猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法及用途

摘要

本发明公开了猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法，其包括：选取猪疫苗抗体阳性的猪屠宰，收获猪脾脏；低温保藏；解冻猪脾脏；去筋膜；绞碎；匀浆；装瓶、储存；反复冻融；离心；微滤；超滤；灭活；pH调节；渗透压调节；除菌；质量检测。本发明在匀浆步骤中将注射用水的pH值调节至4-6，有利于提高核糖、多肽得率。本发明采用盒式膜包切向流过滤，系统残留死体积小，易于线性放大生产。本发明将转移因子粗制品经1-3 KD盒式膜包进行切向流纳滤，制得高浓度转移因子，提高使用效果。本发明使用酚红作酸碱指示剂，方便客户观察转移因子的pH值。本发明的转移因子，使用β-丙内酯替代传统甲醛灭活，加入渗透压调节工艺，有利于转移因子与疫苗的联合免疫。

权利要求

1.猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：

1) 对健康猪免疫一种以上的猪疫苗，每种猪疫苗免疫2次以上，相邻两次免疫时间间隔为7天以上，最后一次免疫猪疫苗后14-28天，检测猪疫苗抗体，选取猪疫苗抗体阳性的猪屠宰，收获猪脾脏；

2) 低温保藏：收获的猪脾脏立即保存于-40℃以下，保存时间不超过20天；

3) 解冻猪脾脏：将低温保藏的猪脾脏经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后用纯化水洗3-5遍，弃去硬化、坏死的猪脾脏；

4) 去筋膜：解冻后去除猪脾脏表面的筋膜、脂肪组织，经注射用水洗3-5遍；

5) 绞碎：将经注射用水清洗过的猪脾脏放入绞肉机初绞1-2遍；

6) 匀浆：用HCl溶液将注射用水的pH值调节至4-6，与绞碎后的猪脾脏按重量比

1-2:1混合，经胶体磨匀浆，得匀浆液；

7) 装瓶、储存：将匀浆液分装于无热源的瓶子后，立即保存于-40℃以下，保存时间不超过20天；

8) 反复冻融：将瓶装匀浆液经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后立即于-40℃以下冷冻，反复冻融3-6次；

9) 离心：将反复冻融后的匀浆液于4℃、5500-8000 r/min离心15-30 min，收集上清液；

10) 微滤：将步骤9)得到的上清液采用0.1-0.45 μm盒式膜包进行切向流微滤：当微滤透过物体积达到上清液体积的2/3-3/4时，对微滤截留物进行恒体积透析，至微滤透过物体积增加了微滤截留物体积的0.1-1倍为止，收集微滤透过物即为澄清液；

11) 超滤、纳滤：将步骤10)得到的澄清液采用5-10 KD盒式膜包进行切向流超滤：当超滤透过物体积达到澄清液体积的4/5-6/7时，对超滤截留物进行恒体积透析，至超滤透过物体积增加了超滤截留物体积的1-2.5倍为止，收集超滤透过物即为猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品；

将猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品经1-3 KD盒式膜包进行切向流纳滤，使纳滤截留物体积达到转移因子粗制品体积的1/6-1/1.1倍，收集纳滤截留物即为高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品；

12) 灭活：将β-丙内酯与高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品，按体积比1：

4000-100000混匀，在4℃下80-200 r/min的转速下灭活6-24 h，灭活后置于37℃下水解

2-8 h；

13) pH调节：将灭活后的高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的pH值调节至

6.8-7.2；

14) 渗透压调节：将pH调节后的高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的渗透压调节至280-320 mosm/kg；

15) 除菌：将渗透压调节后的高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品采用0.1 μm的除菌过滤器除菌，即得猪疫苗特异性猪脾脏转移因子；

16) 质量检测：猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的性状为微黄色或黄色透明液体，多肽含量不低于2.5 mg/mL，核糖含量不低于50 μg/mL，内毒素含量不超过10 EU/mL，按照《中国兽药典》的要求进行检测后应无菌，pH值为6.8-7.2，渗透压值为280-320 mosm/kg，磺基水杨酸蛋白质定性测定为阴性，鉴别检验中在250-260 nm的波长处有最大吸收、OD260nm/OD280nm的比值应不低于1.9，脱E受体法效力检验不低于10.0%，安全检验合格，即为质量检测合格。

