利用秀丽隐杆线虫培养木霉厚垣孢子的方法及应用转让专利
申请号 : CN201310377872.5
文献号 : CN103555648B
文献日 : 2015-06-17
发明人 : 王贻莲 , 亚平 , 李纪顺 , 杨合同 , 扈进冬 , 李红梅 , 郭凯 , 陈穗云 , 孙文向 , 许银连 , 尹忠仁
申请人 : 云南省烟草公司临沧市公司 , 山东省科学院中日友好生物技术研究中心 , 昆明保腾生化技术有限公司
摘要 :
本发明属于生物技术领域，涉及利用秀丽隐杆线虫培养木霉厚垣孢子的方法及应用。本制剂（10%T11-W厚垣孢子颗粒剂）在施加有效孢子量为2×107时，防效达85.96%，高于10%T11-W分生孢子颗粒剂的防效（73.32%）。在施加有效孢子量为2×106时，本制剂的防效为68.96%，明显高于T11-W分生孢子颗粒剂的47.15%，且两者差异显著。表明T11-W厚垣孢子颗粒剂对根结线虫的防治效果明显优于其分生孢子颗粒剂。
权利要求 :
1.利用秀丽隐杆线虫培养木霉厚垣孢子的方法，其特征在于将秀丽隐杆线虫成虫和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）T11-W分生孢子共同加到0.8%琼脂培养基上，于20～
25℃的环境，黑暗静止培养8～10天，即可收集厚垣孢子；秀丽隐杆线虫成虫和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）T11-W分生孢子的用量比例为线虫800～1000条∶分生孢子6
1×10cfu；
所述秀丽隐杆线虫成虫的培养方法包括怀卵成虫的培养，其中包括E. coli OP50 的培养及菌体收集、线虫的平板培养、线虫的摇瓶大量培养；大量卵的制备；成虫的培养及收集各步骤；其中：所说的E. coli OP50 的培养采用的培养基为固体LB培养基和液体LB培养基；
所说的线虫的平板培养采用的培养基为含有E. coli OP50的改良NGM培养基，其配方为：氯化钠3g，蛋白胨2.0 g，色氨酸0.2g，胆固醇0.005g，氯化钙0.11g，七水硫酸镁
0.25g，磷酸氢二钾0.76g，磷酸二氢钾2.96g，琼脂20g，水1000mL；
添加色氨酸0.2g对秀丽隐杆线虫的生长发育有促进作用；
所说的线虫的摇瓶大量培养采用的培养基为含有E. coli OP50的改良液体NGM培养基，其配方为：氯化钠3g，蛋白胨2.0 g，色氨酸0.2g，胆固醇0.005g，氯化钙0.11g，七水硫酸镁0.25g，磷酸氢二钾0.76g，磷酸二氢钾2.96g，水1000mL；
所说的大量卵的制备过程中，采用新鲜的改良Bleach溶液进行反复洗涤；
改良Bleach 溶液的配方为：6%NaClO 20 ml，NaOH 1g，低温蛋白酶0.2g，水定容至100 ml；
所说的成虫的培养采用的培养基为含有E. coli OP50的改良液体NGM ，其配方为：氯化钠3g，蛋白胨2.0g，色氨酸0.2g，胆固醇0.005g，氯化钙0.11g，七水硫酸镁0.25g，磷酸氢二钾0.76g，磷酸二氢钾2.96g，水1000mL；
所说的木霉菌T11-W分生孢子的培养方法为：将木霉菌株T11-W接种于PDA培养基上， 置于28℃下培养一周，将培养所得的分生孢子用无菌水洗下，并过滤，并将其稀释至目标浓6
度1×10 cfu/mL；
所说的木霉菌T11-W，分类命名为哈茨木霉，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，其保藏号为CGMCC NO.7938，保藏时间为2013年7月19日。
2.如权利要求1所述的方法培养的木霉厚垣孢子在防治土传的线虫病害方面的应用，其特征在于应用木霉厚垣孢子为有效成分配制防治土传的线虫病害的颗粒剂，具体组成如下：厚垣孢子 10重量份硅藻土 70重量份/
4，4－二羟基二苯甲酮 8重量份
糊精 10重量份。
说明书 :
利用秀丽隐杆线虫培养木霉厚垣孢子的方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及利用秀丽隐杆线虫培养木霉厚垣孢子的方法及应用。
背景技术
