一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法

摘要

一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，它涉及一种基因突变的电化学检测方法。本发明是要解决现有方法在检测细胞株基因突变时仅能通过检测遗传学终点来确定结果，手段繁复、费用高、误差大，且会对试验人员健康造成伤害的问题。本发明的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法步骤如下：一：制备纳米复合工作电极；二：使用上述制备的纳米复合工作电极分别检测细胞裂解液、嘌呤碱基单体、嘌呤碱基混合液的电化学信号，分析并确定嘌呤碱基电化学信号所在的峰位；三：用致突变剂使细胞发生突变后，每12h进行电化学检测，以不同时间电化学信号变化为指标，建立HGPRT基因突变电化学试验方法。本发明用于电化学检测方法领域。

权利要求

1.一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于它是按以下步骤进行：步骤一：将经酸化处理的多壁碳纳米管与离子液体研磨混合20-30 min，直至形成2

均匀的电极修饰液，按0.01-0.07uL/mm 的滴涂量将电极修饰液均匀涂敷于玻碳电极表面，室温下干燥，即得纳米复合工作电极；其中，碳纳米管与离子液体的质量体积比为

1mg:(15μL-25μL)；

4 4 2

步骤二：按4.5×l0-5.5×l0 个/cm 的接种量将中国仓鼠肺V79细胞或中国仓鼠卵2

巢CHO细胞为模型细胞系接种于含0.2-0.25mL/cmDMEM细胞完全培养液的n个培养皿中，放于37℃、CO2体积百分含量为5％培养箱中培养48h-50h后，取出培养皿，弃去DMEM细胞2

完全培养液，用pH＝7.0-7.4的PBS缓冲溶液漂洗；然后每个培养皿中按21-24μL/cm 的加入量加入pH＝7.0-7.4的PBS缓冲溶液，在45-55℃水浴中原位裂解细胞25-35 min，获得细胞裂解液；

步骤三：用步骤一制备的纳米复合工作电极分别检测嘌呤碱基单体溶液、嘌呤碱基混合溶液和步骤二中得到的细胞裂解液的电化学信号，确定细胞裂解液的电化学信号中嘌呤碱基电化学信号所在的峰位；其中，纳米复合工作电极工作条件为温度25℃、pH＝7.2、扫描速度100 mv/s；所述的嘌呤碱基单体为鸟嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤或次黄嘌呤中的一种，嘌-6 -6呤碱基单体溶液浓度为5×10 -9×10 M，溶剂为pH＝7.0-7.4的PBS缓冲液；嘌呤碱基混合液由各嘌呤碱基单体和pH＝7.0-7.4的PBS缓冲液混合制成，各嘌呤碱基单体在混合液-6 -6中的终浓度均为5×10 -9×10 M；

4 4 2

步骤四：按4.5×l0-5.5×l0 个/cm 的接种量将中国仓鼠肺V79细胞或中国仓鼠卵2

巢CHO细胞为模型细胞系接种于含0.2-0.25mL/cmDMEM细胞完全培养液的n个培养皿中，放于37℃、CO2体积百分含量为5％培养箱中培养24-26h后，弃去DMEM细胞完全培养液，然后将n个培养皿随机均分成二组，一组加入含有质量百分含量为0.06％的致突变剂为ENU或EMS的无血清DMEM培养液对细胞进行培养1-3h，做为加药组；另一组用含有0.1％DMSO的无血清DMEM培养液对细胞进行培养1-3h，做为阴性对照组；其中，二组无血清DMEM培养2

液的加入量均为0.2-0.25mL/cm ；

步骤五：将步骤四的两组培养的细胞用缓冲液分别冲洗2-3次，然后加入DMEM完全培养液培养，放于37℃、CO2体积百分含量为5％的培养箱中培养7-9天，每12 h或24h进行电化学检测，然后以电化学检测时间为横坐标，以在步骤三中嘌呤碱基电化学信号所确认的峰位对应的电压下所测得的基因突变前和突变过程中细胞嘌呤核苷酸代谢电流信号为纵坐标，建立HGPRT基因突变电化学信号变化规律图，即完成一种核糖转移基酶基因 突变2