2.根据权利要求1所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，先用白扁豆饲喂健康猪，用量为每头猪每天30-60 g，饲喂15-30天，然后再用一种以上的猪疫苗免疫健康猪。

3.根据权利要求1所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法，其特征在于：所述的猪疫苗为猪瘟疫苗、猪伪狂犬病疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪乙型脑炎病疫苗、猪细小病毒病疫苗、猪口蹄疫疫苗、猪圆环病疫苗、猪传染性胃肠炎疫苗、猪流行性腹泻疫苗中一种或几种。

4.根据权利要求1所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法，其特征在于：所述步骤13）中，将灭活后的高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的pH值调节至

6.8-7.2后，加入酚红显色；则步骤16）质量检测时，猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的性状为红色或淡红色透明液体。

说明书

猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法及用途

技术领域

[0001] 本发明属于转移因子，具体涉及猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法及用途。

背景技术

[0002] 转移因子（Transfer Factor,TF）是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的物质，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体，从而增强受体的免疫功能。上世纪50年代发现TF至今，国内外学者对其进行了大量研究，并于1979年将其引入兽医免疫和临床治疗中，目前TF逐渐成为一种应用广泛的免疫增强剂。

[0003] TF无种属特异性，因此TF来源广泛，人类临床上常见的有人TF、猪TF、牛TF、羊TF、鹅TF、猴TF等，而畜禽养殖中常见的有牛TF、猪TF，鸡TF。

[0004] TF的分子量大约介于3KD和5KD之间，是具有生物活性的非均一性的小分子混合物，其内含物包含游离氨基酸、核酸、多肽及K、Na、Ca、Mg、Zn等金属元素。各种TF的理化特性、组成成分差异不大，但含量有较大差异。

[0005] 从免疫学上，TF分为特异性TF和非特异性TF。特异性TF采用特定病原感染或免疫人群、动物后再提取含该抗原特异活性的TF，目前临床己经应用有乙型肝炎病毒特异TF、各种肿瘤特异TF、流行性出血热病毒TF、孢疹病毒TF、乙型脑炎TF、结核菌TF等。非特异性TF是指用自然人群或动物白细胞提取的具有多种免疫活性的TF，可非特异性调节机体的免疫机能，提高机体的抵抗力及疫苗的免疫效果。

[0006] 随着现代化养殖业的发展及规模化、集约化程度的不断提高，目前疾病已成为困扰养殖业的难题。现有的普遍的解决方法就是免疫，然而由于种种原因，有时难免造成免疫失败，爆发非典型性传染病，给诊断和治疗带来一定困难。在免疫失败后往往依赖抗生素治疗，造成了耐药菌株的增加和交叉感染的产生。TF作为免疫增强剂，可提高机体的抵抗力及疫苗的免疫效果，减少免疫失败，在疾病防治中可发挥重要作用。

[0007] 脾脏是机体的免疫器官之一。猪脾TF含有游离氨基酸、多肽等40多种小分子物质，等电点为4.48，分子量较低。猪脾TF与机体的免疫功能有着密切的关系，是一种免疫增强剂，且具有无抗原性、无致畸、无致突变等优点。畜禽脾脏为加工过程中的废物，有着极广的应用开发前景，己成为TF研究的热点。

[0008] 白扁豆，俗称眉豆、南扁豆，含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、钙、磷、铁、锌、植酸钙镁、泛酸、豆甾醇、磷脂、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、淀粉及酪氨酸酶等。白扁豆气味甘平，微温，具有和中健脾、消暑化湿、补五脏之功。《本草纲目》中说，白扁豆“其性温平，得乎中和，脾之谷也”；“止泻痢，消暑，暖脾胃，除湿热，止消渴”。现代药理研究发现，白扁豆具有调节胃肠运动及免疫功能、抑菌、抗病原微生物、解毒、抗凝血等作用。在我国，白扁豆资源丰富，价格便宜。

