二萜类化合物及其基于抗肿瘤的应用

摘要

本发明公开了两种新的二萜类化合物及其基于抗肿瘤的应用。本发明提供了式（I）所示化合物或式（II）所示化合物。式（I）所示化合物命名为化合物Cyafrin D。式（II）所示化合物命名为化合物Cyafrin E。化合物Cyafrin D和化合物Cyafrin E对多种肿瘤细胞株均显示显著的杀伤作用，且可以有效抑制人结肠癌细胞HCT116及Bax蛋白缺失人结肠癌细胞bax-/-HCT116在裸鼠体内的生长。Bax蛋白对细胞凋亡起促进作用，其缺失或突变失活往往是肿瘤细胞产生耐药的原因之一。本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了先导化合物，对于肿瘤治疗具有重大的价值。

权利要求

1.式(I)所示化合物或式(II)所示化合物；

2.权利要求1中的式(I)所示化合物或式(II)所示化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用。

3.一种抑制肿瘤细胞增殖的产品，其活性成分为权利要求1中的式(I)所示化合物或式(I)所示化合物药学上可接受的盐。

4.一种抑制肿瘤细胞增殖的产品，其活性成分为权利要求1中的式(II)所示化合物或式(II)所示化合物药学上可接受的盐。

5.权利要求1中的式(I)所示化合物或式(II)所示化合物在制备治疗和/或预防肿瘤的产品中的应用。

6.一种治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为权利要求1中的式(I)所示化合物或式(I)所示化合物药学上可接受的盐。

7.一种治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为权利要求1中的式(II)所示化合物或式(II)所示化合物药学上可接受的盐。

8.权利要求1中所述式(I)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：发酵培养非洲黑蛋巢，得到式(I)所示化合物；所述非洲黑蛋巢为非洲黑蛋巢LH801；所述发酵为固体发酵；

所述固体发酵的条件为22-28℃暗室静置培养10-50天；所述固体发酵采用的培养基可由

1重量份基材、1-1.5重量份水和糖类组成；所述基材为小麦、燕麦、粳米、玉米、糯米、芡实、籼米和薏米中的至少一种；所述糖类可为葡萄糖；所述固体发酵采用的培养基为如下培养基甲、培养基乙和培养基丙；所述培养基甲由籼米和水组成，配比为80g籼米：100ml水；所述培养基乙由小麦和水组成，配比为80g小麦：90ml水；所述培养基丙由芡实、葡萄糖和水组成，配比为80g芡实：5g葡萄糖：90ml水；所述制备方法中还包括从完成所述固体发酵的发酵物中提取纯化式(I)所示化合物的步骤；所述提取纯化依次包括有机溶剂提取和色谱柱纯化的步骤；所述有机溶剂提取中，所述有机溶剂为乙酸乙酯；所述有机溶剂提取的步骤如下：取所述发酵物，用乙酸乙酯常温浸提，每隔8小时进行一次超声处理，每次超声处理的参数为50HZ，20min；所述色谱柱纯化包括硅胶开放柱色谱柱纯化和凝胶柱sephadex LH-20纯化；所述硅胶开放柱色谱柱纯化流动相为氯仿-丙酮；所述凝胶柱sephadex LH-20纯化流动相为氯仿-甲醇。

9.权利要求1中所述式(II)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：发酵培养非洲黑蛋巢，得到式(II)所示化合物；所述非洲黑蛋巢为非洲黑蛋巢LH801；所述发酵为固体发酵；所述固体发酵的条件为22-28℃暗室静置培养10-50天；所述固体发酵采用的培养基可由1重量份基材、1-1.5重量份水和糖类组成；所述基材为小麦、燕麦、粳米、玉米、糯米、芡实、籼米和薏米中的至少一种；所述糖类可为葡萄糖；所述固体发酵采用的培养基为如下培养基甲、培养基乙和培养基丙；所述培养基甲由籼米和水组成，配比为80g籼米：100ml水；所述培养基乙由小麦和水组成，配比为80g小麦：90ml水；所述培养基丙由芡实、葡萄糖和水组成，配比为80g芡实：5g葡萄糖：90ml水；所述制备方法中还包括从完成所述固体发酵的发酵物中提取纯化式(I)所示化合物的步骤；所述提取纯化依次包括用有机溶剂提取和用色谱柱纯化的步骤；所述有机溶剂提取中，所述有机溶剂为乙酸乙酯；所述有机溶剂提取的步骤如下：取所述发酵物，用乙酸乙酯常温浸提，每隔8小时进行一次超声处理，每次超声处理的参数为50HZ，20min。所述色谱柱纯化包括硅胶开放柱色谱柱纯化和ODS反向硅胶纯化；所述硅胶开放柱色谱柱纯化流动为氯仿-丙酮；所述ODS反向硅胶纯化流动相为甲醇-水。

