一种枯草芽孢杆菌及其在畜禽养殖中的应用

摘要

本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌WL-04及其在畜禽养殖中的应用，其保藏编号为CCTCC NO:M2013343。本发明的枯草芽孢杆菌WL-04，对畜禽肠道条件性致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的生长具有显著的抑制作用，其中对大肠杆菌和产气荚膜梭菌抑菌率较高，达75%以上；产酶较稳定，α-淀粉酶活力平均为22U/mL；中性蛋白酶活力平均为170U/mL；促进肠道益生菌的繁殖；能耐受饲料制粒高温；耐受低pH胃液、高浓度胆盐的逆环境的影响，并能有效提高养殖动物的生产性能，促进免疫器官发育，可作为饲料添加剂广泛应用于畜禽饲料中。

权利要求

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌保藏编号为CCTCC NO:M

2013343。

2.一种微生物制剂，所述的微生物制剂包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

3.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的菌粉。

说明书

一种枯草芽孢杆菌及其在畜禽养殖中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物筛选及应用技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌WL-04菌株及其作为饲料添加剂的应用。

背景技术

[0002] 如今，规模化和集约化养殖发展迅速，随之出现了饲养密度过大、养殖舍环境通风不良等一些养殖环境质量下降的问题，由条件性致病细菌引起的各种畜禽消化道疾病对养殖的困扰也越来越突出，如大肠杆菌病、沙门氏菌病、产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎等。为达到防治疾病或促进动物生长的目的，大量抗生素被应用于畜禽生产的多个环节。抗生素的长期使用和滥用带来许多负面作用和严重后果，如畜禽免疫低下、细菌耐药性、药残超标等问题，特别是一些致病菌为人畜共患病类型，如若产生超强耐药性的超级细菌，将会带来严重的公共卫生安全问题。因此，养殖生产上少用或禁用抗生素已成了社会共识。

[0003] 经过多年的技术开发和积累，益生菌微生态制剂成为替代抗生素的首选。微生态制剂自身分泌多种物质，拮抗病原微生物的生长，调节动物免疫，无耐药性、无残留，深受人们欢迎。其中芽孢杆菌更是使用最为广泛的一种微生态制剂。

[0004] 但是，不同芽孢杆菌菌株的益生性能差异较大。目前，研究较多的是以单一性能为筛菌指标，比如单纯考察抑菌活性或产酶能力等，对菌株整体性能的考量报道较少。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌WL-04及其在畜禽养殖中的应用，该菌对畜禽肠道条件性致病菌大肠杆菌病、沙门氏菌病、产气荚膜梭菌有显著抑制作用，并对益生菌的繁殖有促进作用；该菌能产生多种酶类，芽孢形态能够耐受较高浓度的人工胃酸、胆盐和饲料制粒过程中的高温等不利环境，将其作为饲料添加剂应用于畜禽饲料中，能够有效地防范畜禽肠道疾病的爆发并能提高养殖动物的生产性能。

[0006] 本发明一方面提供了一株枯草芽孢杆菌WL-04（Bacillus subtilis WL-04），已于2013年7月16日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2013343。

[0007] 本发明的枯草芽孢杆菌WL-04在饲料添加剂领域的应用。

[0008] 本发明的另一个方面提供一种包含上述枯草芽孢杆菌的微生物制剂。

[0009] 上述的微生物制剂为枯草芽孢杆菌WL-04的菌粉，按质量百分比为0.1%-1%的比例添加至畜禽饲料中。

[0010] 本发明的枯草芽孢杆菌WL-04，对畜禽肠道条件性致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的生长具有显著的抑制作用，其中对大肠杆菌和产气荚膜梭菌抑菌率较高，达75%以上；产酶较稳定，α-淀粉酶活力平均为22U/mL；中性蛋白酶活力平均为170U/mL；促进肠道益生菌的繁殖；能耐受饲料制粒高温；耐受低pH胃液、高浓度胆盐的逆环境的影响，并能有效提高养殖动物的生产性能，促进免疫器官发育，可作为饲料添加剂广泛应用于畜禽饲料中。

具体实施方式

[0011] 本发明提供一株具有高效抑菌活性（能够有效抑制大肠杆菌病、沙门氏菌病、产气荚膜梭菌），稳定产淀粉酶和蛋白酶的芽孢杆菌，作为替代抗生素的饲用添加剂，可以在动物肠道中发挥作用，平衡肠道菌群，抑制肠道条件性致病菌的爆发，分泌多种酶类及维生素等，从而提高动物的生产性能，维护动物机体健康。

[0012] 下面结合实施例对本发明的菌株进行详细的描述。

[0013] 实施例1枯草芽孢杆菌WL-04分离与鉴定

[0014] 1、芽孢杆菌的分离筛选

[0015] 将在青岛市平度肉鸡养殖场采集的污泥，以1:10的比例加入无菌水中，振荡、混匀，制备成悬液，经80℃水浴处理10min，杀死大部分不耐热的菌株，初步获得耐热性好的芽孢杆菌。

