检测PGRMC1的试剂在制备肾癌诊断试剂、试剂盒中的用途

摘要

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种肾癌诊断试剂、试剂盒及防治药物。本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种肾癌诊断试剂。该诊断试剂含有可检测孕酮受体膜组分1蛋白表达水平和/或磷酸化水平的试剂。本发明肾癌诊断试剂可以在早期有效诊断肾癌疾病，大大提高了患者的生存率；本发明肾癌诊断试剂只需要少量肾癌组织即可进行有效诊断，避免了给患者造成的伤害；有利于医生选择适合的药物及方法对患者进行针对性治疗。

权利要求

1.检测孕酮受体膜组分1蛋白表达水平和/或磷酸化水平的试剂在制备肾癌诊断试剂中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的检测孕酮受体膜组分1蛋白表达水平和/或磷酸化水平的试剂包括孕酮受体膜组分1的多克隆抗体或单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的检测孕酮受体膜组分1蛋白表达水平和/或磷酸化水平的试剂包括能特异扩增孕酮受体膜组分1基因mRNA的PCR引物。

说明书

检测PGRMC1的试剂在制备肾癌诊断试剂、试剂盒中的用途

技术领域

[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种肾癌诊断试剂、试剂盒及防治药物。

背景技术

[0002] 肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，占所有恶性肿瘤的2-3%，约占肾脏肿瘤的90%，其发病率占泌尿系肿瘤的第二位。肾癌起源于肾小管上皮细胞，大约75%为肾透明细胞癌。近几十年来肾癌的发病率和死亡率均有增高的趋势，发病率以每年2%的速度增长。
由于缺乏有效的早期诊断标志物，阻碍了对肾癌的及时诊断，50%肾癌患者在确诊时已为晚期，约四分之一的肾癌患者在发现时已发生转移，预后较差。

[0003] 目前肾癌的治疗仍以根治性手术为主，但因肾癌具有放化疗抵抗性，术后约有20-40%的患者出现复发。因此，肾癌的早期筛查与早期诊断对于肾癌的防治非常重要，并且发展有效监控肾癌的复发转移试剂、试剂盒以及研发新的肾癌靶向治疗药物是急需解决的重要课题和国民健康的重大需求。

[0004] PGRMC1,即孕酮受体膜组分1(PGRMC1)是一个28kD,由195个氨基酸组成的蛋白（SEQ ID No.1:MAAEDVVATG ADPSDLESGG LLHEIFTSPL NLLLLGLCIF LLYKIVRGDQ PAASGDSDDD EPPPLPRLKR RDFTPAELRR FDGVQDPRIL MAINGKVFDV TKGRKFYGPE GPYGVFAGRD ASRGLATFCL DKEALKDEYD DLSDLTAAQQ ETLSDWESQF TFKYHHVGKL LKEGEEPTVY SDEEEPKDES ARKND，http://www.uniprot.org/uniprot/O00264），属于膜相关孕酮受体蛋白家族，近来研究显示PGRMC1蛋白在癌症中发挥重要作用【1,2】。PGRMC1蛋白通常在乳腺，结肠和甲状腺肿瘤组织及结肠，甲状腺，卵巢，肺和宫颈癌起源的细胞中过表达【3,4】。微阵列分析已经检测到PGRMC1蛋白在结肠、肺、卵巢和乳腺肿瘤中的表达【5-7】。蛋白质组学的分析表明乳腺癌中PGRMC1蛋白增加，PGRMC1蛋白是雌激素受体的新的分子标志物【8,9】。此外，PGRMC1蛋白还调节癌细胞对化疗的敏感性【10】。到目前为止，未见PGRMC1和肾癌关系的报道。未见通过检测PGRMC1表达水平及磷酸化水平来实现肾癌的诊断试剂及试剂盒的相关报道，也未见通过降低其表达水平或抑制其磷酸化水平来达到治疗肾癌的目的的报道。

[0005] 本领域目前需要提供新的肾癌的诊断尤其是早期诊断、药物疗效监测的检测产品以及防治药物。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种肾癌诊断试剂。该诊断试剂含有可检测孕酮受体膜组分1蛋白表达水平和/或磷酸化水平的试剂。

