转化的秀丽隐杆线虫及使用该线虫筛选调节葡萄糖代谢的物质的方法

摘要

本发明涉及制备响应于葡萄糖显示荧光的转化的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans(C.elegans))的方法，及使用该转化的秀丽隐杆线虫筛选候选物质和新基因的方法，所述物质和新基因能够调节葡萄糖代谢和代谢性疾病。本发明制备转化的秀丽隐杆线虫以通过荧光显微镜可容易地观察葡萄糖的实时变化，因此可快速并准确地发现调节葡萄糖代谢的物质。因此，本发明预期对各种关于代谢的疑难杂症诸如肥胖、糖尿病等的研究做出较大贡献。

权利要求

1. 一种筛选调节糖代谢的基因的方法，该方法包括：将葡萄糖摄取至转化的秀丽隐杆线虫上的步骤，该转化的秀丽隐杆线虫的染色体上整合有在far-3基因上连接绿色荧光蛋白的far-3：：GFP DNA；

利用RNA干扰方法降低调节糖代谢的基因的表达的步骤；

以及观察转化的秀丽隐杆线虫的体内荧光强度变化的步骤，所述调节糖代谢的基因选自由gpi-1、pod-2、fasn-1以及H17B01.1组成的组。

说明书

转化的秀丽隐杆线虫及使用该线虫筛选调节葡萄糖代谢的

物质的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及响应于葡萄糖显示荧光的转化的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，缩写为C.elegans）的制备方法，及使用该秀丽隐杆线虫筛选候选物质和新基因的方法，所述物质和新基因能够调节葡萄糖代谢和代谢性疾病。

背景技术

[0002] 由于其基因容易调控及体积较小，秀丽隐杆线虫可以以相对低的成本在体外立刻大量生长。秀丽隐杆线虫适合于实验应用，因为其在卵孵化后只需要大约3天经过L1、L2、L3和L4四个阶段变成成虫。秀丽隐杆线虫结构简单，不包括生殖细胞，只有959个细胞，且为透明的。由于这些原因，很容易通过显微镜直接观察秀丽隐杆线虫的内部。

[0003] 此外，从胚胎到成虫的细胞系已被完全确定。由基因组计划已知，秀丽隐杆线虫的基因组是酵母基因组的3倍，人类基因组的1/3至1/5。秀丽隐杆线虫基因组40%相似于人类基因组，且具有迄今已知的5000个人类疾病基因的75%的基因。因此，其被广泛认为是研究人类疾病的良好模型系统。

[0004] 最近，由于关于代谢和代谢性疾病的兴趣强烈增加，使用秀丽隐杆线虫遗传学的代谢研究进展迅速。通过这些研究发现的许多基因也存在于哺乳动物中。例如，对于哺乳动物的代谢重要的基因的同源基因，诸如胰岛素信号传递途径的基因，mTOR信号传递途径的基因，及Tubby、SREBP、PPARγ、BAR（胆汁酸受体）的基因等，都存在于秀丽隐杆线虫中，且已积极研究其在整体代谢中的作用。

[0005] 糖是地球上几乎所有生物（包括人类）能量的重要来源。然而，含糖量很高的食物与肥胖、心脏病，尤其是导致血液中葡萄糖失调的II型糖尿病密切相关，因此导致严重的健康问题。

[0006] 在韩国，2003年糖尿病的死亡率为每10万人中25个，相比于1994年的每10万人中17个，近十年增加了47%。在美国，糖尿病的社会成本是巨大的，据估计在1997年约980亿美元。因此，为了减少糖尿病的社会经济成本，有关糖尿病的研究非常重要。然而，糖尿病的确切病因很难找到，因为糖尿病是由遗传和环境因素的复杂相互作用决定的。因此，为了确定糖尿病中起作用的基因的网络及寻找能调控糖代谢的物质，使用诸如秀丽隐杆线虫的简单动物模型是有效的。然而，迄今为止，还未有使用秀丽隐杆线虫筛选参与糖代谢及糖尿病的候选基因及候选药物的研究。

发明内容

[0007] 技术问题

[0008] 本发明涉及转化的秀丽隐杆线虫的制备方法，该转化的秀丽隐杆线虫体内糖的实时变化可使用秀丽隐杆线虫的特征，如低成本和高效率通过荧光来观察，以及使用该转化的秀丽隐杆线虫筛选能够调控糖代谢的候选基因和候选药物的方法。

