回阳救逆和防治慢性心衰的组合物、药物及制备方法

摘要

回阳救逆和防治慢性心衰的组合物、药物及制备方法。该组合物由人参皂苷提取物、不含双酯型生物碱的附子提取物和干姜提取物组成，以其提取原料重量份计的比例为人参或红参:附子:干姜=1:(1~5):(1~5)。该组合物在回阳救逆、治疗急慢性心衰以及心肺脑复苏作用等方面，不仅能产生明显的协同增效作用，而且毒性明显小于常见的附子采用酸水、水或乙醇等提取方式得到的组合物，因此药效成分的配伍更为合理、更安全。以该组合物为有效成分，与药物中可以接受的辅助添加成分可以组成具有回阳救逆和防治慢性心衰功效的口服药物制剂。

权利要求

1.回阳救逆和防治慢性心衰的组合物，其特征是由人参皂苷提取物、不含双酯型生物碱的附子提取物和干姜提取物组成，以其提取原料重量份计的比例为人参或红参:附子:干姜=1:(1~5):(1~5)，其中：

所述的不含双酯型生物碱的附子提取物，为由附子在维持pH值6.5~9的条件下水煎煮得到水提取液，加乙醇至含醇体积比达50~85%，由静置沉淀并固液分离后的液体除去溶剂得到的附子提取物，或者将该水提取液用大孔吸附树脂吸附和水洗除杂后，收集由50~90%的乙醇洗脱液除去溶剂得到的附子提取物；

人参皂苷提取物为人参或红参用含醇体积比为0~80%的乙醇-水混合溶剂提后，提取液用大孔吸附树脂吸附和水洗除杂后，用含醇体积比50~80%的乙醇洗脱，收集洗脱液并除去溶剂得到的提取物；

干姜提取物为用水蒸气蒸馏提取挥发油后，蒸馏剩余物固液分离，姜渣继续用水煎煮，煎煮液与由蒸馏剩余物分离的液体合并后浓缩，用乙醇沉淀，固液分离后的溶液除去溶剂，与蒸馏得到的挥发油共同作为干姜提取物；或是将干姜用超临界二氧化碳萃取得到挥发油后，剩余姜渣用水煎煮，收集煎煮液并浓缩后，用乙醇沉淀，固液分离后的液体除去溶剂，与萃取得到的挥发油共同作为干姜提取物。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征是所说各提取物以其提取原料重量份计的比例为人参或红参:附子:干姜=1:(2~3):(1~2)。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征是所说各提取物以其提取原料重量份计的比例为人参或红参:附子:干姜=1:2:1。

4.如权利要求1至3之一所述的组合物，其特征是所说的提取原料中的附子为生附片、黑附片、白附片、淡附片或蒸附片。

5.权利要求1至4之一所述组合物的制备方法，其特征是由分别得到的人参皂苷提取物、附子提取物和干姜提取物按所说比例混合而成，其中：a、人参皂苷提取物：将药用原料人参或红参用含醇体积比为0~80%的乙醇-水混合溶剂提取后，提取液用大孔吸附树脂吸附和水洗除杂后，用含醇体积比50~80%的乙醇洗脱，收集洗脱液并除去溶剂，得到人参皂苷提取物；

b、不含双酯型生物碱的附子提取物：药用原料附子在维持pH值6.5~9的条件下水煎煮，收集煎煮液后按下述方式之一处理：方式1：煎煮液中加入乙醇，使其含醇体积比达50~85%静置沉淀，固液分离，收集液体并除去溶剂，得到所说的附子提取物；

方式2：煎煮液用大孔吸附树脂吸附和水洗除杂后，用50~90%的乙醇洗脱，收集洗脱液并除去溶剂，得到附子提取物；

c、干姜提取物按下述任一方式得到：

方式1：干姜用水蒸气蒸馏提取挥发油后，蒸馏剩余物固液分离，姜渣继续用水煎煮，煎煮液与由蒸馏剩余物分离的液体合并后浓缩，用乙醇沉淀，固液分离后的溶液除去溶剂，与蒸馏得到的挥发油共同作为干姜提取物；

方式2：干姜用超临界二氧化碳萃取得到挥发油后，剩余姜渣用水煎煮，收集煎煮液并浓缩后，用乙醇沉淀，固液分离后的液体除去溶剂，与萃取得到的挥发油共同作为干姜提取物。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是所说a步中人参皂苷提取物的制备方式为：以药用原料人参或红参的水提取液经所说的大孔吸附树脂吸附、水洗除杂和收集由含醇体积比50~80%的乙醇-水溶液的洗脱液，得到所说的人参皂苷提取物；或者用含醇体积比50~80%的乙醇-水溶液对药用原料人参或红参提取后，除去提取液中的乙醇，剩余的水溶液用大孔吸附树脂吸附并水洗除杂，然后用含醇体积比50~80%的乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液并除去溶剂，得到所说的人参皂苷提取物。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征是所说b 步中在维持pH值6.5~9的条件下水煎煮后，再用中性或pH值2~5的水煎煮，合并全部煎煮液后进行所说的后续处理。