[0002] 木霉（Trichoderma spp）菌，广泛存在于土壤、植物残体、植物根围、植物叶片及种子、球茎表面及动物粪便上。该类真菌因能产生拮抗物质和寄生有害植物病原菌，而被人们广泛应用。（杨春平,张晋康，等。绿色木霉L24菌株分生孢子可湿性粉剂的研制[J]。西北农业学报，2010,19(9):43-47）。目前生产上常用的木霉菌剂多为它的分生抱子制剂，如美国的ToPshield(哈茨木霉T-22)、以色列Trichodex(哈茨木霉T39)及中国的根友(哈茨木霉LTR-2)等。
[0003] 木霉T11-W是从黄瓜根结线虫卵上分离所得，菌种保藏号CGMCC NO.7938，经鉴定是哈茨木霉。该菌是一种具有应用潜力的线虫生防真菌，不但能够寄生根结线虫（Meloidogyne spp.）卵和雌成虫，还能寄生秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）成虫，并能在其虫体上产生大量厚垣孢子。厚垣孢子是木霉抵抗逆境条件而产生的，人工发酵培养要求条件苛刻且产孢量低，因而国内外对其研究应用少。但厚垣抱子具有耐干燥、耐低温、对土壤抑菌作用不敏感等特点，因此，研究利用秀丽隐杆线虫生产木霉厚垣孢子方法，对研制以木霉厚垣孢子为主体的生防制剂具有重要意义。
[0004] 秀丽隐杆线虫，是一种模式线虫。它生活在世界各地的泥土中，以细菌为食，容易人工养殖，生长周期短，从卵到成虫只需三天半（刘恩岐，仓林让。模型动物—秀丽隐杆线虫研究进展[J].动物科学与动物医学，2003，20（10）：23－25），故能迅速大量繁殖，供T11-W作培养基生产厚垣孢子。
发明内容
[0005] 1.利用秀丽隐杆线虫培养T11-W厚垣孢子
[0006] 本发明提供一种对根结线虫卵和秀丽隐杆线虫成虫有高效寄生率的菌株T11-W，分类命名为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）T11-W，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏，其保藏号为CGMCC NO.7938，保藏时间为2013年7月19日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0007] 本发明并提供一种利用秀丽隐杆线虫培养木霉T11-W厚垣孢子的方法。将秀丽隐杆线虫成虫和木霉菌T11-W分生孢子共同加到0.8%琼脂培养基上，于20～25℃的环境，黑暗静止培养8～10天，即可收集厚垣孢子。
[0008] 2.T11-W厚垣孢子制剂研究与应用
[0009] 本发明生产的T11-W厚垣孢子在农业上的应用是防治土传的线虫病害，这决定了该菌剂的施药方式为浇施、撒施或穴施。综合考虑多方面因素选择以T11-W厚垣孢子粉为有效成分配制一种颗粒剂，组分如下：
[0010]
[0011] 将上述组分置适宜的容器内混合均匀，加入适量蒸馏水，并用醋酸和/氨水调节pH为6，制成“手捏成团，压之即散”的软材，再以挤压方式通过l4～22目筛网（板），制成均匀的颗粒。
[0012] 上述组分中硅藻土为吸附剂,4，4′-二羟基二苯甲酮为稳定剂，糊精为粘合剂，醋酸和氨水为PH调节剂，蒸馏水为润湿剂。
[0013] 上述颗粒剂的应用效果如下：
[0014] 对番茄根结线虫的防治（温室盆栽）
[0015] 表1本制剂对番茄根结线虫的防治效果
[0016]7
[0017] 由表1可知，本制剂（10%T11-W厚垣孢子颗粒剂）在施加有效孢子量为2×10时，防效达85.96%，高于10%T11-W分生孢子颗粒剂的防效（73.32%）。在施加有效孢子量为6
2×10时，本制剂的防效为68.96%，明显高于T11-W分生孢子颗粒剂的47.15%，且两者差异显著。表明T11-W厚垣孢子颗粒剂对根结线虫的防治效果明显优于其分生孢子颗粒剂。
2×10时，本制剂的防效为68.96%，明显高于T11-W分生孢子颗粒剂的47.15%，且两者差异显著。表明T11-W厚垣孢子颗粒剂对根结线虫的防治效果明显优于其分生孢子颗粒剂。
附图说明
[0018] 图1为T11-W寄生根结线虫卵
[0019] 图2为T11-W寄生秀丽隐杆线虫成虫
[0020] 图3为生产出T11-W厚垣孢子的秀丽隐杆线虫
具体实施方式
[0021] 以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明并不局限于此。
[0022] 实施例1利用秀丽隐杆线虫培养T11-W厚垣孢子
