稳定的生物控制水可分散颗粒

摘要

本发明提供了一种稳定的、水可分散颗粒生物控制组合物，该组合物包括至少一种非产毒素的曲霉属菌株，至少一种水溶性填充剂、以及至少一种阴离子表面活性剂。

权利要求

1.一种水可分散颗粒形式的生物控制组合物，该组合物包括：按重量计5％至75％的、至少一种非产毒素的黄曲霉菌株的孢子；

按重量计25％至95％的、至少一种水溶性糖；和按重量计0至35％的、至少一种阴离子表面活性剂，其中该水溶性糖包括无水乳糖形式的4-O-β-D-吡喃半乳糖-α-D吡喃葡萄糖。

2.如权利要求1所述的生物控制组合物，其中该阴离子表面活性剂选自N-油酰基N-甲基牛磺酸钠、烷基萘磺酸钠及其混合物。

3.如权利要求2所述的生物控制组合物，其中该阴离子表面活性剂包含按重量计2％至

10％的N-油酰基N-甲基牛磺酸钠。

4.如权利要求2所述的生物控制组合物，其中该阴离子表面活性剂包含按重量计0.5％至5％的烷基萘磺酸钠。

5.如权利要求1所述的生物控制组合物，进一步包括按重量计0.1％至3％的聚有机硅氧烷。

6.如权利要求1所述的生物控制组合物，其中该黄曲霉菌株选自一种生物学上纯的菌株，该生物学上纯的菌株具有选自以下各项的一种菌株的所有的鉴别特征：NRRL 21882、NRRL 30797和NRRL 18543，及其混合物。

7.一种用于减少农作物的黄曲霉毒素污染的方法，该方法包括向该植物、生长场所、或植物产品施用黄曲霉毒素减少有效量的、如权利要求1所述的生物控制组合物的一种水喷雾溶液。

8.如权利要求7所述的方法，其中该农作物选自下组，该组由以下各项组成：花生、玉米、棉花、以及树木坚果。

说明书

稳定的生物控制水可分散颗粒

发明领域

[0001] 本发明涉及水可分散颗粒性生物控制组合物，涉及它们的制备，并且涉及它们的用途。特别地，本发明涉及含有具有改善的生物稳定性的疏水孢子的水可分散颗粒组合物。

[0002] 背景

[0003] 黄曲霉毒素是在作物收获前和收获后以及在储藏期间，由生长在一些作物(特别是花生、玉米或谷物)上的曲霉属物种产生的毒素。黄曲霉毒素的生物合成涉及一个复杂的、以醋酸盐和丙二酸盐为起点的多乳酸化合物途径。一个重要的中间体是柄曲霉素和O-甲基柄曲霉素，它们是黄曲霉毒素的直接前体。黄曲霉毒素的重要生产者是黄曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉(Aspergillus nomius)、蚕素曲霉(Aspergillus bombycis)、假溜曲霉、赭曲霉、Aspergillus rambelli、Emericella astellata、Emericella venezuelensis、双极霉属物种(Bipolaris spp.)、毛壳菌属物种(Chaetomium spp.)、法氏壳属物种(Farrowia spp.)、和单链孢属物种(Monocillium spp.)的大多数菌株，特别是黄曲霉和寄生曲霉(Plant Breeding(《植物育种》)(1999)，118，pp 1-16)。还有已知的额外的曲霉属物种。黄曲霉毒素组由超过20种不同的毒素组成，特别是黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2、桔青霉素(CPA)。

[0004] 保护作物远离污染作物谷粒的黄曲霉毒素的污染是一个在农业、园艺以及其他植物栽培实践中经常反复发生的难题。为了协助解决此问题，人们已经发现，在农田里自然发生的某些分离的非产毒素的曲霉属菌株通过竞争性地排斥产毒素菌株已经被发现在预防黄曲霉毒素污染方面有效。

[0005] 对于某些农业的、园艺的、以及其他的相关应用来说，将生物控制品配制为使用颗粒撒播机来施用的、干燥的可涂抹的或撒播的颗粒通常是令人希望的，然而，对于其他的使用模式来说，这些原料被合适地配制为可湿性粉剂或者水可分散颗粒(WDG)，该可湿性粉剂或水可分散颗粒被设计为在大容量的水中混合，例如，罐混合物，并且最终作为在水中悬浮的叶用喷雾而施用。对于这两种方法而言，实现生物学稳定的产品递送的挑战可能是不同的。

[0006] 美国专利6,027,724提及多种组合物，这些组合物包括曲霉属非产毒素的菌株，这些菌株作为单一菌株培养在粒状食物源上，诸如，例如大米、黑麦等；或者合并入经挤压的食物基质中，诸如，例如小麦麸质-高岭土基质。