8.如权利要求７所述的制备方法，其特征是所说b 步中再用中性或pH值2~5的水煎煮1~2次。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征是所说b 步中的药用原料附子在维持pH值

6.5~9条件下水煎煮2~3次后，收集煎煮液继续按下述方式处理：

在所说的方式1中：收集的煎煮液浓缩至相对密度1.10~1.30后，再进行所说加入乙醇的后续处理；或者在所说的方式2中：收集的煎煮液用大孔吸附树脂吸附并水洗除杂后，用醇体积含量为50~90%且pH≤5的酸性乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液并除去溶剂，得到所说的附子提取物。

10.如权利要求5所述的制备方法，其特征是所说c 步中的干姜提取物方法为：

所说方式1中：与蒸馏剩余物固液分离的姜渣继续水煎煮1~2次后，合并的液体浓缩至相对密度1.10~1.30后加入乙醇，使混合物的含醇体积比达50~85%，静置并固液分离后的液体除去溶剂，与挥发油共同作为干姜提取物；或者所说的方式2中：在30~60℃和20~40Mpa压力条件下经超临界二氧化碳萃取得到挥发油后，剩余姜渣再用水煎煮2~3次，合并煎液并浓缩至相对密度1.10~1.30后，加入乙醇至混合物的含醇体积比达50~85%进行沉淀，静置后固液分离的液体并除去溶剂，与挥发油共同作为干姜提取物。

11.回阳救逆和防治慢性心衰的口服药物制剂，其特征是以权利要求1至4之一所述组合物为有效成分，与药物中可以接受的辅助添加成分共同组成。

说明书

回阳救逆和防治慢性心衰的组合物、药物及制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种天然药物成分的组合物，具体讲是一种具有回阳救逆和防治慢性心衰作用的组合物、相应的药物及制备方法。

背景技术

[0002] 附子是一味具有回阳救逆，补火助阳之功效的重要药材，用于亡阳虚脱，肢冷脉微，心阳不足，胸痹心痛等。同时附子也为有毒中药，主要剧毒性成分为双酯型生物碱（乌头碱、新乌头碱、次乌头碱）。关于附子回阳救逆的有效成分目前尚不清楚，有报道附子中的新乌头原碱、次乌头原碱、去甲乌药碱、氯化甲基多巴胺、去甲猪毛菜碱、尿嘧啶、附子苷等水溶性成分具有强心和/或升压的作用。以附子为主药组成的古方有参附汤（人参、附子）、四逆汤（附子、干姜、甘草）、人参四逆汤（人参、附子、干姜、甘草）等，具有回阳、益气、固脱之功效，用于元气大亏，阳气暴脱，防治慢性心衰等作用。人参则具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智之功效，主要有效成分为人参皂苷。

[0003] 历代医家及本草著作皆言附子“有毒”或“有大毒”，用之不当，易出现严重的毒副作用。因此现代临床汤剂一般使用制附子，且要久煎减毒。在成品药物制剂中一般也使用制附子入药。附子的毒性与双酯型生物碱结构中的酯键直接相关，已有研究报道，双酯型生物碱在酸性条件下稳定，在碱性条件下不稳定而生成单酯型生物碱和乌头类原碱，使毒性降低。

[0004] 公开号为CN1823933A、CN1891265A、CN1660283A、CN1689593A、CN1493331A、CN1951432A等中国专利文献中已分别报道了以不同方式制备得到的人参皂苷和附子提取物为有效成分制备的组合物。其中，对药用原料附子分别有采用酸水、水或乙醇提取，或进一步应用树脂分离纯化，得到附子提取物或总生物碱，其通常都不同程度地含有双酯型生物碱毒性成分。

[0005] 公开号 CN101940778A中国专利报道了附子总生物碱和干姜提取物的组合物，其中，总生物碱含量以乌头碱计为127.6mg/ml，提示该组合物中含有双酯型生物碱。公开号CN102552861A中国专利报道了人参四逆颗粒剂的提取工艺，由人参、附子、甘草、干姜组成，因甘草的主要有效成分为甘草酸，它具有与人肾上腺皮质激素醛固酮相似的作用，长期/大剂量服用后可引起“假性醛固酮增多症”，尿量减少和体内水分储存量增加导致水肿，身体积存过量的钠引起高血压，血钾流失过多引起低血钾症，导致心律失常，故长期使用对慢性心衰患者有不利的负面影响。申请人深入研究发现，由于药用原料附子（制附子和/或生附子）的自身特点，特别是制附子，以普通水按常规方式煎煮后，其水煎液均呈酸性甚至较强的酸性，因此水煎液中的双酯型生物碱较稳定，即使长时间煎煮，不仅去毒效果并不理想，还易造成有益成分的损失。因双酯型生物碱具有明显的心脏毒性，故这些含有双酯型生物碱的附子组合物都存在一定的毒性和安全隐患，也影响了药物疗效的发挥和安全性。

