蛹虫草可结实性生产种源长久保藏方法

摘要

本发明适用于蛹虫草生产领域，提供了一种蛹虫草可结实性生产种源长久保藏方法。该方法将选育获得的蛹虫草可结实性优良母种种源作为初始种源，按常规方法培养液体菌种，待液体种源培养好后，在无菌条件下对液体菌种进行分装，然后保藏于-72℃至-86℃超级低温冰箱内。所保藏种源需要随机抽取3管，逐级解冻，解冻后以此为液体种源再扩繁一次液体生产种源，按常规方法栽培蛹虫草，如果栽培后蛹虫草生长正常，那么同批次保藏的液体种源就是有效的可以使用菌种，冷冻保藏的菌种可以长期保藏（目前最长保藏期为3年）。本发明从根本上解决了优良蛹虫草种源退化速度快，可结实性种源生产供应期短的技术问题，实现了同一批次种源一次检测，持久使用的目标。

权利要求

1.一种蛹虫草可结实性生产种源长久保藏方法，其特征在于，包括如下的步骤：

1)将选育获得的蛹虫草可结实性优良母种种源作为初始实验种源，种源形式为斜面固体母种；

2)将液体菌种培养基分装于250毫升锥型瓶或白色滴流瓶中，每瓶装培养基100毫升，2

封口后装入高压灭菌锅中，在1.05Kg/cm压强下灭菌60分钟，待冷却至25℃以下开始接种；

3)接种后的蛹虫草液体菌种在20℃±1℃温度下震荡培养，震荡频率120～130次/分钟，连续培养5～7天；选出菌球大小均匀、毛刺锐利、数量多、培养基液体清澈透明的液体菌种；

4)将步骤3)培养的液体菌种在无菌条件下分装到25毫升无菌带盖冷冻管中，每管10毫升，并进行编号，随机选出3管，其余全部同时保藏在-72℃至-86℃超级低温冰箱内；

5)将随机选出的3管液体菌种按常规方法进行试栽，试栽结果所选3管菌种都正常出草，则保藏在超级低温冰箱内的同一批次种源具有可结实性，可以作为生产性种源使用；

超级低温冰箱内液体菌种使用前逐级解冻，具体步骤为：先把液体菌种冷冻管转到温度为-24℃至-30℃冰柜中存放24小时，然后转到温度为-10℃至-16℃冰柜中存放24小时，最后放入冰水混合0℃环境中解冻至液体培养基全部溶化。

2.按照权利要求1所述的蛹虫草可结实性生产种源长久保藏方法，其特征在于，步骤

2)中液体菌种培养基配方为：葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁2克、维生素B110毫克、维生素B25毫克、水1000毫升，煮沸溶化配方中各成分物质。

3.按照权利要求1所述的蛹虫草可结实性生产种源长久保藏方法，其特征在于，取出液体菌种冷冻管按步骤2)和步骤3)生产液体菌种，培养好的液体菌种作为生产用液体菌种种源再扩繁一次。

说明书

蛹虫草可结实性生产种源长久保藏方法

技术领域

[0001] 本发明属于蛹虫草生产领域，尤其涉及一种蛹虫草可结实性生产种源长久保藏方法。

背景技术

[0002] 北虫草学名蛹虫草。它是虫草属中两个模式种之一，现已作为冬虫夏草的唯一替代品。北虫草主要成分有虫草素、虫草酸、虫草多糖、SOD酶等，具有防癌抗癌，补肾益肺和提高人体免疫能力之功效，是一种极具开发价值的食药兼用保健佳品。

[0003] 北虫草从1985年发现至今，经历了仿野生柞蚕蛹栽培和米饭培养基完全人工栽培两个阶段，近年来伴随大规模北虫草栽培技术日臻完善，也出现了一个不容忽视的瓶颈性技术问题，那就是蛹虫草菌种退化问题。

[0004] 为解决菌种退化问题，目前主要通过选育和保藏优良的蛹虫草可结实性种源来完成。选育是指通过组织分离技术或子囊孢子杂交技术获得出草率高、产量形状良好的可结实性蛹虫草种源；而保藏则是将选育的优良菌种如何科学保藏起来。根据我们多年实验，发现蛹虫草母种种源按常规保藏方法，如：低温斜面固体保藏法，虽然有一定延缓衰退作用，但保藏效果很不稳定，无法实现有效保藏。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种蛹虫草可结实性生产种源长久保藏方法，旨在解决优良蛹虫草种源退化速度快，可结实性种源生产供应期短的技术问题。