[0009] 具体地，本发明通过证实参与糖代谢和脂代谢的基因被调控时，转化的秀丽隐杆线虫发生荧光变化，确定了转化的秀丽隐杆线虫作为体内糖报告分子的用途。

[0010] 技术方案

[0011] 根据本发明的一方面，提供了在体内响应糖显示荧光的转化的秀丽隐杆线虫，所述糖包括葡萄糖。

[0012] 在本发明的一实施方式中，转化的秀丽隐杆线虫具有far-3::GFP DNA，所述far-3::GFP DNA通过将绿色荧光蛋白(GFP)与糖摄取增加其表达的基因，即far-3连接而制备，far-3::GFP DNA整合到染色体上。

[0013] 根据本发明的另一方面，提供了一种制备转化的秀丽隐杆线虫的方法，所述方法包括通过紫外线辐射将far-3::GFP DNA整合到其染色体上。

[0014] 根据本发明的还另一方面，提供了一种使用转化的秀丽隐杆线虫筛选能够调控糖代谢的候选基因及候选药物的方法，所述转化的秀丽隐杆线虫在体内响应糖显示荧光。

[0015] 在本发明的一实施方式中，所述筛选方法包括转化的秀丽隐杆线虫一摄取糖就使用RNA干扰(RNAi)抑制调控糖代谢的基因的表达。

[0016] 有益效果

[0017] 制备转化的秀丽隐杆线虫以通过荧光显微镜容易地观察葡萄糖的实时变化，因此可快速并准确地发现糖代谢调节物质。此外，由于秀丽隐杆线虫的特征可以低成本地进行高效研究。因此，本发明预期对治疗各种关于代谢的疑难杂症诸如肥胖、糖尿病等的研究做出较大贡献。

附图说明

[0018] 图1为说明在制备转化的秀丽隐杆线虫过程中DNA整合的示意图；

[0019] 图2A示出了在含有2%的葡萄糖的培养基中生长的far-3::GFP转化的秀丽隐杆线虫比对照组显示出更强的荧光，图2B示出了荧光的定量结果；

[0020] 图3A示出了存在葡萄糖的情况下由gpi-1RNAi干扰糖酵解时，由葡萄糖增强的荧光相比于对照组可进一步加强，图3B示出了荧光的定量结果；

[0021] 图4A示出了存在葡萄糖的情况下由pod-2RNAi或fasn-1RNAi干扰脂肪酸合成时，由葡萄糖增强的荧光相比于对照组可进一步加强，图4B示出了荧光的定量结果；及[0022] 图5A示出了存在葡萄糖的情况下由RNAi抑制葡萄糖转运蛋白H17B01.1的预期表达时，由葡萄糖增强的荧光相比于对照组减弱，图5B示出了荧光的定量结果。

具体实施方式

[0023] 本发明提供了转化的秀丽隐杆线虫，其响应糖以显示荧光。

[0024] 本文中使用的术语“秀丽隐杆线虫（C.elegans）”是学名“秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）”的简称，其为以细菌为食生活于土壤中的线虫，在遗传学、分子生物学和细胞生物学实验中广泛使用。

[0025] 本文中使用的术语“转化”是指由外部环境注入的DNA引起的生物体遗传特征的改变。

[0026] 此外，本发明提供了制备转化的秀丽隐杆线虫的方法，其包括通过紫外辐射将far-3::GFP DNA整合到其染色体上。

[0027] 本文中使用的术语“绿色荧光蛋白(GFP)”是在细胞内表达的蛋白以显示强烈的绿色荧光，且广泛应用于检测基因表达的各种领域，尤其是，由于其便于观察。

[0028] 本文中使用的术语“转化的秀丽隐杆线虫”是糖报告分子荧光秀丽隐杆线虫，其通过整合far-3::GFP DNA制备，其中将GFP与糖摄取增加其表达的基因即far-3连接制备far-3::GFP DNA。

[0029] 此外，本发明提供了使用转化的秀丽隐杆线虫筛选用于调控糖代谢的候选基因及药物的方法，所述转化的秀丽隐杆线虫在体内响应糖以显示荧光。所述筛选方法使用RNAi。

[0030] 所述方法包括转化的秀丽隐杆线虫一摄取糖就使用RNAi抑制秀丽隐杆线虫的基因表达。在本发明的一实施方方式中，当脂代谢和糖代谢基因被抑制时，就观察到绿色荧光强度的重大变化，其示出使用转化的秀丽隐杆线虫可发现参与代谢调节的新基因（参见图3至5）。