发明内容

[0006] 针对上述情况，本发明提供了一种更有效、更安全的具有回阳救逆和防治慢性心衰作用的组合物，并进一步提供以该组合物作为有效成分的相应的药物及相应的制备方法。

[0007] 本发明回阳救逆和防治慢性心衰的组合物，是由人参皂苷提取物、不含双酯型生物碱的附子提取物和干姜提取物组成，以其提取原料重量份计的比例为人参或红参:附子:干姜=1:(1~5):(1~5)，优选的比例是人参或红参:附子:干姜=1:(2~3):(1~2)，更好的比例为人参或红参:附子:干姜=1:2:1。

[0008] 上述组合物中所说提取原料中的附子，一般可以为生附片、黑附片、白附片、淡附片或蒸附片等生药附子或其各种相应的炮制品，和/或饮片中的任一种。

[0009] 本发明上述组合物的制备方法，是由分别得到的人参皂苷提取物、附子提取物和干姜提取物按所说比例混合而成。其中所说的各类提取物可分别采用下述方式得到：

[0010] a、人参皂苷提取物：将药用原料人参或红参用含醇体积比为0~80%的乙醇-水混合溶剂提取后，提取液用大孔吸附树脂吸附和水洗除杂后，用含醇体积比50~80%的乙醇洗脱，收集洗脱液并除去溶剂，得到人参皂苷提取物。

[0011] b、不含双酯型生物碱的附子提取物：药用原料附子在维持pH值6.5~9的条件下水煎煮，收集煎煮液后按下述方式之一处理：

[0012] 方式1：煎煮液中加入乙醇，使其含醇体积比达50~85%静置沉淀，固液分离，收集液体并除去溶剂，得到所说的附子提取物；

[0013] 方式2：煎煮液用大孔吸附树脂吸附和水洗除杂后，用50~90%的乙醇洗脱，收集洗脱液并除去溶剂，得到附子提取物。

[0014] c、干姜提取物按下述任一方式得到：

[0015] 方式1：干姜用水蒸气蒸馏提取挥发油后，蒸馏剩余物固液分离，姜渣继续用水煎煮，煎煮液与由蒸馏剩余物分离的液体合并后浓缩，用乙醇沉淀，固液分离后的溶液除去溶剂，与蒸馏得到的挥发油共同作为干姜提取物；

[0016] 方式2：干姜用超临界二氧化碳萃取得到挥发油后，剩余姜渣用水煎煮，收集煎煮液并浓缩后，用乙醇沉淀，固液分离后的液体除去溶剂，与萃取得到的挥发油共同作为干姜提取物。

[0017] 在上述制备方法的基础上，所说a步中人参皂苷提取物的制备方式，进一步的优选方式包括：

[0018] 在上述的方式1中，以药用原料人参或红参的水提取液经所说的大孔吸附树脂吸附、水洗除杂和收集由含醇体积比50~80%的乙醇-水溶液的洗脱液，得到所说的人参皂苷提取物。或者是

[0019] 在上述的方式2中，用含醇体积比50~80%的乙醇-水溶液对药用原料人参或红参提取后，除去提取液中的乙醇，剩余的水溶液用大孔吸附树脂吸附并水洗除杂，然后用含醇体积比50~80%的乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液并除去溶剂，得到所说的人参皂苷提取物。

[0020] 上述的制备方法中，所说b 步中的药用原料附子在维持pH值6.5~9条件下的水煎煮，优选煎煮2~3次。收集、合并煎煮液后，继续进行的后续处理的优选方式包括：

[0021] 在采用所说的方式1时，将收集的煎煮液浓缩至相对密度1.10~1.30后，再进行所说加入乙醇的后续处理。或者

[0022] 在采用所说的方式2时，将收集的煎煮液用大孔吸附树脂吸附并水洗除杂后，至少用醇体积含量为50~90%且pH≤5的酸性乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液并除去溶剂，得到所说的附子提取物。

[0023] 进一步，上述的制备方法中，在所说b 步中在维持pH值6.5~9的条件下水煎煮后，更好的方式是，可以先再用中性或pH值2~5的水煎煮，例如可煎煮1~2次，然后再合并全部煎煮液，继续进行所说的后续处理。