[0009] β-丙内酯已用于多种疫苗的灭活，沸点155℃，常温下是无色粘稠状液体，对病毒具有很强的灭活作用，灭活时间短，可提高生产效率。β-丙内酯极易水解，37℃2h即消失，无残留，水解产物无毒无害，水解为无毒性的脂肪代谢产物β-羟基丙酸。而甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质，使用甲醛灭活时间长，残留的甲醛不分解，注入机体后，会产生刺激性反应。

[0010] 微生物对所处的渗透压要求等渗，等渗溶液的渗透压值为280-320mosm/kg。渗透压值低于此值的溶液称低渗溶液，如蒸馏水等；渗透压值高于此值的溶液称高渗溶液，如10%的葡萄糖液或50%的葡萄糖液等。微生物处于高渗溶液中，易发生质壁分离皱缩死亡；
相反若处于低渗溶液中，易吸水膨胀破裂死亡。

[0011] 猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒引起猪的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病，是危害我国养猪业最为严重的疫病之一。我国一直采取以防为主的防制方针，目前主要应用猪瘟兔化疫苗(Hog Cholera Lapinized Virus,HCLV)来防控猪瘟。猪瘟的急性发生和大面积流行在我国已经得到有效的控制，但近年来猪瘟的流行和发病特点发生了很大的变化，其流行形式从过去频发的大流行转变为周期性、波浪式的地区散发性流行，临床症状和病理变化亦由典型性转为非典型性。

[0012] 伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒引起多种家畜的一种传染病。猪是伪狂犬病病毒的天然宿主，该病是严重危害猪群的原发性疾病之一。

[0013] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）于1987年首发于美国，现已遍布全世界。在我国1996年北京地区首次爆发PRRS，现己传播到各省市，造成巨大经济损失。各国科研人员纷纷致力于PRRS疫苗研发，现已研制出多种疫苗应用于生产实践，显示出一定效果，但至今PRRS仍然是造成我国养猪业经济损失的重要疾病。PRRS病毒（PRRSV）特异的免疫学特征给疫苗的设计与研制带来一定困难，而免疫应答机制的研究和疫苗免疫佐剂的研发是今后重要工作。

[0014] 流行性乙型脑炎(Japanese Encephalitis,JE)是由日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)引起的一种人畜共患的虫媒介导的自然疫源性的嗜神经性急性传染病。JEV感染猪称为猪乙型脑炎，属于国家二类动物疫病，是引起猪繁殖障碍性综合征的主要病毒性疾病之一。

[0015] 猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)是引起猪繁殖障碍的一个非常重要的病原体。目前本病在我国乃至许多养猪国家都有流行。虽然近年来随着猪细小病毒弱毒疫苗和灭活疫苗的广泛使用，猪细小病毒的感染和流行得到了一定控制，但其在不少地区仍时有发生，给我国养猪业带来了很大的损失。

[0016] 口蹄疫（Food and Mouth Disease,FMD）是危害哺乳动物的一种高度接触性传染病，对易感偶蹄兽具有严重的经济危害。牛(黄牛、水牛、奶牛)、猪、羊、骆驼、鹿等均易感。

[0017] 猪圆环病毒（Porcine Circovirus,PCV）为圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属成员，是迄今已知最小的动物病毒之一。猪圆环病已成为严重危害养猪业的重要传染病。

[0018] 猪传染性胃肠炎(Porcine Transmissible Gastroenteritis,TGE)、猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)分别是由猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的病毒性高度接触性传染性肠道疾病，都属于冠状病毒科冠状病毒属成员。

[0019] TGEV对各年龄段的猪均易感发病，但新生几周内的仔猪的发病率和死亡率最高，几乎达到100%死亡。随着日龄的增大，患病猪的死亡率有所降低，但感染该病的猪生产性能下降，饲料报酬率低下，给全球养猪业带来严重的经济损失。

[0020] PEDV在结构、临床症状及对机体产生的损伤等方面均与TGEV相似。7日龄内哺乳仔猪感染发病最为多见，严重时可导致全群发病，致使哺乳仔猪大量死亡，保育猪和育肥猪增重减慢，对养猪业造成很大的损失。