的电化学检测方法；其中，DMEM细胞完全培养液加入量为0.2-0.25mL/cm。

2.根据权利要求1所述的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于步骤一中所述的碳纳米管与离子液体的质量体积比为1mg:20μL。

3.根据权利要求1所述的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于2

步骤二中所述的原位裂解细胞加入的PBS缓冲液的加入量为24μL/cm，pH＝7.4，裂解温度为50℃，时间为30min。

4.根据权利要求1所述的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于-6步骤三中所述的嘌呤碱基单体浓度均为8×10 M，各嘌呤碱基单体在混合液中的终浓度均-6为8×10 M。

5.根据权利要求1所述的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于步骤四中所述的模型细胞在DMEM细胞完全培养液中培养时间为24h，加药组和阴性对照组培养时间均为3h。

6.根据权利要求1所述的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于步骤五中所述的培养时间为8天，每隔24h进行电化学检测。

7.根据权利要求1所述的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于步骤五中所述的缓冲液为D-Hanks液或PBS缓冲溶液。

8.根据权利要求1所述的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于

4 2

步骤二、步骤四和步骤五中所述的接种量均为5×l0 个/cm，步骤四中所述的二组无血清2

DMEM培养液的加入量均为0.23mL/cm，步骤二和步骤五中所述的DMEM完全培养液加入量2

均为0.23mL/cm。

说明书

一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种哺乳类动物细胞株基因突变的电化学检测方法，尤其涉及对核糖转移基酶基因位点的基因突变电化学检测。

背景技术

[0002] 哺乳动物细胞致突变试验是国际评价致突因素的重要传统方法，它以哺乳动物细胞为材料，通过检测细胞中特定基因的突变确定受试物的致突性。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移基酶（HGPRT）基因是理想的突变生物标志物，它作为内源性结构基因，编码产生嘌呤代谢补救途径的关键酶，因其具有对各种致突因素敏感、自发突变率低等优点，已成为基因突变研究中的重要靶基因。在哺乳动物细胞HGPRT基因突变试验中，HGPRT基因突变会引发嘌呤代谢补救途径中的关键酶—HGPRT活性下降甚至消失，引起相关通路中核苷酸代谢异常，进而导致嘌呤碱基及尿酸含量关系发生特征性变化。因而，如果能够实时跟踪检测这种变化，必然可以及时反映HGPRT基因位点突变情况。

[0003] 目前，对传统的哺乳动物细胞株基因突变的检测方法仅能通过检测遗传学终点来确定基因突变结果，周期较长，一般需要15天以上，易造成假阴性结果，而且手段繁复，费用高、误差大。另外，试验中需要荧光和放射性标记，会对试验人员健康造成伤害。

发明内容

[0004] 本发明的目的是为了解决现有方法在检测传统的哺乳动物细胞株基因突变时仅能通过检测遗传学终点来确定基因突变结果，周期长，手段繁复，费用高、误差大，易出现由于表达不完全而造成的假阴性结果，而且试验中需要荧光和放射性标记，会对试验人员健康造成伤害的问题，而提供的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法。

[0005] 本发明的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，它是按以下步骤进行：

[0006] 步骤一：将经酸化处理的多壁碳纳米管与离子液体研磨混合20-30min，直至形2
成均匀的电极修饰液，按0.01-0.07uL/mm 的滴涂量将电极修饰液均匀涂敷于玻碳电极表面，室温下干燥，即得纳米复合工作电极；其中，碳纳米管与离子液体的质量体积比为1mg:
（15μL-25μL）；