[0024] 申请人的深入研究发现，附子在维持pH值6.5~9的条件下水煎煮得到水提取液，可以完全去除双酯型生物碱，使其中的乌头碱转化为苯甲酰乌头原碱和乌头原碱，从而显著降低其毒性，如小鼠/大鼠静脉注射的该三者的毒性（LD50）分别为：0.12/0.102mg/kg，10.1±0.5/24±3mg/kg和116.5±3.9/374±40mg/kg，新乌头碱和次乌头碱也发生相应的转化。该水煎煮条件既避免了常规自然状态下用水煎煮附子所导致的煎煮液pH不断减小，不利于双酯型生物碱的去除和减毒，以及长时间煎煮所带来的不利，也避免了以高碱性的水浸泡和/或煎煮对设备及操作造成的不利，更为有益的是避免了其它药效成分的破坏或损失，显然将更有利于在规模化生产中的采用和推广。特别是，经pH值6.5~9条件下煎煮已去除了双酯型生物碱的附子原料，再进一步用pH值2~5的水煎煮，还可以进一步有利于附子中生物碱成分被充分提取出来。对已去除而不含双酯型生物碱的提取液，再以醇沉或经大孔树脂柱分离等方式除去包括多糖等形式的杂质，可以很好地保留其具有优良药效作用的成分。

[0025] 上述制备方法中，所说c 步中的干姜提取物方法可以进一步采用的优选方式包括：

[0026] 在所说的方式1中，与蒸馏剩余物固液分离的姜渣继续水煎煮1~2次后，合并的液体浓缩至相对密度1.10~1.30后加入乙醇，使混合物的含醇体积比达50~85%，静置并固液分离后的液体除去溶剂，与挥发油共同作为干姜提取物。或者

[0027] 在所说的方式2中，在30~60℃和20~40Mpa压力条件下经超临界二氧化碳萃取得到挥发油后，剩余姜渣再用水煎煮2~3次，合并煎液并浓缩至相对密度1.10~1.30后，加入乙醇至混合物的含醇体积比达50~85%进行沉淀，静置后固液分离的液体并除去溶剂，与挥发油共同作为干姜提取物。

[0028] 以本发明上述形式的组合物为有效成分，与药物中可以接受的相应辅助添加成分，如常用的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等辅料/助剂，根据使用需要，按照目前的常规工艺方式，制备成可供使用的包括片剂、滴丸、胶囊剂、微丸等常用的药物制剂，优选为口服型的药物制剂。

[0029] 例如，作为本发明上述组合物的一种优选和典型的制备方法可采用为：药用原料人参或红参用含醇体积比50~80%的乙醇-水溶液提取，除去提取液中的乙醇，剩余的水溶液用大孔吸附树脂吸附并水洗除杂后，用含醇体积比50~80%的乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，得到人参皂苷提取物，备用；

[0030] 附子在维持pH值6.5~9条件下水煎煮2~3次，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.10~1.30后加入乙醇，使混合物的含醇体积比达50~85%，静置后固液分离，收集液体并除去溶剂，得到附子提取物，备用；

[0031] 干姜粉碎，用超临界二氧化碳萃取，萃取温度30~60℃，萃取压力20~40Mpa，得到挥发油；姜渣再加水煎煮2~3次，合并煎液，浓缩至相对密度1.10~1.30后加入乙醇，使混合物的含醇体积比达50~85%，静置后固液分离，收集液体并除去溶剂，与挥发油共同作为干姜提取物。将上述得到的人参皂苷提取物、附子提取物和干姜提取物与适当的药物辅料采用常规的制药工艺，即可制成相应的口服型药物制剂。

[0032] 实验结果显示，本发明所述的由人参皂苷提取物、不含双酯型生物碱的附子提取物和干姜提取物组成的组合物，在回阳救逆、治疗急慢性心衰以及心肺脑复苏作用等方面，不仅能产生明显的协同增效作用，而且毒性明显小于目前对附子常采用的以酸水、水或乙醇等提取方式得到的组合物。因此，与包括前述文献在内的目前药物和/或制备方法相比，本发明的组合物及相应的药物，其药效成分配伍更为合理、更安全。

[0033] 以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

具体实施方式

[0034] 实施例1

[0035] 取红参3kg，加12倍水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，上HPD100大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用70%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到人参皂苷提取物。

[0036] 另取生附片5kg，加8倍量水，煎煮开始及煎煮过程中用氢氧化钠溶液调节pH值为6.5-7.5，煎煮3次，每次1小时，滤过，合并滤液，回收水、浓缩至相对密度约为1.20，加95%(v，以下均同此)乙醇使含醇量达80-85%，充分搅拌，静置过夜，滤过，回收乙醇，浓缩，干燥，得到不含双酯型生物碱的附子提取物。