说明书

二萜类化合物及其基于抗肿瘤的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及两种新的二萜类化合物及其基于抗肿瘤的应用，特别涉及从黑蛋巢菌中提取分离到的两种新的Cyathane类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

[0002] 肿瘤是严重危害的人类健康的疾病之一。肿瘤起因于生理失控的细胞增殖影响了人体的正常生理条件，从而产生了严重的病理反应，经常导致死亡。在目前众多的治疗方法中，化疗药物可以随血液循环到达全身各部，故而化学疗法（包括免疫疗法）在原发癌、继发转移癌和白血病的治疗中发挥着不可代替的作用。理想的化疗药物应具有作用靶点专一，体内特异性靶向肿瘤组织，作用机制明确，对正常组织毒副作用小等特点。大量Ⅰ类创新药物（单体化合物药物）的研制实践证明：化合物的结构决定其药理作用，新的化学结构很可能具有更强的生物活性、更低的毒副作用、更适用于临床使用。因此，肿瘤研究中的一个重要方向就是寻找能专一阻断或杀死肿瘤细胞而不影响正常细胞增殖的方法，简而言之就是寻找新的抗肿瘤药物。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供二萜类化合物及其基于抗肿瘤的应用。

[0004] 本发明提供了式（I）所示化合物或式（II）所示化合物；

[0005]

[0006] 式（I）所示化合物命名为化合物Cyafrin D。

[0007] 式（II）所示化合物命名为化合物Cyafrin E。

[0008] 本发明还提供了式（I）所示化合物或式（II）所示化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用。所述肿瘤细胞可为乳腺癌细胞、子宫颈癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、人白血病细胞、人前列腺癌细胞、人肺癌细胞或人胃癌细胞。所述肿瘤细胞具体可为MCF7细胞、HeLa细胞、HCT116细胞、SW480细胞、HepG2细胞、K562细胞、PC3细胞、A549细胞或SGC-7901细胞。

[0009] 本发明还保护一种抑制肿瘤细胞增殖的产品，其活性成分为式（I）所示化合物或式（I）所示化合物药学上可接受的盐、酯或溶剂物。所述肿瘤细胞可为乳腺癌细胞、子宫颈癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、白血病细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞或胃癌细胞。所述肿瘤细胞具体可为MCF7细胞、HeLa细胞、HCT116细胞、SW480细胞、HepG2细胞、K562细胞、PC3细胞、A549细胞或SGC-7901细胞。

[0010] 本发明还保护一种抑制肿瘤细胞增殖的产品，其活性成分为式（II）所示化合物或式（II）所示化合物药学上可接受的盐、酯或溶剂物。所述肿瘤细胞可为乳腺癌细胞、子宫颈癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、白血病细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞或胃癌细胞。所述肿瘤细胞具体可为MCF7细胞、HeLa细胞、HCT116细胞、SW480细胞、HepG2细胞、K562细胞、PC3细胞、A549细胞或SGC-7901细胞。

[0011] 本发明还保护式（I）所示化合物或式（II）所示化合物在制备制备治疗和/或预防肿瘤的产品中的应用。所述肿瘤可为乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、肝癌、白血病、前列腺癌、肺癌或胃癌。所述肿瘤具体可为MCF7细胞、HeLa细胞、HCT116细胞、SW480细胞、HepG2细胞、K562细胞、PC3细胞、A549细胞或SGC-7901细胞引起的肿瘤。

[0012] 本发明还保护一种治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为式（I）所示化合物或式（I）所示化合物药学上可接受的盐、酯或溶剂物。所述肿瘤可为乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、肝癌、白血病、前列腺癌、肺癌或胃癌。所述肿瘤具体可为MCF7细胞、HeLa细胞、HCT116细胞、SW480细胞、HepG2细胞、K562细胞、PC3细胞、A549细胞或SGC-7901细胞引起的肿瘤。