[0007] 步骤二：按4.5×l04-5.5×l04个/cm2的接种量将模型细胞接种于含0.2-0.25mL/2
cmDMEM细胞完全培养液的n个培养皿中，放于37℃、CO2体积百分含量为5%培养箱中培养
48h-50h后，取出培养皿，弃去DMEM细胞完全培养液，用pH=7.0-7.4的PBS缓冲溶液漂洗；
2
然后每个培养皿中按21-24μL/cm 的加入量加入pH=7.0-7.4的PBS缓冲溶液，在45-55℃水浴中原位裂解细胞25-35min，获得细胞裂解液；

[0008] 步骤三：用步骤一制备的纳米复合工作电极分别检测嘌呤碱基单体溶液、嘌呤碱基混合溶液和步骤二中得到的细胞裂解液的电化学信号，确定细胞裂解液的电化学信号中嘌呤碱基电化学信号所在的峰位；其中，纳米复合工作电极工作条件为温度25℃、pH=7.2、扫描速度100mv/s；所述的嘌呤碱基单体为鸟嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤或次黄嘌呤中的一种，-6 -6嘌呤碱基单体溶液浓度为5×10 -9×10 M，溶剂为pH=7.0-7.4的PBS缓冲液；嘌呤碱基混合液由各嘌呤碱基单体和pH=7.0-7.4的PBS缓冲液混合制成，各嘌呤碱基单体在混合液中-6 -6
的终浓度均为5×10 -9×10 M；

[0009] 步骤四：按4.5×l04-5.5×l04个/cm2的接种量将模型细胞接种于含0.2-0.25mL/2
cmDMEM细胞完全培养液的n个培养皿中，放于37℃、CO2体积百分含量为5%培养箱中培培养24-26h后，弃去DMEM细胞完全培养液，然后将n个培养皿随机均分成二组，一组加入含有质量百分含量为0.03-0.13%的致突变剂的无血清DMEM培养液对细胞进行培养1-3h，做为加药组；另一组用含有0.1%-0.5%DMSO的无血清DMEM培养液对细胞进行培养1-3h，做为
2
阴性对照组；其中，二组无血清DMEM培养液的加入量均为0.2-0.25mL/cm ；

[0010] 步骤五：将步骤四的两组培养的细胞用缓冲液分别冲洗2-3次，然后加入DMEM完全培养液培养，放于37℃、CO2体积百分含量为5%的培养箱中培养7-9天，每12h或24h进行电化学检测，然后以电化学检测时间为横坐标，以在步骤三中嘌呤碱基电化学信号所确认的峰位对应的电压下所测得的基因突变前和突变过程中细胞嘌呤核苷酸代谢电流信号为纵坐标，建立HGPRT基因突变电化学信号变化规律图，即完成一种核糖转移基酶基因突2
变的电化学检测方法；其中，DMEM细胞完全培养液加入量为0.2-0.25mL/cm。

[0011] 本发明包含以下有益效果：

[0012] 本发明建立的HGPRT基因突变电化学试验方法，以细胞内嘌呤含量为检测指标，在基因突变表达期7天内，便可观察到明显的两个电化学信号的变化，其中信号一（0.7V左右），在第四天对照组和加药组开始有明显变化，而信号二（1.0V左右）在表达期第三天开始即有明显变化，说明采用电化学方法检测基因突变在表达期7天内即可完成基因突变检测。

[0013] 本发明的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法利用电化学灵敏、快速、客观的特点，突破了传统生物学方法仅能检测基因突变遗传学终点的限制，通过采用电化学手段检测细胞中嘌呤含量变化来指示基因突变的情况，首次建立了无标记、快速、原位、实时检测基因突变的试验新方法，手段简单，费用低、误差小，而且不需要荧光和放射性标记，不会对试验人员健康造成伤害。

附图说明

[0014] 图1为实施例一中四种标准品与v79细胞循环伏安结果图；其中，a为鸟嘌呤，b为黄嘌呤，c为腺嘌呤，d为次黄嘌呤，e为四种嘌呤混合物，f为V79细胞；1为信号一，2为信号二；