[0021] 目前国内生产猪脾TF的厂家很多，提取工艺也不尽相同，有超离心、超滤、透析冻干、葡萄糖凝胶层析、冷乙醇抽提等方法。现有的转移因子技术，通常是将动物脾脏中的脂肪、大血管、表面筋膜等组织剔出后，进行组织捣碎，反复冻融后，通过半透膜透析获得。常规采用Lawrence方法，即利用两次透析法回收转移因子，此法操作简单，但生产周期长、耗时长、浪费大、效果不好且费人力物力。另外，即使采用切向流过滤方法，大多采用中空纤维滤膜进行切向流过滤，中空纤维滤膜清洗困难、膜损坏后要更换整个组件、系统残留死体积较大、纤维管内流动阻力很大、压力损失较大、不宜处理黏稠液体、不易线性放大生产。这些方法较难进行大规模扩大生产来满足市场的需要。

[0022] 原有制备TF的方法因在灭活工艺中选用甲醛灭活及缺少渗透压调节工艺，导致制备的TF不宜作为猪疫苗的稀释液及免疫佐剂使用，即不能直接稀释猪弱毒疫苗、不能与猪弱毒疫苗病毒液混合后冻干。

[0023] 酚红，别名苯酚磺酞，是一种酸碱指示剂。当酚红所处溶液的PH≥7时，颜色由红变深紫色；若PH≤7时，颜色则由红色逐渐变成黄色。酚红的变色范围很适合作转移因子的酸碱度指示剂，酚红会随溶液的pH变化而改变颜色，成为观察转移因子pH的最直观指标。

发明内容

[0024] 本发明的目的为提供一种快速、高效、经济且易线性放大的从动物脾脏中获取猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的方法，及将其作为免疫增强剂及免疫佐剂科学使用的用途。

[0025] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0026] 猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法，其包括以下步骤：

[0027] 1)对健康猪免疫一种以上的猪疫苗，每种猪疫苗免疫2次以上，相邻两次免疫时间间隔为7天以上，最后一次免疫猪疫苗后14-28天，检测猪疫苗抗体，选取猪疫苗抗体阳性的猪屠宰，收获猪脾脏；

[0028] 2)低温保藏：收获的猪脾脏立即保存于-40℃以下，保存时间不超过20天；

[0029] 3)解冻猪脾脏：将低温保藏的猪脾脏经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后用纯化水洗3-5遍，弃去硬化、坏死的猪脾脏；

[0030] 4)去筋膜：解冻后去除猪脾脏表面的筋膜、脂肪组织，经注射用水洗3-5遍；

[0031] 5)绞碎：将经注射用水清洗过的猪脾脏放入绞肉机初绞1-2遍；

[0032] 6)匀浆：用HCl溶液将注射用水的pH值调节至4-6，与绞碎后的猪脾脏按重量比1-2:1混合，经胶体磨匀浆，得匀浆液；

[0033] 7)装瓶、储存：将匀浆液分装于无热源的瓶子后，立即保存于-40℃以下，保存时间不超过20天；

[0034] 8)反复冻融：将瓶装匀浆液经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后立即于-40℃以下冷冻，反复冻融3-6次；

[0035] 9)离心：将反复冻融后的匀浆液于4℃、5500-8000r/min离心15-30min，收集上清液；

[0036] 10)微滤：将步骤9)得到的上清液采用0.1-0.45μm盒式膜包进行切向流微滤：当微滤透过物体积达到上清液体积的2/3-3/4时，对微滤截留物进行恒体积透析，至微滤透过物体积增加了微滤截留物体积的0.1-1倍为止，收集微滤透过物即为澄清液；

[0037] 11)超滤：将步骤10)得到的澄清液采用5-10KD盒式膜包进行切向流超滤：当超滤透过物体积达到澄清液体积的4/5-6/7时，对超滤截留物进行恒体积透析，至超滤透过物体积增加了超滤截留物体积的1-2.5倍为止，收集超滤透过物即为猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品；