[0007] 美国专利申请公开20090060965提及一种水可分散颗粒配制品，该配制品包含非产毒素的曲霉属菌株；一种粘合剂；一种具有渗透保护剂和胶粘特性的药剂；一种载体剂，和一种营养源。WDG能在水中分散并且作为一种可喷射的分生孢子悬浮液来施用以预防食物中黄曲霉毒素的污染。

[0008] 存在着对发展水可分散颗粒配制品的持续需求，该配制品包含在加工和长时间储藏期间具有改善的稳定性的、非产毒素的曲霉属菌株。

[0009] 发明概述

[0010] 因此，本发明提供了一种稳定的水可分散颗粒生物控制组合物，该组合物包括至少一种非产毒素的曲霉属菌株、至少一种水溶性填充剂以及至少一种阴离子表面活性剂。

[0011] 本发明的另一个方面提供了一种制备水可分散颗粒的方法，该颗粒包含至少一种非产毒素的曲霉属菌株。适合于制备本发明的水可分散颗粒组合物的方法包括(1)流化床或盘中的水喷雾造粒设备(2)喷雾干燥(3)干燥压实以及(4)水润湿糊状物的挤出。在一个实施例中，水润湿的糊状物是通过以下步骤制备：混合除曲霉属孢子外的所有制粉所有惰性物质，掺混曲霉属孢子与经研磨的惰性物质，并且将该孢子-惰性物质与水混合以形成一种适合挤出成具有合适的直径和长度的颗粒的湿性糊状物给料。

[0012] 本发明进一步提供了一种水可分散颗粒，该水可分散颗粒包括至少一种由以上方法制造的非产毒素的曲霉属菌株。

[0013] 本发明还提供了一种用于减少农业作物植物的黄曲霉毒素污染的方法，该方法包括：将包含至少一种非产毒素曲霉属菌株的水可分散颗粒生物控制组合物分散在一种农业上可接受的含水载体中；并且将该含水分散物施用至植物、植物周围的土壤或植物生长的场所。

[0014] 发明详细说明

[0015] 正如上面指出的，某些曲霉属菌株的分离菌株诸如黄曲霉菌(A.flavus)、寄生曲霉菌(A.parasiticus)、米曲霉菌(A.oryzae)和酱油曲霉菌(A.sojae)产生少量或不产生黄曲霉毒素并且还具有高攻击性。例如，在农田里自然发生的某些分离的非产毒素黄曲霉菌株已经被发现在预防产毒素菌株的黄曲霉毒素污染方面有效。例如，参见在美国专利5171686、5294442、5292661、和6027724中描述的分离菌株，这些专利通过引用而完全地结合在此。当根据本发明将这些分离菌株配制为WDG时，这些分离菌株在减少有用植物作物中的黄曲霉毒素污染方面是有效的药剂。

[0016] 本发明针对一种稳定的水可分散颗粒(WDG)生物控制组合物，该组合物包括至少一种非产毒素曲霉属菌株，至少一种水溶性填充剂以及至少一种阴离子表面活性剂；针对用于其制造的方法；并且针对其在减少作物中黄曲霉毒素污染中的用途。更确切地说，本发明涉及一种WDG配制品，该配制品包括至少一种非产毒素曲霉属菌株，诸如，黄曲霉菌，和至少一种水溶性填充剂，诸如水溶性糖(例如，乳糖、蔗糖、葡萄糖、以及类似糖)。在一个实施例中，该水溶性糖是乳糖。

[0017] 本发明的生物控制WDG组合物进一步包括至少一种阴离子表面活性剂。任选地，一种消泡剂也可以存在。

[0018] 除了非产毒素的曲霉属菌株、水溶性填充剂、阴离子表面活性剂、以及任选的消泡剂外，该WDG组合物还可以包括稳定剂、增效剂、着色剂等。

[0019] 在一个实施例中，该至少一种非产毒素的黄曲霉菌株是选自：NRRL 21882、NRRL 30797、和NRRL 18543，及其混合物。适合的，该水溶性填充剂是选自：乳糖、无水乳糖形式的
4-O-β-D-半乳糖-α-D-葡萄糖、以及类似糖。在一个实施例中，该阴离子表面活性剂是选自：
N-油酰基N-甲基牛磺酸钠、烷基萘磺酸钠、萘磺酸钠、木质素磺酸钙、木质素磺酸钠、木质素磺酸铵及其混合物。在一个实施例中，该组合物还包含一种消泡剂，该消泡剂选自：甲基化的硅酮和聚有机硅氧烷。在一个实施例中，该阴离子表面活性剂是以该WDG生物控制组合物的按重量计从0至35％，更具体地按重量计0.5至15％的量存在于该组合物中。