[0015] 图2为实施例一中V79细胞加药组峰值与对照组峰信号一电流强度变化趋势；其中，1为加药组，2为对照组；

[0016] 图3为实施例一中V79细胞加药组峰值与对照组峰信号二电流强度变化趋势；其中，1为加药组，2为对照组。

具体实施方式

[0017] 具体实施方式一：本实施方式的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于它是按以下步骤进行：

[0018] 步骤一：将经酸化处理的多壁碳纳米管与离子液体研磨混合20-30min，直至形2
成均匀的电极修饰液，按0.01-0.07uL/mm 的滴涂量将电极修饰液均匀涂敷于玻碳电极表面，室温下干燥，即得纳米复合工作电极；其中，碳纳米管与离子液体的质量体积比为1mg:
（15μL-25μL）；

[0019] 步骤二：按4.5×l04-5.5×l04个/cm2的接种量将模型细胞接种于含0.2-0.25mL/2
cmDMEM细胞完全培养液的n个培养皿中，放于37℃、CO2体积百分含量为5%培养箱中培养
48h-50h后，取出培养皿，弃去DMEM细胞完全培养液，用pH=7.0-7.4的PBS缓冲溶液漂洗；
2
然后每个培养皿中按21-24μL/cm 的加入量加入pH=7.0-7.4的PBS缓冲溶液，在45-55℃水浴中原位裂解细胞25-35min，获得细胞裂解液；

[0020] 其中，接种量是根据培养皿总面积内所接种细胞总数量计算得到，DMEM细胞完全培养液含量是根据培养皿总面积内所加入DMEM细胞完全培养液的总量计算得到，加入PBS缓冲溶液的量是根据培养皿总面积内所加入PBS缓冲溶液的总量计算得到。

[0021] 步骤三：用步骤一制备的纳米复合工作电极分别检测嘌呤碱基单体溶液、嘌呤碱基混合溶液和步骤二中得到的细胞裂解液的电化学信号，分析对比获得的电化学检测数据，确定细胞裂解液的电化学信号中嘌呤碱基电化学信号所在的峰位；其中，检测前将所得纳米复合工作电极置于pH=7.0～7.4的PBS溶液中，在0.0～1.1V范围内循环伏安法扫描至背景稳定；纳米复合工作电极工作条件为温度25℃、pH=7.2、扫描速度100mv/s；所述的嘌呤碱基单体为鸟嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤或次黄嘌呤中的一种，嘌呤碱基单体溶液-6 -6
浓度为5×10 -9×10 M，溶剂为pH=7.0-7.4的PBS缓冲液；嘌呤碱基混合液由各嘌呤碱基单体和pH=7.0-7.4的PBS缓冲液混合制成，各嘌呤碱基单体在混合液中的终浓度均为-6 -6
5×10 -9×10 M；

[0022] 其中，各嘌呤碱基单体均购自百灵威科技有限公司。

[0023] 步骤四：按4.5×l04-5.5×l04个/cm2的接种量将模型细胞接种于含0.2-0.25mL/2
cmDMEM细胞完全培养液的n个培养皿中，放于37℃、CO2体积百分含量为5%培养箱中培养
24-26h后，弃去DMEM细胞完全培养液，然后将n个培养皿随机均分成二组，一组加入含有质量百分含量为0.03-0.13%的致突变剂的无血清DMEM培养液对细胞进行培养1-3h，做为加药组；另一组用4-6mL含有0.1%-0.5%DMSO的无血清DMEM培养液对细胞进行培养1-3h，做
2
为阴性对照组；其中，二组无血清DMEM培养液的加入量均为0.2-0.25mL/cm ；