[0037] 取干姜（粉碎）4.5kg，用超临界二氧化碳萃取，萃取温度40℃，萃取压力30Mpa，萃取2小时，得到干姜挥发油；姜渣加12倍水煎煮2次，每次1小时，滤过合并滤液，回收水、浓缩至相对密度约为1.20，加95%乙醇使含醇量达70%，充分搅拌，静置过夜，滤过，回收乙醇，浓缩，干燥，得到干姜水煮醇沉物，与干姜挥发油共同作为干姜提取物。

[0038] 将上述人参皂苷提取物、附子提取物和干姜提取物混合，得到本发明的组合物。

[0039] 实施例2

[0040] 取红参1kg，加12倍水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，上HPD100大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用70%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到人参皂苷提取物。

[0041] 另取生附片2kg，加8倍量水，煎煮开始及煎煮过程中用氢氧化钠溶液调节pH值为6.5-7.5，煎煮3次，每次1小时，滤过，合并滤液，上HPD100大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用70%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到不含双酯型生物碱的附子提取物。

[0042] 取干姜4kg，用水蒸气蒸馏6小时提取挥发油，干姜挥发油和蒸馏后的水溶液备用；姜渣加12倍水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液与上述水溶液合并，回收水、浓缩至相对密度约为1.20，加95%乙醇使含醇量达70%，充分搅拌，静置过夜，滤过，回收乙醇，浓缩，干燥，得到干姜水煮醇沉物，与干姜挥发油共同作为干姜提取物。

[0043] 将上述人参皂苷提取物、附子提取物和干姜提取物混合，得到本发明的组合物。

[0044] 实施例3

[0045] 取红参1kg，加8倍量水煎煮3次，每次1小时，滤过，合并滤液，上D101大孔吸附树脂柱，先用2倍柱床体积的水洗涤除杂，再用60%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到人参皂苷提取物。

[0046] 另取黑附片1kg，加12倍量水，煎煮开始及煎煮过程中用碳酸钠溶液调节pH值为8-9，煎煮3小时，滤过，药渣再加pH2-3水6倍量煎煮2次，每次1小时，滤过，合并滤液，回收水、浓缩至相对密度约为1.15，加90-95%乙醇使含醇量达约70%，充分搅拌，静置过夜，滤过，回收乙醇，浓缩，干燥，得到不含双酯型生物碱的附子提取物。

[0047] 取干姜（粉碎）5kg，用超临界二氧化碳萃取，萃取温度30℃，萃取压力40Mpa，萃取2小时，得到干姜挥发油；姜渣加10倍水煎煮2次，每次1.5小时，滤过合并滤液，回收水、浓缩至相对密度约为1.10，加95%乙醇使含醇量达80%，充分搅拌，静置过夜，滤过，回收乙醇，浓缩，干燥，得到干姜水煮醇沉物，与干姜挥发油共同作为干姜提取物。

[0048] 将上述人参皂苷提取物、附子提取物和干姜提取物混合，得到本发明的组合物。

[0049] 实施例4

[0050] 取人参1kg，加10倍量50%乙醇回流提取2次，每次3小时，滤过，合并滤液，回收除尽乙醇，水溶液上D101大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用80%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到人参皂苷提取物。

[0051] 另取蒸附片2kg，加7倍量水，煎煮开始及煎煮过程中用碳酸钠溶液调节pH值为7-8，煎煮2小时，滤过，药渣再加7倍量水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，回收水、浓缩至相对密度约为1.25，加90%乙醇使含醇量达为50-60%，充分搅拌，静置过夜，滤过，回收乙醇，浓缩，干燥，得到不含双酯型生物碱的附子提取物。

[0052] 取干姜（粉碎）1kg，用超临界二氧化碳萃取，萃取温度60℃，萃取压力20Mpa，萃取1小时，得到干姜挥发油；姜渣加8倍水煎煮3次，每次0.5小时，滤过合并滤液，回收水、浓缩至相对密度约为1.25，加乙醇使含醇量达50%，充分搅拌，静置过夜，滤过，回收乙醇，浓缩，干燥，得到干姜水煮醇沉物，与干姜挥发油共同作为干姜提取物。

[0053] 将上述人参皂苷提取物、附子提取物和干姜提取物混合，得到本发明的组合物。

[0054] 实施例5

[0055] 取人参1kg，加7倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，回收除尽乙醇，水溶液上AB8大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用70%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到人参皂苷提取物。

[0056] 另取淡附片3kg，加12倍量水，煎煮开始及煎煮过程中用碳酸钠溶液调节pH值约为9，煎煮2小时，滤过，药渣再加12倍量pH4-5水煎煮2小时，滤过，合并滤液，上D101大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用pH值4-5的50%乙醇洗脱，收集4倍柱床体积的乙醇洗脱液，调节pH值近中性，回收乙醇，浓缩，干燥，得到不含双酯型生物碱的附子提取物。