[0013] 本发明还保护一种治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为式（II）所示化合物或式（II）所示化合物药学上可接受的盐、酯或溶剂物。所述肿瘤可为乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、肝癌、白血病、前列腺癌、肺癌或胃癌。所述肿瘤具体可为MCF7细胞、HeLa细胞、HCT116细胞、SW480细胞、HepG2细胞、K562细胞、PC3细胞、A549细胞或SGC-7901细胞引起的肿瘤。

[0014] 本发明还保护式（I）所示化合物的制备方法，包括如下步骤：发酵培养非洲黑蛋巢，得到式（I）所示化合物。所述非洲黑蛋巢具体可为非洲黑蛋巢LH801。所述发酵具体可为固体发酵。所述固体发酵的条件具体可为22-28℃（如25℃）暗室静置培养10-50天（如38天）。所述固体发酵采用的培养基（简称固体发酵培养基）可由1重量份基材和1-1.5重量份水组成。所述固体发酵采用的培养基可由1重量份基材、1-1.5重量份水和糖类组成。
所述基材为小麦、燕麦、粳米、玉米、糯米、芡实、籼米和薏米中的至少一种。所述糖类可为葡萄糖。所述固体发酵采用的培养基具体可为如下培养基甲、培养基乙和培养基丙。所述培养基甲由籼米和水组成，配比为80g籼米：100ml水。所述培养基乙由小麦和水组成，配比为80g小麦：90ml水。所述培养基丙由芡实、葡萄糖和水组成，配比为80g芡实：5g葡萄糖：90ml水。所述制备方法中还包括从完成所述固体发酵的发酵物中提取纯化式（I）所示化合物的步骤。所述提取纯化依次包括有机溶剂提取和色谱柱纯化的步骤。所述有机溶剂提取中，所述有机溶剂具体可为乙酸乙酯。所述有机溶剂提取的步骤具体如下：取所述发酵物，用乙酸乙酯常温浸提（可每隔8小时进行一次超声处理，每次超声处理的参数具体可为“50HZ，20min”)。所述色谱柱纯化可包括硅胶开放柱色谱柱纯化（流动相具体可为氯仿-丙酮）和凝胶柱sephadex LH-20纯化（流动相具体可为氯仿-甲醇）。

[0015] 本发明还保护式（II）所示化合物的制备方法，包括如下步骤：发酵培养非洲黑蛋巢，得到式（II）所示化合物。所述非洲黑蛋巢具体可为非洲黑蛋巢LH801。所述发酵具体可为固体发酵。所述固体发酵的条件具体可为22-28℃（如25℃）暗室静置培养10-50天（如38天）。所述固体发酵采用的培养基（简称固体发酵培养基）可由1重量份基材和1-1.5重量份水组成。所述固体发酵采用的培养基可由1重量份基材、1-1.5重量份水和糖类组成。所述基材为小麦、燕麦、粳米、玉米、糯米、芡实、籼米和薏米中的至少一种。所述糖类可为葡萄糖。所述固体发酵采用的培养基具体可为如下培养基甲、培养基乙和培养基丙。所述培养基甲由籼米和水组成，配比为80g籼米：100ml水。所述培养基乙由小麦和水组成，配比为80g小麦：90ml水。所述培养基丙由芡实、葡萄糖和水组成，配比为80g芡实：5g葡萄糖：90ml水。所述制备方法中还包括从完成所述固体发酵的发酵物中提取纯化式（I）所示化合物的步骤。所述提取纯化依次包括用有机溶剂提取和用色谱柱纯化的步骤。所述有机溶剂提取中，所述有机溶剂具体可为乙酸乙酯。所述有机溶剂提取的步骤具体如下：取所述发酵物，用乙酸乙酯常温浸提（可每隔8小时进行一次超声处理，每次超声处理的参数具体可为“50HZ，20min”)。所述色谱柱纯化可包括硅胶开放柱色谱柱纯化（流动相具体可为氯仿-丙酮）和ODS反向硅胶纯化（流动相具体可为甲醇-水）。