[0031] 具体地，本发明人制备了far-3::GFP转化的秀丽隐杆线虫以显示荧光，far-3::GFP通过将GFP与糖摄取增加其表达的基因，即far-3连接而制备，且然后确定，如图1所示，当在含有2%葡萄糖的培养基中生长时，far-3::GFP转化的秀丽隐杆线虫相对于对照组显示出更亮的荧光（参见图2）。

[0032] 随后，发明人确定了存在葡萄糖的情况下，由gpi-1RNAi干扰糖酵解时，由葡萄糖增强的荧光相比于对照组可进一步加强（参见图3）。

[0033] 此外，发明人确定了存在葡萄糖的情况下，由pod-2RNAi或fasn-1RNAi干扰脂肪酸合成时，由葡萄糖增强的荧光相比于对照组可进一步加强（参见图4）。

[0034] 此外，发明人确定了存在葡萄糖的情况下，由RNAi抑制糖转运蛋白H17B01.1的预期表达时，由葡萄糖增强的荧光相比于对照组减弱（参见图5）。

[0035] 在下文中，为了帮助理解本发明，将提供优选实施例。然而，以下实施例仅提供于更容易地理解本发明，而不限制本发明的范围。

[0036] 实施例

[0037] 实施例1.转化的秀丽隐杆线虫的制备方法-DNA整合

[0038] 由于插入到秀丽隐杆线虫的far-3::GFP DNA是不包含在染色体中的类型，所以far-3::GFP DNA将不会传递到秀丽隐杆线虫的子代中。对于使用这种转化的秀丽隐杆线虫的实验，筛选转化的秀丽隐杆线虫很困难，并且far-3::GFP的表达并不统一。

[0039] 因此，为了获得稳定的转化的秀丽隐杆线虫，通过紫外线辐射改变DNA，引入外源far-3::GFP DNA并整合到染色体中。通过紫外线整合的DNA整合以很低的可能性进行，因此通过紫外线辐射获得大量秀丽隐杆线虫的成功率可能会增加。

[0040] 将从短体突变体（dpy-5）中获得的基因与far-3::GFP DNA插入到长体中，由此可以在光学显微镜下鉴定秀丽隐杆线虫的转化。在DNA整合过程中，用与上述相同的方式辨别转化的秀丽隐杆线虫。在DNA整合之前，作为传递far-3::GFP DNA到子代的频率的测量结果，可以证实DNA传递到大约50%的子代中，并且可以看出紫外线强度测定显示紫外线强2
度是300J/m 后，为大约50%的活性。

[0041] 为了DNA整合的实验成功，紫外线辐射后，需要超过600条转化的秀丽隐杆线虫，2
因此在L4阶段对200条转化的秀丽隐杆线虫施用300J/m 的紫外线辐射。6天后，紫外线处理的秀丽隐杆线虫的600条秀丽隐杆线虫(F1)子代转移到600个平板中以生产下一代。4天后，600条秀丽隐杆线虫(F2)生产的秀丽隐杆线虫子代中的每个板中的两条转移到1200个板中去生产子代。大约4天后，检查这1200个板。因为如果DNA整合成功，那么转化的秀丽隐杆线虫可以示出100%的转化，寻找含有100%正常体的秀丽隐杆线虫。通过从含有葡萄糖的培养基中观察荧光鉴定DNA的整合，从而确认100%正常体转化的秀丽隐杆线虫（参见图1）。

[0042] 实施例2.存在葡萄糖的情况下测定far-3::GFP转化的秀丽隐杆线虫的荧光[0043] 实施例1中制备的far-3::GFP转化的秀丽隐杆线虫在含有2%葡萄糖的培养基中生长，且通过以下方法测定荧光。

[0044] 具体地，将一滴2%的琼脂糖滴在载玻片上，并覆盖另一载玻片以使琼脂糖糖薄薄地扩散其中。琼脂糖硬化形成平板后移除载玻片，并将一滴浓度为50mM的NaN3滴到琼脂糖平板上，然后转移大约15条秀丽隐杆线虫在其上以麻醉。仔细将盖玻片覆盖，而无气泡，然后使用荧光显微镜通过拍摄图像观察far-3::GFP的荧光。使用Zeiss Axio Scope A1作为荧光显微镜。使用ImageJ软件对秀丽隐杆线虫整个身体显示的荧光定量分析，并通过三组独立实验分析超过20条秀丽隐杆线虫的荧光。

[0045] 如图2所示，可确定其荧光比对照组强，所述对照组即在没有葡萄糖的培养基中生长的far-3::GFP转化的秀丽隐杆线虫（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，双侧学生t检验）。