[0038] 12)灭活：将β-丙内酯与猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品，按体积比1：4000-100000混匀，在4℃下80-200r/min的转速下灭活6-24h，灭活后置于37℃下水解
2-8h；

[0039] 13)pH调节：将灭活后的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的pH值调节至6.8-7.2；

[0040] 14)渗透压调节：将pH调节后的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的渗透压调节至280-320mosm/kg；

[0041] 15)除菌：将渗透压调节后的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品采用0.1μm的除菌过滤器除菌，即得猪疫苗特异性猪脾脏转移因子；

[0042] 16)质量检测：猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的性状为微黄色或黄色透明液体，多肽含量不低于2.5mg/mL，核糖含量不低于50μg/mL，内毒素含量不超过10EU/mL，按照《中国兽药典》的要求进行检测后应无菌，pH值为6.8-7.2，渗透压值为280-320mosm/kg，磺基水杨酸蛋白质定性测定为阴性，鉴别检验中在250-260nm的波长处有最大吸收、OD260nm/OD280nm的比值应不低于1.9，脱E受体法效力检验不低于10.0%，安全检验合格，即为质量检测合格。

[0043] 本发明步骤6）中pH值为4-6的注射用水与绞碎后的猪脾脏混匀后经胶体磨匀浆，得匀浆液。因本发明在匀浆步骤中调节pH值，有利于蛋白絮凝、抑制细菌生长及内毒素产生，提高后期离心的收率及微滤、超滤的速度，提高转移因子核糖和多肽的得率。而现有技术一般在匀浆、反复冻融或细胞破碎仪破碎细胞步骤后，在离心步骤前，将料液pH值调节至4-6，导致蛋白絮凝效果差，较难抑制细菌生长及内毒素产生，核糖和多肽的得率较低。

[0044] 本发明步骤10)及11）逐级采用0.1-0.45μm、5-10KD盒式膜包进行切向流过滤，而现有技术一般采用中空纤维滤膜进行切向流过滤。现有采用中空纤维滤膜进行切向流过滤，系统残留死体积大，使用后清洗困难，使用过程中薄膜易受损。特别是，采用中空纤维滤膜进行切向流过滤从小试优化、中试放大到生产规模，无法线性放大，不便于从研发到投入生产再到扩大生产。而本发明采用的逐级盒式膜包进行切向流过滤，系统残留死体积小，使用后清洗方便，使用过程中薄膜不易受损。同时，本发明采用的逐级盒式膜包进行切向流过滤方便从小试优化、中试放大到生产规模，可线性放大，方便从研发到投入生产再到扩大生产，加快产品上市过程，降低产品的研发成本。

[0045] 本发明步骤12）中采用β-丙内酯对猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品灭活。而现有技术转移因子一般采用甲醛灭活，灭活后，由于残留甲醛的存在，导致转移因子无法稀释或混合猪弱毒疫苗，更无法与猪弱毒疫苗病毒液制成冻干苗，并且残留甲醛导致转移因子注射动物后，对动物造成较大应激。

[0046] 而本发明步骤12）中采用β-丙内酯对猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品灭活，因β-丙内酯极易水解，37℃2h即消失，无残留，水解产物无毒无害，所以本发明制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子可稀释或混合猪弱毒疫苗，还可与猪弱毒疫苗病毒液制成冻干苗，注射动物后，应激很小。

[0047] 在步骤14）中，对pH调节后的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品进行渗透压调节。现有技术中，没有渗透压调节工艺，制成的转移因子一般为160-250mosm/kg的低渗溶液。这样的转移因子不仅不能稀释或混合猪弱毒疫苗，而且也不能与猪弱毒疫苗病毒液制成冻干苗（在低渗溶液中，猪弱毒疫苗病毒株易吸水膨胀破裂死亡，导致疫苗效价及免疫效果降低）。因此，这样制备的转移因子在使用过程中，弱毒疫苗与转移因子必须分开使用，如：需要两次注射，操作繁琐。并且若采用低渗透压的转移因子注射，由于低渗溶液会导致猪局部组织细胞吸水膨胀甚至破裂，很容易使猪产生应激。