[0016] 非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）LH801已于2013年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC NO.8411。

[0017] 化合物Cyafrin D和化合物Cyafrin E对多种肿瘤细胞株均显示显著的杀伤作-/-用，且可以有效抑制人结肠癌细胞HCT116及Bax蛋白缺失人结肠癌细胞bax HCT116在裸鼠体内的生长。Bax蛋白对细胞凋亡起促进作用，其缺失或突变失活往往是肿瘤细胞产生耐药的原因之一。本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了先导化合物，对于肿瘤治疗具有重大的价值。

附图说明

[0018] 图1为化合物Cyafrin D的晶体结构。

[0019] 图2为化合物Cyafrin E与与[Rh2(OCOCF3)4]形成的复合物的CD差谱。

[0020] 图3为实施例2中的高效液相指纹图谱

[0021] 图4为实施例2中的发酵培养时间的追踪分析图。

[0022] 图5为实施例3中，实验第24天，裸鼠的照片。

[0023] 图6为实施例3中，实验第24天，裸鼠的体重见图6。

[0024] 图7为实施例3中，实验第24天，切取下来的肿瘤的照片见图7。

[0025] 图8为实施例3中，实验第10天、第12天、第14天、第16天、第18天、第20天、第22天和第24天的肿瘤体积。

[0026] 图9为实施例4中，实验第24天，裸鼠的照片。

[0027] 图10为实施例4中，实验第24天，裸鼠的体重见图6。

[0028] 图11为实施例4中，实验第24天，切取下来的肿瘤的照片见图7。

[0029] 图12为实施例4中，实验第10天、第12天、第14天、第16天、第18天、第20天、第22天和第24天的肿瘤体积。

具体实施方式

[0030] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0031] 实施例1、非洲黑蛋巢LH801的获得

[0032] 非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）LH801，分离自西藏林芝地区Cyathus africanus子实体。

[0033] 非洲黑蛋巢LH801的担子果为漏斗形，高5.5-8.0mm，口部宽（9.0-11.0）×（6.5-8.0）μm；包被无明显纵条纹；小包具单层皮层和膜，扁圆，（1.9-2.5）×（1.8-2.0）mm；担孢子卵形具有一小尖，（9.0-11.5）×（6.0-8.0）μm。

[0034] 非洲黑蛋巢LH801的18Sr DNA的序列如序列表中序列1所示。

[0035] 非洲黑蛋巢LH801已于2013年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC NO.8411。

[0036] 实施例2、化合物的制备

[0037] 一、非洲黑蛋巢菌的固体发酵

[0038] 1、菌株活化

[0039] 将非洲黑蛋巢LH801接种至PDA培养基平板，25℃避光培养7天（菌丝长满整个平板）。

[0040] PDA培养基(自然pH)：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂粉18g，用纯净水定容至1L。

[0041] 2、种子培养

[0042] 将步骤1中的菌丝体转接至液体PDB培养基，28℃、180rmp避光培养7天，得到种子培养液。

[0043] PDB培养基(自然pH)：土豆200g、葡萄糖20g，纯净水定容至1L。

[0044] 3、固体发酵培养

[0045] 取5ml步骤2得到的种子培养液，接种至固体发酵培养基（每个500ml三角瓶中装有一份固体发酵培养基，设置10个三角瓶，每份固体发酵培养基由80g籼米和100ml水组成），25℃暗室静置培养38天，得到发酵物（即由菌体、菌的代谢物、培养基及培养基被菌利用后产生的物质组成的整个培养体系）。

[0046] 二、化合物的制备

[0047] 1、取步骤一得到的发酵物，每个三角瓶中加入300毫升乙酸乙酯常温浸提7天(每隔8小时进行一次超声处理，每次超声处理的参数为“50HZ，20min”)，取上清液；剩余物再加入300毫升新的乙酸乙酯常温浸提7天(每隔8小时进行一次超声处理，每次超声处理的参数为“50HZ，20min”)，取上清液；剩余物加入300毫升新的乙酸乙酯常温浸提7天(每隔8小时进行一次超声处理，每次超声处理的参数为“50HZ，20min”)，取上清液；将三次浸提得到的上清液合并，然后减压蒸馏干燥，得13.6g浸膏（即乙酸乙酯提取物）。