[0046] 实施例3.使用RNAi寻找糖代谢基因的方法

[0047] 本发明的发明人使用Julie Ahringer RNAi细菌文库去抑制特定基因的表达，并观察far-3::GFP的荧光。挑取（streak）从文库中获得的细菌，并转移到LB/氨苄霉素平板，在培养箱中，在37℃下培养12到16小时。选择在平板上生长的一个细菌菌落，转移到液体LB/氨苄霉素培养基中，并在振荡培养箱中，在37℃下培养12小时。12小时后，生长有细菌的100μl的LB/氨苄霉素培养基被分配到包括2%葡萄糖和氨苄霉素的NG培养基中，并且在37℃下培养细菌12到16小时。为了诱导反应，加入浓度为100mM的50μl的异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖吡喃苷(IPTG)到细菌中，在室温下反应一天，并且将两个成体far-3::GFP转化的秀丽隐杆线虫转移到平板中产卵，平板中生长有RNAi细菌。大约12小时后，移走成体far-3::GFP转化的秀丽隐杆线虫，三天后，当从卵生长成为成体的秀丽隐杆线虫时，使用荧光显微镜，通过荧光测定方法观察荧光的表达。

[0048] 实施例3-1.gpi-l RNAi的使用

[0049] 发明人观察到，当使用gpi-l RNAi干扰已知与糖酵解有关的gpi-1基因的表达时，转化的秀丽隐杆线虫中的荧光强度改变。

[0050] 当葡萄糖进入细胞中时，其被己糖激酶转化为葡萄糖-6-磷酸，然后被6-磷酸葡萄糖异构酶(gpi-l)转化为果糖-6-磷酸。gpi-l在糖酵解限速步骤中扮演重要角色，并因此能够通过抑制gpi-l表达，阻断糖酵解。

[0051] 如图3所示，可以看出，当gpi-1基因的表达被阻断时，与对照组相比，由葡萄糖引起的荧光进一步增加，也就是说，在葡萄糖的存在下，转化的秀丽隐杆线虫中gpi-1的表达不降低（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,双侧学生t检验）。

[0052] 实施例3-2.pod-2RNAi或fasn-1RNAi的使用

[0053] 本发明的发明人观察到，当使用pod-2RNAi或fasn-1RNAi干扰已知与脂肪酸合成相关的乙酰辅酶A羧化酶(pod-2)或脂肪酸合酶(fasn-1)的表达时，在转化的秀丽隐杆线虫中荧光强度改变。

[0054] pod-2是位于脂肪酸合成中最高阶段的酶，用于将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A。fasn-1参与pod-2的下一个步骤中使用乙酰辅酶A与丙二酰辅酶A的脂肪酸的合成。pod-2和fasn-1是调控脂肪酸合成初始步骤的主要的酶，可以通过干扰pod-2和fasn-1显著抑制脂肪酸的合成。

[0055] 如图4所示，可以看出，当pod-2或fasn-1基因的表达被干扰时，与对照相比，由葡萄糖引起的荧光强度增加，也就是，在葡萄糖的存在下，转化的秀丽隐杆线虫中pod-2或fasn-1基因的表达没有增加（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，双尾学生t检验）。

[0056] 实施例3-3.H17B01.1RANi的使用

[0057] 本发明人观察到，当使用H17B01.1RANi时，葡萄糖转运蛋白H17B01.1预期的表达被阻断，转化的秀丽隐杆线虫中的荧光强度改变。

[0058] H17B01.1预期是具有与人葡萄糖转运蛋白GLUI1最相似碱基序列的秀丽隐杆线虫的基因，负责转运葡萄糖到秀丽隐杆线虫的细胞中。

[0059] 如图5所示，可以看出，与对照组相比，当阻断H17B01.1的表达时，葡萄糖增加的荧光下降，也就是在葡萄糖的存在下，在转化的秀丽隐杆线虫中阻断了H17B01.1的表达（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，双尾学生t检验）。

[0060] 对于本领域技术人员显而易见的是，可以对上述本发明的典型实施方式作出各种改进，而不脱离本发明的精神或范围。因此，本发明旨在涵盖所有的在附属的权利要求书及其等价物的范围内所包括的所有的这些改进。

[0061] 工业实用性

[0062] 本发明的转化的秀丽隐杆线虫，使调控糖代谢的物质能够被快速并准确地发现，此外，据预计其将有助于治疗与代谢有关的疑难杂症，例如肥胖、糖尿病等。