[0048] 而本发明步骤14）中，将pH调节后的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的渗透压调节至280-320mosm/kg。由于本发明猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的渗透压与血浆的渗透压一致，所以为等渗溶液。因此，本发明制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子不仅可以稀释或混合猪弱毒疫苗，而且也可以与猪弱毒疫苗病毒液制成冻干苗。使用过程中，本发明的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子可与弱毒疫苗同针免疫，实践中操作方便。同时，采用本发明制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子注射后，猪无应激。

[0049] 所述步骤1）中，先用白扁豆饲喂健康猪，用量为每头猪每天30-60g，饲喂15-30天，然后再用一种以上的猪疫苗免疫健康猪。本发明步骤1）中采用白扁豆饲喂健康猪，可和中健脾，提高猪的免疫力及猪疫苗抗体阳性率。经白扁豆饲喂后的健康猪，提取的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子采用脱E受体法效力检验大于13.0%。而未采用白扁豆饲喂健康猪，猪疫苗抗体阳性率相对较低，脱E受体法效力检验一般为12.0%左右。

[0050] 进一步，所述的猪疫苗为猪瘟疫苗、猪伪狂犬病疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪乙型脑炎病疫苗、猪细小病毒病疫苗、猪口蹄疫疫苗、猪圆环病疫苗、猪传染性胃肠炎疫苗、猪流行性腹泻疫苗中一种或几种。本发明能制备猪疫苗单特异性猪脾脏转移因子，亦能制备猪疫苗多特异性猪脾脏转移因子。而现有技术制备的猪脾脏转移因子效果单一。

[0051] 所述步骤13）中，将灭活后的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的pH值调节至6.8-7.2后，加入酚红显色；则步骤16）质量检测时，猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的性状为红色或淡红色透明液体。本发明中，采用酚红作为酸碱指示剂。因制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子在保存运输过程中，由于保存或运输环境不当，或由于其他因素发生变质，则猪疫苗特异性猪脾脏转移因子溶液的pH发生改变，从而通过酚红可直接观察保存的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子是否变质，方便客户判断所持有的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子是否可使用，极大地方便了客户。

[0052] 进一步，所述的步骤11）超滤后和步骤12）灭活前，将猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品经1-3KD盒式膜包进行切向流纳滤，使纳滤截留物体积达到转移因子粗制品体积的1/6-1/1.1倍，收集纳滤截留物即为高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品。由于本发明采用该步骤，使纳滤后的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子核糖含量大于60μg/mL，多肽含量大于3.0mg/mL，脱E受体法效力检验大于13.0%，大大减少了转移因子的使用体积，从而方便后期与猪弱毒疫苗病毒液混合制备冻干疫苗，大大减少了冻干体积，减少了冻干操作次数，采用小体积的冻干设备即可进行冻干操作，降低生产成本。

[0053] 所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的用途有以下几种：

[0054] 第一种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子1-6mL免疫每头猪。

[0055] 第二种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为稀释液，用2-6mL稀释液稀释一种与步骤1）中猪体内猪疫苗抗体阳性相对应的猪弱毒疫苗1-3头份，稀释后的猪弱毒疫苗分别免疫每头猪。

[0056] 第三种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为免疫佐剂，用0.05-0.1mL免疫佐剂混合一种与步骤1）中猪体内猪疫苗抗体阳性相对应的猪弱毒疫苗病毒液1-3头份，加入冻干保护剂后冻干，制成冻干猪弱毒疫苗，使用前将其稀释，分别免疫每头猪。

[0057] 该处加入的冻干保护剂可以是下列中的一种：明胶、脱脂奶粉、乳糖、海藻糖或蔗糖等。

[0058] 第四种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为免疫佐剂，用0.1-0.5mL免疫佐剂混合一种与步骤1）中猪体内猪疫苗抗体阳性相对应的猪灭活疫苗病毒液1-3头份，再加入其他佐剂，制成猪灭活疫苗，分别免疫每头猪。