[0048] 2、取步骤1得到的13.6g浸膏，用氯仿-甲醇（氯仿与甲醇的体积比为1：1）溶解，5000rpm离心5min，收集上清液，将上清液与13.6g柱层析硅胶（青岛海洋化工有限公司200-300目）混合，在50℃水浴锅中蒸干有机溶剂，然后添加至硅胶开放柱色谱柱（Φ4.5×80cm，已填充有150g柱层析硅胶，青岛海洋化工有限公司200-300目,柱层析硅胶），再采用氯仿-丙酮作为流动相进行梯度洗脱（梯度洗脱过程中，依次采用体积比为100:0、100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、8:2、7:3、6:4和0:1的氯仿-丙酮；每个梯度的洗脱体积为1500毫升），收集采用50:1的氯仿-丙酮作为流动相的前1000毫升洗脱液（溶液甲），收集采用20:1的氯仿-丙酮作为流动相的后500毫升洗脱液和采用10:1的氯仿-丙酮作为流动相的前500毫升洗脱液的混合液（溶液乙）。

[0049] 3、将溶液甲减压浓缩蒸干，得到干物质甲（0.82g）。

[0050] 4、取0.82g步骤3得到的干物质甲，用氯仿-甲醇（氯仿与甲醇的体积比为1：1）溶解，5000rpm离心5min，收集上清液，将上清液上样于凝胶柱sephadex LH-20（Φ2.5×120cm，sephadex LH-20，Merck公司），然后采用氯仿-甲醇（氯仿与甲醇的体积比为1：1）作为流动相进行洗脱，收集第120毫升至第180毫升的洗脱液（溶液丙）。

[0051] 5、将溶液丙减压浓缩蒸干，得到干物质丙（0.51g）。

[0052] 6、干物质丙为单一纯品化合物，将其命名为化合物Cyafrin D。

[0053] Cyafrin D为无色晶体，分子式正离子模式HR-ESI-MS显示m/z355.2240[M+Na]+（355.2244，计算值），确定其分子式为C21H32O3，计算其不饱和度（Ω）为6。

[0054] 化合物Cyafrin D的1H-NMR和13C-NMR谱图表明，其存在一个醛基，一个甲氧基和一个异丙基基团。结合HMBC图谱可以得出化合物Cyafrin D的平面结构。化合物Cyafrin D的核磁归属见表1，经SciFinder Scholar文献检索为新化合物。

[0055] 表1化合物Cyafrin D的核磁归属

[0056]

[0057] a1H NMR at500M Hz,13C NMR at125M Hz in CD3OD.

[0058] b参照文献Fitoterapia，2013,84,22-31.

[0059] *J为耦合常数，单位Hz。

[0060] 化合物Cyafrin D的相对构型是通过NOESY图谱中观察到的H-2与H-3和H-9的远程相关信号得以确定。H3-17分别与H-5、H-8β和H-1β有相关信号，H3-16分别与H-7α和H-14有相关信号，因此可推测出化合物的相对构型。通过用X单晶衍射技术（铜靶测试化合物）得到化合物Cyafrin D的晶体结构（见图1），不仅证实了其平面结构，也确定了其相对构型，并发现在11-OCH3与14-OH之间并未像化合物Cyathin E一样形成一个分子内H键。实验测定的Flack常数为-0.05(16)，根据晶体规则（Acta Cryst.,1983,A39:876-881），确定其绝对构型为5R、6R、9R、11R和14S。

[0061] 化合物Cyafrin D结构式如下：

[0062]

[0063] 7、将溶液乙减压浓缩蒸干，得到干物质乙（1.51g）。

[0064] 8、取1.51g步骤7得到的干物质乙，用氯仿-甲醇（氯仿与甲醇的体积比为1：1）溶解，5000rpm离心5min，收集上清液，将上清液与1.51g ODS反向硅胶（YMC*GEL，12nm，S-50um）混合，在50℃水浴锅中蒸干有机溶剂，然后添加至中低压色谱柱中（Φ3.5×50cm，已填充有80g反相ODS硅胶，YMC*GEL,12nm,S-50um），然后采用甲醇-水作为流动相进行梯度洗脱（梯度洗脱过程中，依次采用体积比为20:80、35:65、45:55、60:40、70:30、80:20、90:10和0:1的甲醇-水；每个梯度的洗脱体积为300毫升），收集采用70：30的甲醇-水作为流动相的后200ml洗脱液（溶液丁）。