[0057] 再取干姜2kg，用水蒸气蒸馏4小时提取挥发油，干姜挥发油和蒸馏后的水溶液备用；姜渣加8倍水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液与上述水溶液合并，回收水、浓缩至相对密度约为1.30，加乙醇使含醇量达50%，充分搅拌，静置过夜，滤过，回收乙醇，浓缩，干燥，得到干姜水煮醇沉物，与干姜挥发油共同作为干姜提取物。

[0058] 取上述干姜挥发油用β一环糊精包合后，加入上述人参皂苷提取物、附子提取物、干姜水煮醇沉物，再加入微晶纤维素和羧甲基淀粉钠等辅料适量，混合均匀，制粒，干燥，压片，包衣，即为本发明的片剂型药物。

[0059] 实施例6

[0060] 取红参1kg，加12倍量80%乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，回收除尽乙醇，水溶液上HPD100大孔吸附树脂柱，先用2倍柱床体积的水洗涤除杂，再用50%乙醇洗脱，收集3-4倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到人参皂苷提取物。

[0061] 另取生附片5kg，加12倍量水，煎煮开始及煎煮过程中用碳酸钠溶液调节pH值为8-9，煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，上AB8大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用pH值2-3的90%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，调节pH值近中性，回收乙醇，浓缩，干燥，得到不含双酯型生物碱的附子提取物。

[0062] 取干姜3kg，用水蒸气蒸馏8小时提取挥发油，干姜挥发油和蒸馏后的水溶液备用；姜渣加12倍水煎煮1次，滤过，滤液与上述水溶液合并，回收水、浓缩至相对密度约为1.10，加乙醇使含醇量达85%，充分搅拌，静置过夜，滤过，回收乙醇，浓缩，干燥，得到干姜水煮醇沉物，与干姜挥发油共同作为干姜提取物。

[0063] 取上述干姜挥发油用β一环糊精包合后，加入上述人参皂苷提取物、附子提取物、干姜水煮醇沉物，加入药用淀粉适量，混合均匀，制粒，干燥，装入胶囊，得到本发明的胶囊型药物。

[0064] 以下通过毒性成分的含量和毒/效作用为评价指标，进一步说明本发明组合物所具有的有益效果。

[0065] 1、附子煎煮过程中水煎液的pH值测定

[0066] 取黑附片、白附片、淡附片、蒸附片、生附片各0.5kg，分别加10倍量水煎煮，沸腾后于30、60、90、120分钟测定水煎液的pH值，结果见表1。结果表明，自然煎煮状态下的附子水煎液均呈酸性，pH值为4-6。

[0067] 表1 附子煎煮过程中水煎液的pH值

[0068]煎煮时间 30分钟 60分钟 90分钟 120分钟
黑附片（pH） 4.29 4.10 4.09 4.12
白附片（pH） 4.42 4.39 4.38 4.40
淡附片（pH） 5.28 5.11 5.10 5.16
蒸附片（pH） 5.34 5.22 5.16 5.23
生附片（pH） 6.03 5.91 5.88 5.92

[0069] 2、附子煎煮pH值对双酯型生物碱含量的影响

[0070] 2.1 取生附片（或黑附片）0.5kg，共7份，分别加水10倍量回流煎煮2小时，煎煮开始和煎煮过程中用盐酸溶液或氢氧化钠溶液分别调节pH约为2、4、5.5、6.5、7.5、9、11。采用高灵敏度的LC-MS方法直接测定水煎液中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量，结果见表2。结果显示，附子煎煮液的pH值对双酯型生物碱的含量有显著影响：当pH＜6.5时，水煎液中含有双酯型生物碱，且酸性越强，双酯型生物碱含量越高；当pH≥6.5时，水煎液中即未检出双酯型生物碱。

[0071]

[0072] 2.2 另取生附片0.5kg，加水10倍量回流煎煮2小时，煎煮开始和煎煮过程中不调节pH值。测定水煎液的pH值为6.01，采用中国药典HPLC方法测定水煎液中双酯型生物碱的含量，结果：未检出双酯型生物碱，与文献报道相同（陈东安等，附子煎煮过程中酯型生物碱含量的动态变化，中国实验方剂学杂志，2011,17(3):64-68）。但采用更高灵敏度的LC-MS方法测定，仍能检出少量的双酯型生物碱，乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量分别为0.23、0.49、0.75（μg/g，以生药计）。

[0073] 3、附子煎煮pH值对毒/效作用的影响

[0074] 取黑附片各4份，分别加水11倍和9倍煎煮2次，煎煮开始和煎煮过程中用盐酸溶液或氢氧化钠溶液分别调节pH约为 2、5.5、6.5、9，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收，浓缩至1g生药/ml，加2倍95%乙醇沉淀，充分搅拌，静置过夜，滤过，减压回收溶剂，浓缩至3g生药/ml，得到黑附片水煮醇沉提取物。另取生附片各4份，同上述方法制备得到生附片水煮醇沉提取物。