[0023] 1秀丽隐杆线虫的培养
[0024] 1.1怀卵成虫的培养
[0025] 1.1.1E.coli OP50的培养及菌体收集
[0026] 1.1.1.1划线接种E.coli OP50到LB（1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母提取物，0.8%琼脂）培养基上，37℃培养16h；
[0027] 1.1.1.2接种新鲜的单菌落到200ml液体LB（1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母提取物）500ml三角瓶中37℃，200rpm，培养16h；
[0028] 1.1.1.34℃下，5000rpm离心10min，弃上清，将菌体25倍体积浓缩，4℃保存备用。
[0029] 1.1.2秀丽隐杆线虫的平板培养
[0030] 1.1.2.1接种E.coli OP50的浓缩液0.5ml到改良NGM平板，晃动平板，分散菌液，在操作台中，吹干水分，37℃倒置培养过夜。
[0031] 1.1.2.2次日，接种0.1ml秀丽隐杆线虫的培养液到上述（1.1.2.1）平板，25℃培养4～5天。
[0032] 1.1.3秀丽隐杆线虫的摇瓶大量培养
[0033] 1.1.3.1用5～10ml无菌水，冲洗上述（1.1.2.2）平板上培养好的线虫，收集线虫；
[0034] 1.1.3.2接种1ml线虫的悬液到50ml改良的液体NGM，同时加入4ml E.coli OP50菌液（1.1.1.3）作为食物；
[0035] 1.1.3.323℃，200rpm，培养至培养液变清，一般为3天；
[0036] 1.1.3.4无菌条件下吸取一滴虫液，镜检怀卵成虫发育程度，当成虫体内的卵很多，且多数卵发育为二折或三折时，开始收怀卵成虫。
[0037] 1.2大量卵的制备
[0038] 1.2.1将培养好的怀卵成虫虫液置于冰上预冷10min后，过420目筛，用无菌水反复冲洗筛上的虫体。
[0039] 1.2.2将虫体洗入50ml灭菌离心管中（离心管在－20℃预冷至少10min），置于冰上预冷20min，或4℃离心，1200rpm，5min。
[0040] 1.2.3弃上清，沉淀中加10倍体积新鲜的改良bleach溶液，充分振荡5min，但不可过于强烈，否则线虫卵会受到破坏。4℃离心，2500rpm，2min。
[0041] 1.2.4弃上清，沉淀中加10倍体积新鲜的改良bleach溶液，充分振荡，裂解2min，然后，4℃离心2500rpm,3min。
[0042] 1.2.5弃上清，沉淀中加20ml左右的无菌水，旋涡震荡将卵漂起，清洗卵，4℃离心2500rpm,8min。
[0043] 1.2.6用适量无菌水漂起得到的卵沉淀（保证卵密度不能太高，否则孵化后的J1会因高密度而死亡），收集到灭菌的50ml三角瓶中，23℃孵化过夜（>12小时），孵化出的幼虫即为J1。
[0044] 1.3成虫的培养及收集
[0045] 将含有大约20万条J1的悬液，接种到50ml改良的液体NGM培养基中，同时加入5ml E.coli OP50菌液作为食物，23℃，200rpm培养3天后，过500目筛收集成虫，备用。
[0046] 注：培养温度越高，生长周期越短。
[0047] NGM培养基配方：氯化钠3g，Bacto peptone2.5g，胆固醇0.005g，氯化钙0.11g，水硫酸镁0.25g，磷酸氢二钾0.76g，磷酸二氢钾2.96g，琼脂20g，水1000mL
[0048] Bleach溶液：5%NaClO20ml，NaOH2g，水定容至100ml。
[0049] 改良NGM培养基配方：氯化钠3g，蛋白胨2.0，色氨酸0.2g，胆固醇0.005g，氯化钙0.11g，七水硫酸镁0.25g，磷酸氢二钾0.76g，磷酸二氢钾2.96g，琼脂20g，水1000mL。添加色氨酸0.2g对秀丽隐杆线虫的生长发育有促进作用。
[0050] 改良的液体NGM培养基配方：氯化钠3g，蛋白胨2.0，色氨酸0.2g，胆固醇0.005g，氯化钙0.11g，七水硫酸镁0.25g，磷酸氢二钾0.76g，磷酸二氢钾2.96g，水1000mL。
[0051] 改良Bleach溶液：6%NaClO20ml，NaOH1g，低温蛋白酶0.2g，水定容至100ml。添加低温蛋白酶，促怀卵成虫体壁降解，有利于卵的制备。