[0007] 其中，上述的检测孕酮受体膜组分1蛋白表达水平和/或磷酸化水平的试剂包括孕酮受体膜组分1的多克隆抗体或单克隆抗体。

[0008] 其中，上述的检测孕酮受体膜组分1蛋白表达水平和/或磷酸化水平的试剂包括能特异扩增孕酮受体膜组分1基因mRNA的PCR引物。

[0009] 本发明解决的第二个问题是提供了一种肾癌检测试剂盒或生物芯片。该肾癌检测试剂盒或生物芯片含有上述的肾癌诊断试剂。

[0010] 同时也提供了上述检测孕酮受体膜组分1蛋白表达水平和/或磷酸化水平的试剂在制备肾癌诊断试剂中的用途。进一步也提供了上述检测孕酮受体膜组分1蛋白表达水平和/或磷酸化水平的试剂在制备肾癌检测试剂盒或生物芯片

[0011] 本发明解决的第三个问题是提供了一种治疗肾癌的药物。该治疗肾癌的药物为能减少改变孕酮受体膜组分1的蛋白表达水平和/或磷酸化水平或其编码基因转录的mRNA含量的药物。

[0012] 其中，上述的药物为孕酮受体膜组分1的shRNA分子或能表达可检测孕酮受体膜组分1的shRNA分子的表达载体。

[0013] 其中，上述的药物为孕酮受体膜组分1的拮抗剂或多克隆抗体或单克隆抗体。

[0014] 本发明还提供了筛选上述的药物的方法。该方法包括以下步骤：

[0015] a、建立肾癌的细胞模型或动物模型的模型组，并设立正常对照组；

[0016] b、用待筛选药物按剂量梯度作用于模型组，然后检测其中可检测孕酮受体膜组分1蛋白的蛋白表达水平或其基因的mRNA含量；

[0017] c、将检测结果与正常对照组进行比较，能使模型组中可检测孕酮受体膜组分1蛋白的蛋白表达水平或其基因的mRNA含量显著趋近正常对照组的待筛选药物即被筛中。

[0018] 本发明创新之处及有益效果在于：本发明肾癌诊断试剂可以在早期有效诊断肾癌疾病，大大提高了患者的生存率；本发明肾癌诊断试剂只需要少量肾癌组织即可进行有效诊断，避免了给患者造成的伤害；有利于医生选择适合的药物及方法对患者进行针对性治疗。本发明防治肾癌疾病的药物，为临床肾癌疾病用药提供了一种新的选择。本发明筛选防治肾癌疾病的药物的方法，为寻找防治肾癌疾病的药物提供了一种新的途径，具有广阔的应用前景。

附图说明

[0019] 图1质谱鉴定结果。通过基于Leu-d3的定量蛋白质组鉴定，肾癌组织中PGRMC1的表达比癌旁正常肾组织上调3.91倍。其中：图1A为癌旁正常肾组织和HEK293细胞混合样品中PGRMC1的一段肽段指纹图谱，包括一对序列为“GDQPAASGDSDDDEPPPLPR,SEQ ID No.2” 的代表性同位素标记肽段(m/z1019.99/1018.49,2+)，用其来定量癌旁正常肾组织和HEK293细胞中PGRMC1的相对表达量。图1B为肾癌组织和HEK293细胞混合样品中PGRMC1的一段肽段指纹图谱。用一对序列为“GDQPAASGDSDDDEPPPLPR,”的代表性同位素标记肽段(m/z1019.99/1018.49,2+)来定量癌旁正常肾组织和HEK293细胞中PGRMC1的相对表达量。图1C为肽段GDQPAASGDSDDDEPPPLPR（m/z1018.49）的串级质谱图。

[0020] 图2PGRMC1在肾癌组织与癌旁正常肾组织的表达。结果表明肾癌组织中PGRMC1的表达比癌旁正常肾组织高得多。

[0021] 图3PGRMC1在肾癌组织（A-E）与癌旁正常肾组织（F-J）中的表达，肾癌组织中PGRMC1的表达高于癌旁正常肾组织。(A)-(D)分别代表肾癌组织中PGRMC1阴性表达、弱阳性表达、中度阳性表达和强阳性表达的染色程度。(F)-(I)分别代表癌旁正常肾组织中PGRMC1阴性表达、弱阳性表达、中度阳性表达和强阳性表达的染色程度。(E)和(J)分别代表了肾癌组织和癌旁肾正常组织中检测到的PGRMC1的磷酸化水平。图中横线代表100μm（原始放大400倍）。

