转染了人CCRL2的受体细胞竞争性结合，得到图3。

[0072] 由图3可以看出，显示人趋化素衍生肽N10与CCRL2受体结合。

[0073] 从而可以看出，趋化素衍生肽N10是CCRL2受体的配基。因此，趋化素衍生肽N10或者作为CCRL2受体的激活剂（agonist），或者作为CCRL2受体的拮抗剂（antagonist），其生物学功能与CCRL2受体的功能相关。趋化素衍生肽N10将是深入研究CCRL2生物学功能的配体。

[0074] 使用凝血酶（Thrombin）和纤溶酶（Plasmin）联合处理鼠重组趋化素蛋白后，质谱分析结果如图4所示。由图4可以看出，经凝血酶（Thrombin）和纤溶酶（Plasmin）联合酶切得到分子量为1171的趋化素衍生肽N10。

[0075] 此外，还可以采用羧肽酶B（Carboxypeptidase B）和凝血酶（Thrombin）联合使用，对趋化素蛋白进行酶切也可以到趋化素衍生肽N10。

[0076] 上述结果说明，在人体或动物体内，具有以上蛋白酶的组织、器官中，均可以酶切出具有活性的、内源性的趋化素衍生肽N10。

[0077] 利用实时定量PCR法检测，检测结果如图5~图7所示。由图5可以看出，CCRL2mRNA在中枢神经系统中的大脑皮质、尾壳核、小脑、脊髓、下丘脑和垂体中均有表达，其中的垂体中表达最高。由图6可以看出，CCRL2mRNA在睾丸、附睾、输精管、储精囊、前列腺、心脏、肾脏和附睾的脂肪组织中也有表达。由图7可以看出，在一些癌症细胞，尤其是人乳腺癌细胞、人子宫内膜癌细胞、小鼠乳腺癌细胞和小鼠前列腺癌细胞中有高表达。

[0078] 上述结果说明，作为CCRL2的配体，趋化素衍生肽N10，可以作用于以上表达CCRL2mRNA的组织或器官而发挥重要的作用。在垂体中，有生长激素细胞和催乳激素细胞，可分别分泌生长激素（GH）和催乳激素（PRL)，促甲状腺激素细胞，促性腺激素细胞和促肾上腺激素细胞，促甲状腺激素细胞分泌促甲状腺激素(TSH)，促肾上腺激素细胞分泌促肾上腺激素(ACTH)，主要是糖皮质激素。促性腺激素细胞分泌黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）。垂体中还有分泌黑素细胞刺激素(MSH)的黑素细胞。作为CCRL2的配体，趋化素衍生肽N10将对垂体细胞分泌生长激素、催乳激素、促甲状腺激素、促肾上腺激素、黄体生成素和卵泡刺激素和黑素细胞刺激素的调节有影响。

[0079] 趋化素衍生肽N10可以用于制备治疗癌症、肥胖症、脂肪肝、糖尿病、心血管疾病以及代谢综合症药物，将是与CCRL2在炎症反应、趋化作用、癌症、肥胖症、脂肪肝、糖尿病、心血管疾病以及代谢综合症相关的新药候选。

[0080] 趋化素衍生肽N10由于其化学本质为多肽，从而克服了传统的天然趋化素及其酶切产物具有的分子量相对较大、制备困难、存在抗原性、稳定性差等缺点，可以大批量生产和开展大动物及人体的实验研究及药物开发。同时，趋化素衍生肽N10有明确的、特异性的受体、特异的生理活性，从而具有安全性更高、活性好、成本低、工艺简单、稳定性更好等优点。

[0081] 以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。