[0016] 2、具有抑制病原菌及高产酶能力的芽孢杆菌筛选

[0017] 1）芽孢杆菌菌液制备：将分离的芽孢杆菌，分别接种于营养肉汤中，37℃，200rpm，振荡培养24h；

[0018] 2）体外抑菌实验—微量肉汤法：将培养24h的芽孢杆菌液离心、收集上清，取无菌96孔培养板，按1:1比例加入芽孢杆菌上清液及病原菌液（实验所用病原菌为大肠杆菌（ATCC25922）、沙门氏菌（ATCC14028）、产气荚膜梭菌（ATCC13124）），在37℃，200rpm条件下共同孵育6h，计算抑菌率，公式如下：

[0019]

[0020] A为对照组OD600，A0为0h数据；A2为6h数据；

[0021] B为芽孢杆菌上清处理组OD600，B0为0h数据；B2为6h数据；

[0022] 3）产酶能力测定：将培养24h的芽孢杆菌液离心、收集上清，进行α-淀粉酶活力的检测（GB/T24401-2009），及中性蛋白酶活力的检测（GB/T28715-2012）；

[0023] 4）结合抑制病原菌和产酶能力的情况分析，最终分离到一株芽孢杆菌作进一步考察。

[0024] 3、芽孢杆菌鉴定

[0025] 1）上述芽孢杆菌生理生化特征如表1所示：

[0026] 表1：分离的芽孢杆菌生理生化分析结果

[0027]

[0028] 2）利用试剂盒提取上述芽孢杆菌基因组DNA，利用PCR技术扩增16S rRNA序列，测序后获得长度为1406bp的片段。通过BLAST比对分析，该菌与枯草芽孢杆菌同源性最高，结合生理生化结果，鉴定该芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。将该菌命名为枯草芽孢杆菌WL-04（Bacillus subtilis WL-04），并于2013年7月16日，保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013343。

[0029] 实施例2：枯草芽孢杆菌WL-04抑制动物源病原菌分析

[0030] 1、指示病原菌培养：随机挑选分离自病鸡、猪肠道的病原菌，大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌，共5株（青岛农业大学预防兽医学实验室惠赠），其中大肠杆菌、沙门氏菌接种于营养肉汤，37℃，200rpm，培养15h；产气荚膜梭菌接种于疱肉培养基中，37℃，培养15h；

[0031] 2、制备枯草芽孢杆菌WL-04菌液：挑取单菌落，接种于营养肉汤中，37℃，200rpm，培养24h；

[0032] 3、体外抑菌实验—微量肉汤法：将培养24h的芽孢杆菌液离心、收集上清，取无菌96孔培养板，按1:1比例加入芽孢杆菌上清液及病原菌液，在37℃，200rpm条件下共同孵育
6h，计算抑菌率，公式如下：

[0033]

[0034] A为对照组OD600，A0为0h数据；A2为6h数据；

[0035] B为芽孢杆菌上清处理组OD600，B0为0h数据；B2为6h数据；

[0036] 枯草芽孢杆菌WL-04对4株动物源的大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌生长抑制情况如表2所示：

[0037] 表2：本发明分离的枯草芽孢杆菌WL-04抑菌实验结果

[0038]

[0039] +++表示抑菌率大于75%；++表示抑菌率为50-75%之间；

[0040] 由上表中体外抑菌实验结果可知，本发明的枯草芽孢杆菌WL-04显著抑制了分离自动物源的5株病原菌的生长，其中对2株大肠杆菌和1株产气荚膜梭菌抑菌率较高，达75%以上，表明枯草芽孢杆菌WL-04对动物源大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌有显著的抑制作用。

[0041] 实施例3：枯草芽孢杆菌WL-04产酶性能分析

[0042] 1、制备枯草芽孢杆菌WL-04菌液：挑取单菌落，接种于营养肉汤中，37℃，200rpm，培养24h；

[0043] 2、获得发酵上清液：将培养24h的芽孢杆菌液，在10000rpm，10min条件下离心，收集上清；

[0044] 3、产酶情况：进行α-淀粉酶活力的检测（GB/T24401-2009），及中性蛋白酶活力的检测（GB/T28715-2012），共进行3批测定，结果如表3所示；

[0045] 表3：枯草芽孢杆菌WL-04产酶分析

[0046]

[0047]

[0048] 经过三批重复实验，进行酶活测定分析，枯草芽孢杆菌WL-04产酶较稳定，α-淀粉酶活力平均为22U/mL；中性蛋白酶活力平均为170U/mL。饲料中大分子淀粉颗粒、蛋白质难以直接被动物吸收和利用，而α-淀粉酶及中性蛋白酶能有效地将这些大分子分解为易吸收的小分子营养物质。本发明的枯草芽孢杆菌WL-04能稳定地分泌高酶活的α-淀粉酶及中性蛋白酶，因此，有望将其开发为饲料添加剂，用于提高饲料中淀粉、蛋白质的利用率。