[0024] 步骤五：将步骤四的两组培养的细胞用缓冲液分别冲洗2-3次，然后加入DMEM完全培养液培养，放于37℃、CO2体积百分含量为5%的培养箱中培养7-9天，每12h或24h进行电化学检测，然后以电化学检测时间为横坐标，以在步骤三中嘌呤碱基电化学信号所确认的峰位对应的电压下所测得的基因突变前和突变过程中细胞嘌呤核苷酸代谢电流信号为纵坐标，建立HGPRT基因突变电化学信号变化规律图，即完成一种核糖转移基酶基因突2
变的电化学检测方法；其中，DMEM细胞完全培养液加入量为0.2-0.25mL/cm。

[0025] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的研磨混合时间为30min。其它与具体实施方式一相同。

[0026] 具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中所述的2
电极修饰液滴涂量为0.02uL/mm。其它与具体实施方式一或二相同。

[0027] 具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中所述的检碳纳米管与离子液体的质量体积比为1mg:20μl。其它与具体实施方式一至三之一相同。

[0028] 具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中所述的放于CO2培养箱中培养时间为48h。其它与具体实施方式一至四之一相同。

[0029] 具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中所2
述的原位裂解细胞加入的PBS缓冲溶液的加入量为24μL/cm，pH=7.4，裂解温度为50℃，时间为30min。其它与具体实施方式一至五之一相同。

[0030] 具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三中所-6 -6述的嘌呤碱基单体浓度均为8×10 M，各嘌呤碱基单体在混合液中的终浓度均为8×10 M。
其它与具体实施方式一至六之一相同。

[0031] 具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤二和步骤四中所述的模型细胞为中国仓鼠肺V79细胞或中国仓鼠卵巢CHO细胞为模型细胞系。其它与具体实施方式一至七之一相同。

[0032] 其中，中国仓鼠肺V79细胞或中国仓鼠卵巢CHO细胞购买自中科院上海细胞库。

[0033] 具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤四中所述的模型细胞在DMEM细胞完全培养液中培养时间为24h，加药组和阴性对照组培养时间均为3h。其它与具体实施方式一至八之一相同。

[0034] 具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤四中所述的致突变剂为ENU或EMS，百分含量为0.06%，DMSO百分含量为0.1%。其它与具体实施方式一至九之一相同。

[0035] 具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤五中所述的培养时间为8天，每隔24h进行电化学检测。其它与具体实施方式一至十之一相同。

[0036] 具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是：步骤五中所述的缓冲液为D-Hanks液或PBS缓冲溶液。其它与具体实施方式一至十一之一相同。

[0037] 具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是：步骤五中所述的缓冲液冲洗次数为2次。其它与具体实施方式一至十二之一相同。

[0038] 具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一至十三之一不同的是：步骤4 2
二、步骤四和步骤五中所述的接种量均为5×l0 个/cm，步骤四中所述的二组无血清DMEM
2
培养液的加入量均为0.23mL/cm，步骤二和步骤五中所述的DMEM完全培养液加入量均为
2
0.23mL/cm。其它与具体实施方式一至十三之一相同。

[0039] 实施例1

[0040] 本实施例的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，按以下步骤进行：

[0041] 步骤一：将5mg碳纳米管与100μl离子液体混合，对其研磨20min直至形成均匀的电极修饰液，将0.07μl电极修饰液均匀涂敷于直径为3mm的玻碳电极表面，室温下干燥，即得纳米复合工作电极；

[0042] 步骤二：按5×l04个/cm2的接种量将v79模型细胞接种于含5mL DMEM细胞完全培养液的规格为60mm细胞培养皿中，放于37℃、5%CO2培养箱中培养48h后，取出培养皿，弃去DMEM细胞完全培养液，用pH=7.4的PBS缓冲溶液漂洗；然后每皿加入500μl pH=7.4的PBS缓冲溶液，在50℃水浴中原位裂解细胞30min，获得细胞裂解液；