[0022] 图4通过Western blot在三对肾癌组织和癌旁正常肾组织中鉴定到PGRMC1蛋白的磷酸化位点Thr74。肾癌组织中PGRMC1的磷酸化水平高于癌旁正常肾组织。

[0023] 图5不同浓度索拉菲尼处理肾癌OS-RC-2细胞24h后PGRMC1蛋白的Thr74位磷酸化水平变化。

具体实施方式

[0024] 本发明的建立是基于对肾癌发生发展相关蛋白的研究，通过对45例病人的研究，分析鉴定出肾癌相关蛋白孕酮受体膜组分1。

[0025] 本发明还进一步应用免疫组织化学技术研究孕酮受体膜组分1蛋白在肾癌组织中的表达，功能研究提示与肾癌密切相关的孕酮受体膜组分1蛋白能应用于临床诊断、预后判断及药物开发中。

[0026] 在上述大量的开创性研究的基础上，本领域技术人员就容易可将上述孕酮受体膜组分1蛋白或其基因的mRNA作为检测目标的肾癌诊断试剂及试剂盒；同时可以上述孕酮受体膜组分1蛋白或其基因的mRNA作为靶标的筛选治疗肾癌药物的方法；还发明了能防治肾癌的药物，比如：能拮抗孕酮受体膜组分1蛋白的分子，比如其单克隆抗体或者多克隆抗体，如PGRMC1多克隆抗体（ab48012）；以及得到防治效果好的shRNA分子和能表达孕酮受体膜组分1的shRNA分子的质粒。

[0027] 实施例一、使用本发明检测肾癌

[0028] 1.细胞和组织样本来源

[0029] 人胚肾细胞系HEK293(HEK293)：源自ATCC，本实验室保存；人肾癌细胞株OS-RC-2，源自ATCC，购于中国科学院细胞库；

[0030] 45例肾癌组织及45例肾癌旁正常肾组织，均由四川大学华西医院泌尿外科提供，样本提供者手术后签署知情同意书，每例组织均通过病理活检。

[0031] 2.试剂来源

[0032] 细胞培养液DMEM：购自Gibco BRL；Leu-d3：购自英国剑桥同位素实验室；透析血清购自Gibco；含Leu-d3标记的DMEM：自配；胎牛血清（FBS）、消化液胰酶（Trypsin）购自Gibco BRL。

[0033] 质谱级胰蛋白酶Trypsin Gold：购自Promega；乙腈（ACN）、三氟乙酸（TFA）：均为色谱纯级，购自Fisher Scientific；NH4HCO3：色谱纯，购自Merck；α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）：购自Sigma；蛋白酶抑制剂-Cocktail:购自Sigma。

[0034] PGRMC1多克隆抗体（ab48012）：购自Abcam；Phospho-Threonine-Proline抗体（#9391）：购自Cell signalingtechnology；小鼠抗人β-actin抗体：购自博士德生物科技公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG、兔抗羊IgG、羊抗兔IgG均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

[0035] 即用型免疫组化超敏S-P（鼠/兔）试剂盒（KIT-9710）购自北京莱博生物实验材料研究所。DAB显色试剂盒（AR1022）购自武汉博士德生物工程有限公司。

[0036] 3.方法

[0037] 3.1细胞的稳定同位素（Leu-d3）标记

[0038] HEK293细胞在含Leu-d3和10%透析胎牛血清(D-FBS)的DMEM培养液中培养，每隔3天换一次培养液，待细胞长到90%左右传代。每代细胞留1/3继续培养，收集其余细胞并用冰冷的PBS洗3次放-80℃备用。培养6-8代后，提取各代细胞总蛋白，经SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色，脱色后切取每代细胞蛋白的β-actin条带。酶解、提肽后，MALDI-TOF MS检测每代同位素整合情况，直至完全标记为止。待细胞完全标记后保种。