[0075] 3.1急性毒性试验

[0076] 按常规方法进行急性毒性试验，计算LD50。结果显示：上述黑附片pH2、pH5.5水煮醇沉提取物的LD50分别为62.5g生药/kg、85.7g生药/kg，pH6.5、pH9水煮醇沉提取物未测出LD50。生附片pH2、pH5.5水煮醇沉提取物的LD50分别为5.8g生药/kg、32.3g生药/kg，pH6.5、pH9水煮醇沉提取物未测出LD50。表明酸性条件下（pH2或pH5.5）附子提取物毒性大，近中性（pH6.5）或碱性（pH9）条件下附子提取物毒性显著减小。

[0077] 3.2 附子提取物强心活性试验

[0078] 试验样品：上述黑附片、生附片水煮醇沉提取物；

[0079] 文献报道的样品：

[0080] 样品A：取黑附片0.5kg，分别加70%乙醇8、6、6倍回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收除去乙醇，浓缩至3g生药/ml，即得。

[0081] 样品B：取黑附片0.5kg，分别加70%乙醇8、6、6倍回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收除尽乙醇，水溶液上HPD100大孔吸附树脂柱，先用4倍柱床体积的水洗涤除杂，再用70%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至3g生药/ml，即得。

[0082] 样品C：（按照前述CN 1951432A的实施例3方法制备得到）：取黑附片0.5kg，粉碎，加4000ml水，用1N氢氧化钠溶液调节pH值至12，室温下浸泡24小时，薄层鉴别无乌头碱及次乌头碱为止，滤过，残渣用稀盐酸溶液渗漉提取生物碱，生物碱沉淀反应检测至提取完全止；合并滤液及渗漉液，用稀盐酸调节溶液pH值至2；减压回收，浓缩至1g生药/ml，加2倍95%乙醇沉淀，充分搅拌，静置过夜，滤过，减压回收溶剂，浓缩至3g生药/ml，即得。

[0083] 样品D：（按照前述CN 1951432A的实施例4方法制备得到）：取生附片0.5kg，粉碎，加4000ml水，用1N氢氧化钠溶液调节pH值至12，室温下浸泡40小时，薄层鉴别无乌头碱及次乌头碱为止，滤过，残渣用稀盐酸溶液渗漉提取生物碱，生物碱沉淀反应检测至提取完全止；合并滤液及渗漉液，用稀盐酸调节溶液pH值至2；上样于处理好的DM—130大孔吸附树脂层析柱上，水洗脱至无色，然后用30%乙醇洗脱3个柱体积，收集乙醇洗脱液，减压浓缩除去乙醇至适当体积，用氨水调节PH值至9左右，静置沉淀，并用水洗涤沉淀，再用酸水溶解配制成相当于3g生药/ml，即得。

[0084] 试验方法：

[0085] 取大鼠击头致昏，颈动脉放血，迅速开胸取心脏，放入盛有充氧的低温洛氏液培养皿中，沿房室沟剪去心室，保留心房，勿伤窦房结，在左右心房尖部各系一线，一根固定于吊钩上，另一根连于肌张力换能器，将心房置于麦氏浴槽中，槽中盛有30ml连续通氧的浴氏液，用超级恒温水浴保持32℃，此时心房恢复节律性收缩，调节二道生理仪各常数，记录心脏振幅及心跳频率。分次加入上述试验样品（附子提取物）50μl、50μl、100μl、200μl，累计量为400μl，观察每次加药前后的变化，每份样品重复实验4次，取平均值。结果见表3。

[0086] 试验结果：

[0087] 附子煎煮pH值对毒/效作用有明显的影响。酸性条件下（pH2或pH5.5）附子提取物心脏毒性大，致心律不齐和/或心脏抑制，中性或碱性条件下（pH6.5或pH9）附子提取物未见明显的心脏毒性，有显著的强心作用。此外，文献报道的附子醇提样品或醇提大孔树脂处理样品，均有一定的心脏毒性（心律不齐），影响了强心药效作用的发挥。附子碱水浸泡、酸水渗漉，再进一步用树脂处理得到的样品，不仅强心作用不强，而且仍有一定的心脏毒性。上述试验结果充分证明，本发明不含双酯型生物碱的附子提取物也许正是因为毒性的降低，更有利于药效作用的发挥，产生了意想不到的更好的疗效。

[0088]