[0049] 实施例4：枯草芽孢杆菌WL-04抗逆性分析

[0050] 1、枯草芽孢杆菌WL-04菌液活菌量计数（对照组）：将菌液用无菌生理盐水十倍梯度稀释，选择适合的稀释度菌液，涂布于营养琼脂平板上培养，计数活菌；

[0051] 2、耐热性分析：取枯草芽孢杆菌WL-04菌液1mL加入到含99mL无菌水的三角瓶中，分别在水浴温度75℃、80℃、95℃处理10min后，共3个处理组，计数活菌；

[0052] 3、耐胃酸分析：取枯草芽孢杆菌WL-04菌液1mL分别加入到99mL不同pH的人工模拟胃液的三角瓶中，pH依次为1、2、3，共3个处理组，于37℃水浴处理2h，计数活菌；

[0053] 4、耐胆盐分析：取枯草芽孢杆菌WL-04菌液1mL加入到99mL不同胆盐浓度的人工模拟肠液的三角瓶中，胆盐浓度依次为0.3%、0.5%、1%，共3个处理组，于37℃水浴处理4h，计数活菌；

[0054] 表4：枯草芽孢杆菌WL-04耐热性能分析

[0055]

[0056] 由表4可知，枯草芽孢杆菌WL-04在不同的高温水浴处理中均能保持高的存活率，说明该菌对高温环境耐受性好。

[0057] 表5：枯草芽孢杆菌WL-04耐受胃酸、胆盐分析

[0058]

[0059] 由表5可知，经过不同pH的人工模拟胃液处理后，当pH≥3时，枯草芽孢杆菌WL-04存活率均为100.0%，当pH=2时，枯草芽孢杆菌WL-04存活率略有降低，为99.2%，成年养殖动物如猪、鸡的胃液pH范围约在2～4波动，实验表明枯草芽孢杆菌WL-04耐酸性能好。

[0060] 经不同胆盐浓度的人工模拟肠液的处理，随着胆盐浓度的增大，枯草芽孢杆菌WL-04存活率有一定下降，但是存活率均在95%以上，说明该菌具有很强的耐受胆盐的能力。

[0061] 在饲喂动物中，活菌制剂必须经历胃酸和肠道胆盐的屏障后才能发挥作用。本发明的枯草芽孢杆菌WL-04能够耐受酸和胆盐的逆环境，有助于其在饲料添加剂领域的广泛使用。

[0062] 实施例5：枯草芽孢杆菌WL-04对肉鸡生长性能及免疫器官发育的影响

[0063] 采购1日龄健康状况基本相同的罗氏308白羽肉公鸡，随机分为3组，包括1个对照组和2个实验组，每个处理组16个重复，每个重复8羽鸡，生产试验期为35天，其中对照组为饲喂普通商品日粮，实验组为饲喂不同添加量的枯草芽孢杆菌WL-04菌粉的普通商品日粮，菌粉添加量为0.1%（质量比），0.5%（质量比），测量1）试验过程中采食量、料重比、体重等变化情况；2）观察肉鸡免疫器官发育情况，实验结果如表6所示：

[0064] 表6：制成的菌粉饲喂肉鸡实验统计结果

[0065]

[0066] 由表6的肉鸡0-35天饲喂试验结果来看，以日增重和料肉比进行比较，添加枯草芽孢杆菌WL-04的实验组1和2均优于对照组，但两个实验组之间差异不显著，说明饲喂枯草芽孢杆菌WL-04能够促进肉鸡生长；而在免疫器官指数方面，实验组2最优，其次是实验组1，对照组最差，说明枯草芽孢杆菌添加量为0.5%比0.1%更有助于肉鸡免疫器官的发育生长。

[0067] 综合分析，饲喂中添加枯草芽孢杆菌WL-04后，很好的改善了肉鸡的生产性能，而且添加量0.1%即可有效提高肉鸡的生产效率，增加了饲养者的经济效益，当添加量达到0.5%时，对肉鸡的免疫器官发育促进作用更显著。

[0068] 实施例6：饲喂枯草芽孢杆菌WL-04对肉鸡肠道菌群变化的影响

[0069] 采购1日龄健康状况基本相同的罗氏308白羽肉公鸡，随机分为3组，包括1个对照组和2个实验组，每个处理组16个重复，每个重复8羽鸡，对照组为饲喂普通商品日粮，实验组为饲喂不同添加量的枯草芽孢杆菌WL-04菌粉的普通商品日粮，菌粉添加量为0.1%（质量比）、0.5%（质量比），1-7d为预饲期，试验时间为第14d、21d、28d，收集新鲜的鸡粪样品，测定其中微生物菌群变化情况，实验结果如表7所示：

[0070] 表7：枯草芽孢杆菌WL-04饲喂肉鸡试验的肠道菌群变化

[0071]