[0039] 3.2蛋白样品的制备、分离及酶解

[0040] 将收集好的细胞或研成粉末状的肾组织样品，一般一瓶(面积80cm培养瓶)细胞用500μL的RIPA裂解液裂解,组织样品按5mg/mL(即5mg组织用1mL RIPA裂解液裂解)的浓度加入RIPA裂解液，同时加入蛋白酶抑制剂cocktail(RIPA/cocktail=50/1(V/V)，即按体积比500μL RIPA中加入10μL cocktail)，吹打混匀。冰上放置30-40min后，利用超声波裂解：使用探针型超声冰上进行适当频率的短促冲击，共5-8次，每次5-10sec，中间间隔10-20sec。裂解混合物于4℃，15000r/min离心(细胞裂解混合物离心30min，组织裂解 混合物离心60min)。吸取上清于新的Ep管，用Protein Assay Kit测定蛋白浓度。-80℃保存备用或立即用于下游实验。

[0041] 3.2SDS-PAGE电泳与染色

[0042] 蛋白样品准备：根据测定浓度(测定蛋白浓度一般为6-12mg/mL)，将标记的细胞蛋白分别与两种状态的组织蛋白等量混合，

[0043] 上样电泳：在样品中加入等体积2×SDS上样缓冲液，沸水煮5-10min，12000g离心5min，保留上清。起始电压80V，直到溴酚蓝指示剂进入分离胶，调整电压为120V，至指示剂到达底部边缘，停止电泳，取出凝胶切角做记号。考马斯亮蓝G-250振摇染色过夜，脱色液脱色至背景完全去除。对凝胶扫描成像，储存。

[0044] 3.4酶解，提肽，质谱鉴定与分析

[0045] 切胶前用Milli-Q水洗胶2-3次，以除去残留的乙酸和乙醇。用塑料切胶片将3
胶切成1mm大小的胶粒，盛于0.6mL EP管中。加入100ul（对于小胶的一条带）50%乙腈(Acetonitrile,ACN)/50%50mM NH4HCO3溶液，漩涡混合仪上混旋10-30min，去掉上清，重复1-2次，直到完全脱色。加100μL ACN混匀胶粒，室温下放置5-10min，可见胶粒变白，吸去ACN；重复1-2次，在37℃放置10-20min，让残留ACN挥发尽。每管加12.5ng/μL胰酶将胶粒没过。37℃，酶解过夜。将酶解液转移到新的0.6mL EP管中，胶粒中加入
50-80μL50%ACN/5%TFA，超声10-15分钟，离心，上清合并；再加入20-50μL50%ACN/5%TFA，重复1-2次，上清合并。封上parafilm膜，扎孔，-80℃冷冻上清，冻干，进行质谱鉴定。

[0046] 3.5免疫组化检测PGRMC1蛋白的表达及磷酸化水平

[0047] 3.5.1组织处理及切片

[0048] (1)取人肾癌和癌旁组织，切成小块，厚度不超过5mm，做好标记，用10%中性福尔马林固定24h以上，自来水冲洗过夜；

[0049] (2)过梯度酒精：75%酒精，1次，1h→85%酒精，1次，1h→95%酒精，1次，1h→100%酒精，2次，每次30min；

[0050] (3)二甲苯，2次，每次30min；

[0051] (4)石蜡浸泡，3次，每次30min；

[0052] (5)用石蜡包埋组织；

[0053] (6)切片：厚度为3～5μm。

[0054] 3.5.2免疫组化染色

[0055] (1)石蜡切片脱蜡至水：将石蜡切片置于60℃中加热2h，迅速置于二甲苯I脱蜡10min，再置于二甲苯II脱蜡10min，分别用100%、95%、80%、70%酒精处理各2min，蒸馏水洗涤2 次(置于摇床)，每次5min。

[0056] (2)过氧化氢(Maixin-Bio,KIT-9710a)封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温避光处理10min，再用蒸馏水洗2次，每次5min。

[0057] (3)抗原修复：将切片置于抗原修复液(10mM柠檬酸钠缓冲液，pH6.0)中，煮沸后高压加热5min，自然冷却至室温，PBS洗片2次，每次5min。