[0020] 在另一个实施例中，提供了一种处于水可分散颗粒的形式的生物控制组合物，该组合物包括：

[0021] (A)按重量计1至75％、更具体地按重量计5至75％的、至少非产毒素曲霉属菌株的孢子；

[0022] (B)按重量计25％至95％、更具体地按重量计30％-60％的、水溶性糖如乳糖；

[0023] (C)按重量计0至25％、更具体地按重量计2％-10％的、N-油酰基N-甲基牛磺酸钠；

[0024] (D)按重量计0至10％、更具体地按重量计0.5％至5％的、烷基萘磺酸钠；以及[0025] (E)按重量计0至3％、更具体地按重量计0.1％至3％的、聚有机硅氧烷。

[0026] 不同的组分(A)-(E)的比例总和是不超过按重量计100％并且这些组分的精确浓度可以取决于例如水或者杂质的存在而变化。

[0027] 本发明的水可分散颗粒(易于在水中分散的颗粒)具有实质上与可湿性粉剂接近的组成成分。它们可以通过造粒来制备，或者通过一个润湿途径(将精细分离的孢子与惰性填充剂和少量的水(例如按重量计1％至30％)接触，或者与一种分散剂或粘合剂的含水溶液接触，然后通过干燥和过筛)，或者通过一个干燥途径(压缩然后通过研磨和过筛)。

[0028] 适合的颗粒几乎能为任何希望的形状，例如，球型、圆柱型、椭圆型、棒条型、锥形、磁盘型、针型以及不规则形状。在一个实施例中，这些颗粒是近似是圆柱型。典型的，这些颗粒具有的粒子尺寸为：

[0029] ·挤出的WDG约0.5mm至2.5mm

[0030] ·圆盘造粒的WDG约0.25mm至2.8mm

[0031] ·喷雾干燥的WDG约0.1mm至1.5mm。

[0032] 若有必要或合适时，可以使用此范围外的尺寸。

[0033] 在一个润湿途径造粒中，在该过程中的第一个步骤是该惰性物质的干混(不包括孢子)，接着研磨，并且然后将黄曲霉菌孢子与研磨过的惰性混合物掺混。然后，将该孢子/惰性物质掺合物缓慢混合，同时加入按重量计适量的水(例如，按重量计从25％至35％)，以获得一种润湿的糊状物或润湿的块状物(给料)。

[0034] 然后将该给料挤出并且干燥该挤出物，例如，在一个流化床干燥机上以除去多余的水分。在干燥过的颗粒中，目标含水量是1％至12％，更具体地小于10％，并且最具体地小于5％。将这些干燥过的颗粒过筛以除去细粉。

[0035] 在一个实施例中，本发明组合物中使用的非产毒素的曲霉属菌株的适合的比率和施用时间与对于含有此类菌株的产品的当前的产品标签所给定的既有比率和时间是相当的。例如， 品牌的黄曲霉菌NRRL 21882是一种可涂抹的颗粒，该颗粒含有0.0094％的、最小量为1.2x 108菌落数(CFU)/lb的活性成分，能够以从10-20lb/英亩的比例施用。在一个实施例中，本发明的WDG配制品悬浮在水中，并且是作为叶用喷雾以、20GPA的比例施用，其中每英亩的CFU与 相似。

[0036] 根据本发明的组合物适用于在有用植物作物中通过置换产生黄曲霉毒素的真菌来减少黄曲霉毒素。适合的有用植物作物包括：花生、玉米、棉花、和树木坚果。可以将本发明组合物中使用的组分以不同的浓度，以多种本领域的普通技术人员已知的方法施用。这些组合物的施用比率将取决于有待控制的具体的黄曲霉毒素的类型、所需要的控制程度以及施用的时间和方法。

[0037] 在一个实施例中，本发明的WDG是在水中稀释并且以从每公顷10至100g的活性成分(孢子)的比率施用，更具体地以从20至50g a.i./ha的比率施用。24和49g a.i./ha的施用比率是特别适合的。

[0038] 在另一个实施例中，当本发明的WDG用水稀释，并且施用到玉米以减少在该收获作物的谷粒中的黄曲霉毒素污染时，以或者V5、V10或者VT的施用量是适合的。

[0039] 作物应被理解为还包括已经通过常规的育种或通过基因工程的方法被赋予对除草剂或多种类别的除草剂(例如ALS-、GS-、EPSPS-、PPO-、ACC酶以及HPPD-抑制剂)耐受性的那些作物。通过基因工程方法而被赋予了对多种除草剂的耐受性的作物的实例包括草甘膦和草丁膦抗性玉米品种，这些玉米品种在 和 商标名下是可商购的。