[0065] 9、将溶液丁减压浓缩蒸干，得到干物质丁（78mg）。

[0066] 10、干物质丁为单一纯品化合物，将其命名为化合物Cyafrin E。

[0067] 化合物Cyafrin E为白色晶体，正离子模式HR-ESI-MS显示m/z355.2239[M+Na]+（355.2244，计算值），确定其分子式为C21H32O3，计算其不饱和度（Ω）为6。

[0068] 化合物Cyafrin E的1H-NMR和13C-NMR谱图表明，其存在一个醛基，一个甲氧基和一个异丙基基团。在HMBC图谱中，H3-16（δ1.10,3H,s）与C-5、C-6、C-7和C-14相关，H-21（δ3.25,3H,s）与C-13相关，H-13（δ4.53,dd,J=5.9&1.1Hz）与C-6、C-11、C-14和C-15相关，H-14与C-5、C-7、C-13、C-12和C-16相关，进而确定了化合物Cyafrin E的平面结构。化合物Cyafrin E的核磁归属见表2，经SciFinder Scholar文献检索为新化合物。

[0069] 表2化合物Cyafrin E的核磁归属

[0070]

[0071] a1H NMR at500M Hz,13C NMR at125M Hz in CD3OD.

[0072] b参照文献Biosci.Biotechnol.Biochem.,2004,68:1362-1365.

[0073] *J为耦合常数，单位Hz。

[0074] 化合物Cyafrin E的相对构型是通过NOESY来确定的。根据H-13与H-14耦合常数J=5.9Hz，推测他们可能为顺式结构。从NOESY谱图中也可发现，H-5分别与H3-17、H-13和H-10β有相关，H3-16与H-14和H-10α有相关，由此可以确定该化合物的相对构型，验证了前面的推测。另外根据H-13（δ4.53,dd,J=1.1&5.9Hz），而在已知化合物neosarcodonin O中均为一个单峰（δ4.62,s），也说明H-13与H-14之间为顺式结构。通过分析化合物14-OH与[Rh2(OCOCF3)4]形成络合物的CD特征也确定其绝对构型。当化合物中的羟基与[Rh2(OCOCF3)4]形成复合物时，其CD谱在E带处（约350nm）处显示Cotton效应，根据“bulkiness”规则，该Cotton效应的正负可以间接反映连接羟基的碳的绝对构型（Tetrahedron:Asymmetry,1999,10:1507-1520;Tetrahedron:Asymmetry,1990,1:221-236）。化合物Cyafrin E与[Rh2(OCOCF3)4]形成的复合物的CD谱图中（见图2；化合物本身的CD谱已被扣除），在350nm处显示了负Cotton效应，确定了14位的立体构型为14R，结合由NOESY数据确定的相对构型，从而确定了其绝对构型为5R、6R、9R、13R和14R。

[0075] 化合物Cyafrin E的结构式如下：

[0076]

[0077] 实施例2、采用不同的发酵参数制备化合物

[0078] 一、固体发酵方案一

[0079] 1、固体发酵

[0080] 同实施例1的步骤一。

[0081] 2、发酵物的检测

[0082] 取步骤1得到的发酵物，用乙酸乙酯常温超声、浸提21天（每7天更换新的乙酸乙酯；每隔8小时进行一次超声处理，每次超声处理的参数为“50HZ，20min”)，将三次浸提得到的上清液合并，然后减压蒸馏干燥，得浸膏；用甲醇溶解浸膏，得到10mg/mL的溶液，进行高效液相色谱检测。

[0083] 高校液相化学指纹图谱分析条件如下：使用安捷伦Agilent1200高效液相色谱仪，四元梯度泵，DAD检测器，Agilent色谱工作站；色谱柱为Agilent C18分析柱（4.6mm×150mm，5μm）；洗脱程序见表3，流速为1.00mL/min；紫外检测波长220nm。

[0084] 表3洗脱程序（线性梯度洗脱）

[0085]

[0086]