[0043] 其中，中国仓鼠肺V79模型细胞购买自中科院上海细胞库。

[0044] 步骤三：使步骤一制备的纳米复合工作电极分别检测细胞裂解液、嘌呤碱基单体、嘌呤碱基混合液的电化学信号，分析对比获得的电化学检测数据，确定细胞裂解液的电化学信号中嘌呤碱基电化学信号所在的峰位；其中，检测前将所得纳米复合工作电极置于pH=7.4的PBS溶液中，在0.0～1.1V范围内循环伏安法扫描至背景稳定；纳米复合工作电极工作条件为温度25℃、pH=7.2、扫描速度100mv/s；所述的嘌呤碱基单体为鸟嘌呤、为黄-6嘌呤、为腺嘌呤或次黄嘌呤中的一种，嘌呤碱基单体溶液浓度为8×10 M，溶剂为pH=7.4的PBS缓冲液；嘌呤碱基混合液由各嘌呤碱基单体和pH=7.4的PBS缓冲液混合制成，各嘌呤-6
碱基单体在混合液中的终浓度均为8×10 M。

[0045] 其中，各嘌呤碱基单体均购自百灵威科技有限公司。

[0046] 步骤四：按5×l04个/cm2的接种量将v79模型细胞接种于6个含5mL DMEM细胞完全培养液的规格为60mm细胞培养皿中，培养24h后，随机均分成二组，一组用5ml含0.043%致突变剂的无血清DMEM培养液对细胞进行培养3h，做为加药组；另一组用5ml含有
0.1%DMSO的无血清DMEM培养液对细胞进行培养3h，做为阴性对照组。

[0047] 步骤五：将步骤四的两组培养的细胞分别用pH=7.4的PBS缓冲液冲洗2次，然后每皿加入5mL DMEM完全培养液培养，放于37℃、5%CO2培养箱中培养8天，每24h进行电化学检测，根据步骤三中嘌呤碱基电化学信号所确认的峰位以及基因突变前和突变过程中细胞嘌呤核苷酸代谢电化学信号变化规律，以时间为横坐标，电流信号为纵坐标，建立HGPRT基因突变电化学信号变化规律图，即完成一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法。

[0048] 与常规哺乳动物突变试验结果进行比较，验证EMS致基因突变的电化学检测方法的可靠性，常规哺乳动物HGPRT位点基因突变试验按照国标法（GB15193.12-200，体外哺乳类细胞(V79/HGPRT)基因突变试验）进行。结果如下表所示：

[0049] 表1EMS对V79细胞HGPRT基因位点突变频率的影响

[0050]

[0051] 由表1可知，经过15天的常规哺乳动物HGPRT位点基因突变试验，溶剂对照DMSO-6 -6组的突变率为2.63x10 ；空白对照DMEM组的突变率为3.84x10 ；两者突变率无显著性差-4
异，说明0.1％的DMSO溶剂对试验的影响可忽略不计。致突物EMS的突变率为8.31x10 ，为相应溶剂对照组突变率的315倍以上，差异显著，故可判为阳性。说明EMS在此剂量下起到了很好的诱变性。

[0052] 本发明建立的HGPRT基因突变电化学试验方法，以细胞内嘌呤含量为检测指标，在基因突变表达期7天内，便可观察到明显的两个电化学信号的变化，其中信号一（0.7V左右），在第四天对照组和加药组开始有明显变化，而信号二（1.0V左右）在表达期第三天开始即有明显变化，说明采用电化学方法检测基因突变在表达期7天内即可完成基因突变检测。

[0053] 本发明的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法利用电化学灵敏、快速、客观的特点，突破了传统生物学方法仅能检测基因突变遗传学终点的限制，通过采用电化学手段检测细胞中嘌呤含量变化来指示基因突变的情况，首次建立了无标记、快速、原位、实时检测基因突变的试验新方法，手段简单，费用低、误差小，而且不需要荧光和放射性标记，不会对试验人员健康造成伤害。