[0058] (4)正常血清封闭：取出切片，用滤纸吸去切片背面水分及切片正面组织周围水分(保持组织呈湿润状态)，滴加正常血清(与第二抗体同源动物血清)(Maixin-Bio,KIT-9710b)，37℃孵育15min，PBS洗2次，每次5min。

[0059] (5)一抗孵育：用滤纸吸多余血清，直接滴加羊抗人PGRMC1多克隆抗体或Phospho-Threonine-Proline抗体(1:200)，4℃过夜孵育，PBS洗2次，每次5min。

[0060] (6)二抗孵育：滴加生物素标记的第二抗体(Maixin-Bio,KIT-9710c)，37℃孵育40min，PBS洗2次，每次5min。

[0061] (7)三抗孵育：滴加酶标链亲和素复合物(Maixin-Bio,KIT-9710d)37℃孵育40min，PBS洗2次，每次5min。

[0062] (8)DAB显色：滤纸吸去切片周围液体，滴加新鲜配制DAB工作液(显色剂A：显色剂B：显色剂C1:1:1混合后稀释20倍)显色，镜下观察，适时用自来水终止显色。

[0063] (9)苏木素复染：室温30sec，自来水冲洗返蓝15min。

[0064] (10)梯度酒精脱水：80%酒精，2min→95%酒精，2min→100%酒精，2次，每次5min。

[0065] (11)用中性树胶封片，光镜下观察

[0066] 4.结果及分析

[0067] 质谱鉴定结果如图1。通过基于Leu-d3的定量蛋白质组鉴定，肾癌组织中PGRMC1的表达比癌旁正常肾组织上调3.91倍。

[0068] 为进一步验证以Leu-d3为内标定量组织蛋白组学方法适用于新鉴定差异蛋白的定量比较，我们对PGRMC1做了Western Blot和免疫组化分析。Western Blot（图2）和免疫组化（图3）结果显示，以保守蛋白β-actin为对照，与癌旁正常肾组织相比，PGRMC1在肾癌组织中表达高得多。

[0069] 已有文献报道PGRMC1蛋白的磷酸化位点有Ser-57，Ser-181，Tyr-139，Tyr-180，Thr-74【11,12】。我们应用LC-ESI-MS/MS质谱技术，首次在肾癌中鉴定到了PGRMC1蛋白的磷酸化位点Thr-74（图4）。通过Western blot在三对肾癌组织和癌旁正常肾组织中鉴定到PGRMC1蛋白的磷酸化位点Thr-74。肾癌组织中PGRMC1的磷酸化水平高于癌旁正常肾组织。

[0070] 在上述定量蛋白组学分析鉴定肾癌组织中PGRMC1蛋白的基础上，首次系统分析了肾癌中 PGRMC1蛋白的相对表达水平与肾癌临床分级的关系，PGRMC1蛋白磷酸化参与的信号通路及生物学功能，这些研究结果至今未见国内外报道。我们发现PGRMC1蛋白的表达水平与肾癌发展具有临床相关性（见表1），PGRMC1蛋白在大部分肾癌中明显上调（p<0.01）。在45例肾细胞癌中，1例（2.2%）样本中PGRMC1阴性表达，44例（97.8%）阳性表达，其中20例（44.4%）为强阳性表达；而在癌旁肾组织中，3例（6.7%）为阴性表达，42例（93.3%）为阳性表达，其中7例（15.6%）强阳性表达。

[0071] 表1.肾癌和癌旁组织中PGRMC1表达

[0072]

[0073] 1.Student’s t test,p<0.001。

[0074] 2.a:阴性;b:弱阳性;c:中度阳性;d:强阳性。

[0075] 同时，45例病人的平均年龄为58岁，其中30例为男性，其他15例为女性。在45例病人中，我们没有发现PGRMC1的表达和病人性别的相关性（p>0.05）。然而我们发现PGRMC1的表达和病人肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）Fuhrman等级相关（p<0.05）（见表2）。Fuhrman核分级是在RCC组织中广泛使用的组织分级系统，Fuhrman核分级是目前最广泛应用于肾细胞癌的核分级系统，该分级系统主要根据细胞核大小、形状和核仁是否明显而分为4级，对经典型RCC具有很好的预测预后价值。