[0087] 高效液相色谱图见图3A。

[0088] 二、固体发酵方案二

[0089] 1、固体发酵

[0090] 采用如下固体发酵培养基：由80g小麦和90ml水组成。

[0091] 其它均同实施例1的步骤一。

[0092] 2、发酵物的检测

[0093] 同步骤一的2。

[0094] 高效液相色谱图见图3B。

[0095] 三、固体发酵方案三

[0096] 1、固体发酵

[0097] 采用如下固体发酵培养基：由80g芡实、5g葡萄糖和90ml水组成。

[0098] 其它均同实施例1的步骤一。

[0099] 2、发酵物的检测

[0100] 同步骤一的2。

[0101] 高效液相色谱图见图3C。

[0102] 四、发酵时间

[0103] 固体发酵同实施例1的步骤一。分别于发酵的不同时间取样，按照步骤一的2的方法检测发酵物。

[0104] 结果见图4。在发酵培养35-40天之间，化合物Cyafrin D和化合物Cyafrin E丰富度较好，产量最高。

[0105] 实施例3、化合物Cyafrin D和化合物Cyafrin E的抗肿瘤活性

[0106] 一、细胞实验

[0107] 分别检测化合物Cyafrin D和化合物Cyafrin E对各种肿瘤细胞的抑制率。肿瘤细胞为MCF7细胞（ATCC HTB-22；乳腺癌细胞）、HeLa细胞（ATCC CCL-2；子宫颈癌细胞）、HCT116细胞（ATCC CCL-247；结肠癌细胞）、SW480细胞（ATCC CCL-228；结肠癌细胞）、HepG2细胞（ATCC HB-8065；肝癌细胞）、K562细胞（ATCC CCL-243；人白血病细胞）、PC3细胞（ATCC CRL-1435；人前列腺癌细胞）、A549细胞（ATCC CCL-185；人肺癌细胞）或SGC-7901细胞（ATCC SGC-7901；人胃癌细胞）。HepG2细胞、K562细胞、PC3细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。MCF7细胞、HeLa细胞、HCT116细胞、SW480细胞、A549细胞和SGC-7901细胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养。各个细胞均在37℃、5%CO2培养箱中常规培养，隔天传代。

[0108] 1、取肿瘤细胞，用胰酶消化，制成1×105个细胞/的毫升单细胞悬液。

[0109] 2、将单细胞悬液接种于96孔板内（每孔200μL），24小时后加入化合物Cyafrin D（或化合物Cyafrin E）并使其在培养体系中的浓度范围为100μM至1.56μM（从100μM倍半稀释6个梯度），培养48小时；同时设置不加入化合物Cyafrin D（或化合物Cyafrin E）的空白对照组和加入各个浓度的5-FU（5-氟尿尿嘧）的阳性对照组。每种处理设置三个复孔。

[0110] 3、完成步骤2后，通过MTT法测定肿瘤细胞数目，计算抑制率(%)。

[0111] 抑制率(%)=（1-给药组OD值/空白对照组OD值）×100%。

[0112] IC50=[CL(IH-50)+CH(50-IL)]/(IH-IL）；CL：低浓度值；CH：高浓度值；IH：高浓度下的抑制率；IL：低浓度下的抑制率。

[0113] 化合物Cyafrin D或化合物Cyafrin E对各个肿瘤细胞的IC50值（单位为μM）见表3。化合物Cyafrin D或化合物Cyafrin E均显示了对肿瘤细胞较强的抑制能力。

[0114] 表3化合物Cyafrin D或化合物Cyafrin E对各个肿瘤细胞的IC50值（单位为μM）[0115]HepG2 K562 PC3 MCF7 HeLa HCT116 SW480 A549 SGC-7901
Cyafrin D 5.79 8.54 9.83 10.93 6.12 3.23 9.52 8.56 9.81
Cyafrin E 15.55 5.45 13.41 21.45 5.18 2.26 5.63 17.15 19.52
5-FU 14.23 6.82 26.54 35.21 20.2 12.3 23.1 18.91 21.64

[0116] 二、动物实验

[0117] HCT116细胞：Abcam公司生产，北京中原公司代理。

[0118] 4-5周龄SPF级BALB/c雌性裸鼠（20-24g，中国医学科学院北京动物研究所）606
只，试验第1天，每只裸鼠背部皮下接种HCT116细胞0.2ml（含有2×10个对数期细胞），试验第10天瘤块成形（直径达0.5-1.0cm），将裸鼠随机分成5组（每组12只），分别进行如下处理：