[0040] 作物还应被理解为是已经通过基因工程方法被赋予对有害昆虫的抗性的那些，例如Bt玉米(抗欧洲玉米螟)、Bt棉花(抗棉花棉铃象甲)以及还有VIP棉花(抗伪粘虫和甜菜粘虫)。Bt玉米的实例是 的Bt 176玉米杂交体(先正达种子公司(Syngenta Seeds))。该Bt毒素是一种由苏芸金芽胞杆菌土壤细菌自然形成的蛋白质。毒素或能合成此类毒素的转基因植物的实例描述在EP-A-451878、EP-A-374753、WO 93/07278、WO 95/34656、WO 03/052073以及EP-A-427529中。包括一种或多种编码抗杀虫剂并且表达一种或多种毒素的基因的转基因作物的实例是： (玉米)、Yield (玉米)、
(棉花)、 (棉花)、Agrisure VipteraTM 3111(谷物)。其植物作物或种子材料均可以是抗除草剂的并且同时是抗昆虫摄食(“叠加的”转基因结果)。例如，种子可以具有表达杀昆虫的Cry3和/或VIP蛋白的能力，同时是耐草甘膦的。

[0041] 作物还应被理解为包括通过常规的育种或基因工程的方法获得并且包括所谓的输出型(output)性状(例如改进的储存能力、更高的营养价值以及改进的香味)的那些。

[0042] 实例

[0043] 以下实例进一步说明了本发明的一些方面，但无意限制其范围。若贯穿本说明书和权利要求书均未另行说明，则百分比是以重量计(％w/w)。

[0044] 实例1

[0045] 210g水可分散颗粒(50WG)的批次用下列组成成分制备：

[0046] 所用成分：黄曲霉菌分离菌株NRRL 21882的孢子50％；聚有机硅氧烷(Rhodorsil EP 6703)0.10％；烷基萘磺酸钠(Agnique ANS3DNPW)2％；N-油酰基N-甲基牛磺酸钠(Geropon T-77)8％；无水乳酸(余下的)

[0047] A.在该过程中的第一个步骤是：干混惰性物质(不包括孢子)，然后研磨。然后将研磨过惰性物质混合物在瓦林捣碎机(waring blender)中与黄曲霉菌孢子掺混。将由此获得的孢子/惰性物质掺合物装入Hobart搅拌器并且慢慢混合，同时加入按重量计约30％的水以获得润湿的块状物(给料)。

[0048] B.然后将该给料转移至一个加有一个0.8mm筛网的挤出机。将该挤出物在一个流化床干燥机上干燥以除去多余的水分，并且然后将这些颗粒转移至一个筛分设备以除去指定范围外的细粉，该指定范围为：直径0.8mm和长度2至5mm。

[0049] 实例2-5

[0050] 对于黄曲霉菌NRRL 21882每克菌落形成单位(CFU/g)a的列举的稀释液和平板接种的结果。

[0051]

[0052] a将大约0.1g的测试物的悬浮在9.9mL的磷酸盐缓冲液+0.2％Tween 80中，稀释10-5 -6(#7)或10 (所有其他的)，并且将0.1mL的这三种最大的稀释液散布在一式两份的DRBC琼脂盘上。在30℃孵育两天后进行菌落计数。

[0053] bCFU/g＝(来自一式两份的盘的数量之和/0.2mL)X稀释系数X 10mL悬浮液/子样本重量。计算这五个子样本的平均值，计为平均CFU/g。

[0054] c相对标准差＝(标准差/平均CFU/g)X 100％

[0055] 实例6

[0056] 500g水可分散颗粒(50WG)的批次用下列组成成分制备：

[0057] A.在该过程中的第一个步骤是：干混惰性物质(不包括孢子)，然后研磨。然后将研磨过惰性物质混合物在瓦林捣碎机中与黄曲霉菌孢子掺混。将由此获得的孢子/惰性物质掺合物装入Hobart搅拌器并且缓慢混合，同时加入按重量计约30％的水以获得润湿的块状物(给料)。

[0058] B.然后将给料转移至一个加有一个0.8mm筛网的挤出机。将该挤出物在一个流化床干燥机上干燥以除去多余的水分，并且然后将这些颗粒转移至一个筛分设备已除去指定范围外的细粉，该指定范围为：直径0.8mm和长度2至5mm。

[0059] 实例7–15

[0060] 对于黄曲霉菌NRRL 21882每克菌落形成单位(CFU/g)a的列举的稀释液和平板接种的额外的结果。