[0052] 2木霉菌T11-W分生孢子悬浮液的制备
[0053] 将木霉菌株T11-w接种于PDA培养基上，置于28℃下培养，至产生分生孢子后用无菌水洗下孢子，并经5层灭菌纱布过滤。用血球计数板在显微镜下计数悬浮液的孢子浓度，5 6 7
并将其稀释至目标浓度1×10，1×10，1×10cfu/mL，备用。
并将其稀释至目标浓度1×10，1×10，1×10cfu/mL，备用。
[0054] 3木霉菌T11-W厚垣孢子的培养
[0055] 将秀丽隐杆线虫成虫和木霉菌T11-W分生孢子先后加到0.8%琼脂培养基上，每个含0.8%琼脂培养基的培养皿（Φ=9cm）内分别加线虫200条，500条，800条，1000条；分别5 6 7
加分生孢子1×10，1×10，1×10cfu的。试验设5次重复。置于20～25℃静止培养8～
10天，收集厚垣孢子，计算产率（见表2）。
加分生孢子1×10，1×10，1×10cfu的。试验设5次重复。置于20～25℃静止培养8～
10天，收集厚垣孢子，计算产率（见表2）。
[0056] 表2利用秀丽隐杆线虫培养T11-W的厚垣孢子
[0057]
[0058] 厚垣孢子产率＝（产厚垣孢子量/接入分生孢子量）/接入线虫量×100%[0059] 由表2可知，以培养皿（Φ=9cm）为单位，初始线虫接入量和分生孢子接入量不同，厚垣孢子的产率不同。其中，线虫接入量为每皿800条，分生孢子接入量为1×106cfu时，厚垣孢子产率最高，达到102.00%；线虫接入量为每皿800条，分生孢子接入量为1×105cfu时，厚垣孢子产率为85.00%。；线虫接入量为每皿1000条，分生孢子接入量为1×106cfu时，厚垣孢子产率为88.60%。由此推断，以培养皿（Φ=9cm）为单位，接入线虫800～1000条，6
同时接入分生孢子1×10cfu，即可获得产率在88.00%以上的厚垣孢子，每皿至少可产厚垣
8
孢子8.15×10cfu。
同时接入分生孢子1×10cfu，即可获得产率在88.00%以上的厚垣孢子，每皿至少可产厚垣
8
孢子8.15×10cfu。
[0060] 实施例2T11-W厚垣孢子制剂研究与应用
[0061] 1.1T11-W厚垣孢子颗粒剂制备
[0062] 以硅藻土作为载体，配以粘结剂，稳定剂，PH调节剂，按最佳比例，利用挤出式造粒8
法制成T11-W厚垣孢子颗粒剂（2×10cfu/g）。
法制成T11-W厚垣孢子颗粒剂（2×10cfu/g）。
[0063] 1.2本制剂对番茄根结线虫的防治（结果见表1）
[0064] 供试线虫为南方根结线虫(Meloidogyne incongnita)
[0065] 供试作物为番茄（精选白果强丰）
[0066] 供试药剂为本制剂和10%T11-W分生孢子颗粒剂。
[0067] 采用拌土处理法。试验前去寿光稻田镇李营村蔬菜大棚取带线虫（经鉴定南方根结线虫为优势种）土样。将带线虫土与本制剂按重量比为1500：150，1500：15，1500：1.5的比例混匀，分装于18×15cm的花盆中备用。种子于30℃保湿催芽2d，在种子露白后种于处理好的花盆中，每盆种植30粒种子，覆膜保湿。置于温室工作台上，待出苗后，每天用喷雾器喷水1次，每2周浇Hoagland培养液1次，保持土壤肥力和湿度。设10%T11-W分生孢子颗粒剂（重量比1500：150）和空白对照，每处理水平设5次重复，观察各处理的生长情况。60d后，清洗番茄根，记录形成的根结数。
[0068] 按下述标准进行病情分级；按公式计算病情指数及相对防效。
[0069] 0级为根系完整，无根结。
[0070] 1级为有少量根结，根坏死少于25%。
[0071] 2级为根结数占根系数的26%～50%。
[0072] 3级为根结数占根系数的51%～75%。
[0073] 4级为根结特多且较大，占根系数的76%～100%。
[0074] 病级指数= ∑(各级植株数×该级数值)/(总株数×4)×100。
[0075] 防治效果(%)=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100[0076] 数据统计分析：统计分析用EXCEL2003和SPSS19.0软件进行，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法。