[0006] 本发明是这样实现的，一种蛹虫草可结实性生产种源长久保藏方法，，包括如下的步骤：

[0007] 1）将选育获得的蛹虫草可结实性优良母种种源作为初始实验种源，种源形式为斜面固体母种；

[0008] 2）将液体菌种培养基分装于250毫升锥型瓶或白色滴流瓶中，每瓶装培养基1002
毫升，封口后装入高压灭菌锅中，在1.05Kg/cm压强下灭菌60分钟，待冷却至25℃以下开始接种；

[0009] 3）接种后的蛹虫草液体菌种在20℃±1℃温度下震荡培养，震荡频率120～130次/分钟，连续培养5～7天；选出菌球大小均匀、毛刺锐利、数量多、培养基液体清澈透明的液体菌种；

[0010] 4）将步骤3）培养的液体菌种在无菌条件下分装到25毫升无菌带盖冷冻管中，每管10毫升，并进行编号，随机选出3管，其余全部同时保藏在-72℃至-86℃超级低温冰箱内；

[0011] 5）将随机选出的3管液体菌种按常规方法进行试栽，3瓶出草均正常的同一批次种源，保藏在超级低温冰箱内的同一批次种源作为生产性种源使用。

[0012] 进一步地，步骤2）中液体菌种培养基配方为：葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁2克、维生素B110毫克、维生素B25毫克、水1000毫升，煮沸溶化配方中各成分物质。

[0013] 进一步地，超级低温冰箱内液体菌种使用前逐级解冻，具体步骤为：先把液体菌种冷冻管转到温度为-24℃至-30℃冰柜中存放24小时，然后转到温度为-10℃至-16℃冰柜中存放24小时，最后放入冰水混合0℃环境中解冻至液体培养基全部溶化。

[0014] 本发明与现有技术相比，有益效果在于：

[0015] 通过本发明保存的蛹虫草可结实性液体种源，有效保藏期限可达到3年甚至更久（目前最长试验保藏期为3年）；

[0016] 本发明从根本上解决了优良蛹虫草种源退化速度快，可结实性种源生产供应期短的技术问题，实现了同一批次种源一次检测，持久使用的目标。

具体实施方式

[0017] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0018] 实施例1

[0019] 一种蛹虫草可结实性生产种源长久保藏方法，按照如下的步骤进行：

[0020] 1）将选育获得的蛹虫草可结实性优良母种种源作为初始实验种源，种源形式为斜面固体母种；

[0021] 2）将液体菌种培养基分装于250毫升锥型瓶或白色滴流瓶中，每瓶装培养基1002
毫升，封口后装入高压灭菌锅中，在1.05Kg/cm压强下灭菌60分钟，待冷却至25℃以下开始按常规方法接种；具体接种方法：在超净工作台无菌环境里，将灭菌后液体培养基和斜面固体母种种源准备好，在酒精灯火焰附近开启母种菌管棉塞，用接种工具取黄豆粒大小的菌种1块，接入液体培养基，无菌封口即可。

[0022] 3）接种后的蛹虫草液体菌种在20℃±1℃温度下震荡培养，震荡频率120～130次/分钟，连续培养5～7天；选出菌球大小均匀、毛刺锐利、数量多、培养基液体清澈透明的液体菌种；

[0023] 4）将步骤3）培养的液体菌种在无菌条件下分装到25毫升无菌带盖冷冻管中，每管10毫升，并进行编号，随机选出3管，其余全部同时保藏在-72℃至-86℃超级低温冰箱内；

[0024] 5）将随机选出的3管液体菌种按常规方法进行试栽，如果3管出草均正常则保藏在超级低温冰箱内的同一批次种源可作为生产性种源使用。

[0025] 其中，步骤2）中液体菌种培养基配方为：葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁2克、维生素B110毫克、维生素B25毫克、水1000毫升，煮沸溶化配方中各成分物质。

[0026] 6）上述的保藏的样品在使用前逐级解冻，具体步骤为：先把液体菌种冷冻管转到温度为-24℃至-30℃冰柜中存放24小时，然后转到温度为-10℃至-16℃冰柜中存放24小时，最后放入冰水混合0℃环境中解冻至液体培养基全部溶化。

[0027] 解冻后取出液体菌种冷冻管按2、3程序步骤生产液体菌种，培养好的液体菌种可