[0119] 第一组：分别于实验第11天、第13天、第15天、第17天、第19天、第21天和第23天腹腔各注射0.2ml化合物Cyafrin D溶液（即将化合物Cyafrin D溶于DMSO，再用PBS缓冲液稀释），每次腹腔注射给予化合物Cyafrin D的剂量为10mg/kg体重；

[0120] 第二组：分别于实验第11天、第13天、第15天、第17天、第19天、第21天和第23天腹腔各注射0.2ml化合物Cyafrin D溶液（即将化合物Cyafrin D溶于DMSO，再用PBS缓冲液稀释），每次腹腔注射给予化合物Cyafrin D的剂量为5mg/kg体重；

[0121] 第三组：分别于实验第11天、第13天、第15天、第17天、第19天、第21天和第23天腹腔各注射0.2ml化合物Cyafrin E溶液（即将化合物Cyafrin E溶于DMSO，再用PBS缓冲液稀释），每次腹腔注射给予化合物Cyafrin E的剂量为10mg/kg体重；

[0122] 第四组：分别于实验第11天、第13天、第15天、第17天、第19天、第21天和第23天腹腔各注射0.2ml化合物Cyafrin E溶液（即将化合物Cyafrin E溶于DMSO，再用PBS缓冲液稀释），每次腹腔注射给予化合物Cyafrin E的剂量为5mg/kg体重；

[0123] 第五组（对照组）：分别于实验第11天、第13天、第15天、第17天、第19天、第21天和第23天腹腔各注射0.2ml PBS缓冲液。

[0124] 分别于实验第10天、第12天、第14天、第16天、第18天、第20天、第22天和第24天测量瘤体体积和裸鼠体重。实验第24天，处死小鼠，计算肿瘤体积抑制率（IR）。

[0125]

[0126] V为肿瘤体积，a为肿瘤长径（mm），b为肿瘤短径（mm）。

[0127]

[0128] C为对照组肿瘤平均体积，T为给药组肿瘤平均体积。

[0129] 统计分析，采用t检验处理，P<0.05认为有显著性差异。

[0130] 实验第24天，裸鼠的照片见图5，裸鼠的体重见图6，切取下来的肿瘤的照片见图7。实验第10天、第12天、第14天、第16天、第18天、第20天、第22天和第24天的肿瘤体积见图8。实验第24天的平均瘤体积，IR结果见表4。化合物Cyafrin D和化合物Cyafrin E均对人结肠癌裸鼠移植瘤有明显的抑制作用。用药小鼠和对照小鼠体重没有明显差异，未见小鼠外观、活动状态等方面的异样。

[0131] 表4实验第24天的平均瘤体积，IR结果

[0132]

[0133]

[0134] 三、动物实验

[0135] bax-/-HCT116细 胞：参 考 文 献：A natural compound elevates expression of the Bim that interacts with Bcl-2converting anti-apoptotic protein to a -/-pro-apoptotic Bax-like molecule（JBC,2012，vol.287no.21054-1065。用bax HCT116细胞代替HCT116细胞，其它同步骤二。

[0136] 实验第24天，裸鼠的照片见图9，裸鼠的体重见图10，切取下来的肿瘤的照片见图11。实验第10天、第12天、第14天、第16天、第18天、第20天、第22天和第24天的肿瘤体积见图12。实验第24天的平均瘤体积，IR结果见表5。化合物Cyafrin D和化合物Cyafrin E均对Bax蛋白缺失的人结肠癌裸鼠移植瘤有明显的抑制作用。用药小鼠和对照小鼠体重没有明显差异，未见小鼠外观、活动状态等方面的异样。

[0137] 表5实验第24天的平均瘤体积，IR结果

[0138]实验第24天的平均瘤体积(cm3) IR(%) P值
第五组 1.783216±0.132052 -
第二组 0.99462±0.1321582 44.22325 ＜0.01
第一组 0.56041±0.06563512 68.57307 ＜0.01
第四组 1.355462±0.11582 23.98778 ＜0.01
第三组 0.79041±0.06532635 55.67503 ＜0.01