[0089] 4、本发明组合物防治慢性心衰药效试验

[0090] 4.1 动物分组及造模：取90只SD大鼠，雌雄各半，适应性喂养3d后，随机取10只（雌雄各半）作为Ⅰ号组（空白对照组），尾静脉注射等体积生理盐水。其余80只大鼠用阿霉素（ADR）造模，每kg/次/大鼠用4mg，每5天注射1次，共3次。末次ADR给药24h后，随机选取模型鼠3只，断头处死，取出心脏，用预冷0.9%生理盐水冲洗，取左室心肌部分，以10%甲醛固定，HE染色，光镜下观察确认造模成功后，再将所余大鼠随机分为Ⅱ号组（心衰模型组）、Ⅲ号组（地高辛治疗组）、Ⅳ号组（实施例1组合物）、Ⅴ号组（人参皂苷提取物+附子提取物组，由原料人参:附子=3:5提取得到）、Ⅵ号组（附子提取物+干姜提取物组，由原料附子:干姜=5:4.5提取得到）、Ⅶ号组（人参皂苷提取物+附子提取物+干姜提取物组+甘草提取物组，由原料人参:附子:干姜:甘草=3:5:4.5:6提取得到）。各组均精饲料喂养，自由饮水。

[0091] 上述实验药物中人参皂苷提取物、附子提取物、干姜提取物分别均按实施例1的方法制备。甘草提取物按2010版中国药典一部P.376页甘草流浸膏项下方法制备，即甘草水煎煮浸膏加乙醇使含醇量达65%，静置过夜，分取上清液，遗留沉淀再加65%的乙醇，充分搅拌，静置过夜，取出上清液，沉淀再用65%乙醇提取一次，合并三次提取液，滤过，回收乙醇，浓缩，干燥，得到甘草提取物。

[0092] 4.2 给药方法：Ⅲ～Ⅶ组造模后次日开始灌胃给药，连续给药21d，试验药物组8g生药/kg，地高辛按1.6mg/kg给药，Ⅰ、Ⅱ组以等体积的生理盐水灌胃。

[0093] 4.3 实验结果

[0094] （1）一般症状：正常对照组（Ⅰ组）大鼠毛色光泽，行动敏捷，外观正常。其余80只大鼠在第1～3次尾静脉注射ADR后先后出现活动减少、蜷缩、纳食减少、体重减轻、腹水、尿少便溏，呼吸减弱、毛色枯槁、脱毛、消瘦等，第3次ADR注射后80只大鼠中死亡11只，取3只大鼠作造模测试，其余66只大鼠随机分为6组，每组各11只。在给药阶段，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组又分别死亡4只、2只、3只、2只、3只、2只。随后实验期间，用药组大鼠不再死亡，除心衰模型组外，其它存活大鼠症状均有不同程度的改善，Ⅲ～Ⅶ组存活大鼠症状明显优于心衰模型组。

[0095] （2）生化检查与病理学检查：给药后第15天，股静脉取血，处理后分别用化学法及放免法测定各组大鼠血浆中NO、血清TNF-α的水平，结果见表4。模型组NO、TNF-α水平明显高于正常对照组及各治疗组（P<0.01，P<0.001）。

[0096] 最后放血处死大鼠，取左室心肌部分，以10%甲醛固定，常规石蜡包埋，病理切片，HE染色，光镜观察。可见正常对照组心肌细胞形态、胞质、间质及横（纵）纹均正常，但心衰模型组存在心肌细胞横（纵）纹不清，部分区域肌质纤维溶解，胞浆空泡变性，出现不同程度的炎症细胞浸润和间质水肿病变。给药组（Ⅲ～Ⅶ组）以上病变较心衰模型组有显著减轻，心肌细胞横（纵）纹存在，其中，Ⅳ组优于Ⅴ组、Ⅵ和Ⅶ组。

[0097] 上述试验结果表明，本发明组合物Ⅳ组（人参+附子+干姜）获得理想的抗心衰作用效果，具有协同增效作用，总体趋势是Ⅳ组优于Ⅴ组（人参+附子）、Ⅵ组（附子+干姜）和Ⅶ组（人参+附子+干姜+甘草）。

[0098]

[0099] 5、本发明不同形式的组合物回阳救逆药效试验

[0100] 参照文献方法（李立纪等，附子和附片回阳救逆作用的比较研究，中药药理与临床，2005，21（6）：31-33），对本发明实施例不同形式的组合物回阳救逆药效作用进行试验，部分研究结果如下：

[0101] 5.1 抗寒冷实验

[0102] 小鼠100只雌雄各半，随机分成5组，连续给药5天，未次给药后1小时放入冰箱冷冻室中，-10℃半小时，观察其死亡只数，结果见表5，表明本发明不同形式的组合物具有相似的抗寒冷作用。

[0103] 表5 附子提取物对小鼠耐寒冷的影响

[0104]组 别 剂量(g生药/Kg) 试验鼠数(只) 死亡鼠数(只)存活率(%)
对照组 — 20 13 35
实施例1药物组 15 20 4 80
实施例2药物组 15 20 5 75
实施例3药物组 15 20 6 70
实施例4药物组 15 20 4 80