[0076] 表2.PGRMC1表达水平和RCC病人Fuhrman等级的相关性（n=45）

[0077]Fuhrman等级* 例数（%） 得分 表达水平
G2 20(44.44%) 6.40±3.87 ++
G3 23(51.11%) 8.77±3.28 ++/+++
G4 2(4.44%) 12 +++

[0078] 1.One-way ANOVA分析,p<0.05;LSD-t test,p<0.05（G2比G3;G2比G4）。

[0079] 2.+:弱表达;++:中度表达;+++:强表达。

[0080] 结果表明，RCC病人Fuhrman等级越高，PGRMC1的表达水平越高。说明PGRMC1的表达水平与RCC病人肿瘤分级成正相关，表明可以通过PGRMC1的表达水平来表征RCC的肿瘤恶性程度。

[0081] 在此基础上，我们用15μM索拉菲尼处理肾癌OS-RC-2细胞24h，发现PGRMC1蛋白的表达水平变化不大，但PGRMC1蛋白的Thr74位磷酸化水平变化明显（图5），并能影响 肾癌细胞生长。

[0082] 本发明的研究结果阐明了PGRMC1蛋白在肾癌发生发展中的作用，对于优化当前可用的疗法以及发展肾癌诊治新的靶标分子具有重要意义，尤其在指导开发PGRMC1蛋白靶向用于肾癌早期诊断的相关试剂或试剂盒以及肾癌治疗药物方向具有重要的应用价值。

[0083] 参考文献

[0084] 【1】Cahill MA:Progesterone receptor membrane component1.an integrative review.J Steroid Biochem Mol Biol2007,105:16-36.

[0085] 【2】Losel RM,Besong D,Peluso JJ,Wehling M:Progesteronereceptor membrane component1--many tasks for a versatile protein.Steroids2008,73:929-934.

[0086] 【3】Crudden G,Loesel R,Craven RJ:Overexpression of the cytochrome p450activator hpr6(heme-1domain protein/human progesterone receptor)in tumors.Tumour Biol2005,26:142-146.

[0087] 【4】Peluso JJ,Liu X,Saunders MM,Claffey KP,Phoenix K:Regulation of ovarian cancer cell viability and sensitivity to cisplatin by progesterone receptor membrane component-1.J Clin Endocrinol Metab2008,93:1592-1599.[0088] 【5】Difilippantonio S,Chen Y,Pietas A,Schluns K,Pacyna-Gengelbach M,Deutschmann N,et al:Gene expression profiles in human non-small and small-cell lung cancers.Eur J Cancer2003,39:1936-1947.

[0089] 【6】Dressman HK,Hans C,Bild A,Olson JA,Rosen E,Marcom PK,et al:Gene expression profiles of multiple breast cancer phenotypes and response to neoadjuvant chemotherapy.Clin Cancer Res2006,12:819-826.

[0090] 【7】Irby RB,Malek RL,Bloom G,Tsai J,Letwin N,Frank BC,et al:Iterative microarray and RNA interference-based interrogation of the SRC-induced invasive phenotype.Cancer Res2005,65:1814-1821.

[0091] 【8】Neubauer H,Clare SE,Wozny W,Schwall GP,Poznanovic S,Stegmann W,et al:Breast cancer proteomics reveals correlation between estrogen receptor status and differential phosphorylation of PGRMC1.Breast Cancer Res2008,10:15.[0092] 【9】Craven RJ:PGRMC1:a new biomarker for the estrogen receptor in breast cancer:Breast Cancer Res 2008,10(6):113.

[0093] 【10】Mallory JC,Crudden G,Oliva A,Saunders C,Stromberg A,Craven RJ:A novel group of genes regulates susceptibility to antineoplastic drugs in highly tumorigenic breast cancer cells.Mol Pharmacol2005,68:1747-1756.

[0094] 【11】Cahill MA:Progesterone receptor membrane component1:An integrative review.J Steroid Biochem Mol Biol2007,105:16–36.

[0095] 【12】Neubauer H,Clare SE,Wozny W:Breast cancer proteomics reveals correlation between estrogen receptor status and differential phosphorylation of PGRMC1.Breast Cancer Res2008,10:R85.