[0059] 该处加入的其他佐剂可以是下列中的一种：Al(OH)3、AlPO4、Ca3(PO4)2、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、矿物油白油等其他佐剂。

[0060] 以上所述的免疫方式包括注射、饮水、拌料、滴鼻、喷雾等。

[0061] 本发明采用以上技术方案，具有以下有益效果：通过提供一种快速、高效、经济且易线性放大的从猪脾脏中获取猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的方法，及将其作为免疫增强剂及免疫佐剂科学使用的用途。

[0062] 本发明的优点具体为：1、本发明猪脾脏来源容易；白扁豆饲喂猪群，可和中健脾、提高猪的免疫力及猪疫苗的免疫效力。

[0063] 2、本发明先后采用绞肉机、胶体磨破碎组织细胞，全机器化处理，有利于提高生产效率，节约成本。

[0064] 3、本发明在匀浆步骤中将注射用水的pH值调节至4-6，有利于蛋白絮凝、抑制细菌生长及内毒素产生，提高后期离心的收率及微滤、超滤的速度，提高核糖和多肽的得率。

[0065] 4、本发明将匀浆液分装于无热源的瓶子后，立即保存于-40℃以下，保存时间不超过20天，之后将瓶装匀浆液经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后立即于-40℃以下冷冻，反复冻融3-6次，使多肽、核糖含量大大提高，且节约成本。

[0066] 5、本发明采用切向流逐级过滤的方式，依次经0.1-0.45μm、5-10KD及1-3KD盒式膜包微滤、超滤及纳滤，工艺简单，盒式膜包切向流装置牢固且系统残留死体积小，适合在广泛的压力范围内工作，流道间隙大小可调，流道不易被杂物堵塞，具有可拆性，清洗方便，通过增减膜及支撑板的数量可处理不同料液量，生产效率高、质量稳定、成本低、易于线性放大生产。

[0067] 6、本发明将猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品经1-3KD盒式膜包进行切向流纳滤，制得高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子，可减少转移因子的使用剂量，提高使用效果。

[0068] 7、本发明使用酚红作为转移因子的酸碱度指示剂，方便转移因子pH值的直观观察。

[0069] 8、本发明的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子，使用β-丙内酯替代传统的甲醛灭活，加入渗透压调节工艺，有利于转移因子与疫苗的联合免疫，即：使转移因子可作为稀释液，稀释一种猪弱毒疫苗，之后免疫每头猪，不需与猪弱毒疫苗分针免疫，使用方便；此外转移因子还可作为免疫佐剂，混合一种猪弱毒疫苗病毒液，加入冻干保护剂后冻干，制成冻干猪弱毒疫苗，方便保存运输。同时，等渗溶液有利于减少免疫应激。

[0070] 9、转移因子经0.1um的除菌过滤器除菌，比采用0.22um的除菌过滤器，更有利于去除支原体等微生物。

[0071] 10、本发明生产的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子，生产周期短，并且节省了大量的人力物力。

附图说明

[0072] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

[0073] 图1为本发明实施例1的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子与现有转移因子增强猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗免疫保护力的对比实验中攻毒后各组实验猪的存活情况图。

具体实施方式

[0074] 下面结合具体实施方式，对本发明做进一步的说明。

[0075] 猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法，其包括以下步骤：

[0076] 1)用白扁豆饲喂健康猪，用量为每头猪每天30-60g，饲喂15-30天，然后对饲喂白扁豆的健康猪免疫一种以上的猪疫苗，每种猪疫苗免疫2次以上，相邻两次免疫时间间隔为7天以上，最后一次免疫猪疫苗后14-28天，检测猪疫苗抗体，选取猪疫苗抗体阳性的猪屠宰，收获猪脾脏；

[0077] 2)低温保藏：收获的猪脾脏立即保存于-40℃以下，保存时间不超过20天；

[0078] 3)解冻猪脾脏：将低温保藏的猪脾脏经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后用纯化水洗3-5遍，弃去硬化、坏死的猪脾脏；

[0079] 4)去筋膜：解冻后去除猪脾脏表面的筋膜、脂肪组织，经注射用水洗3-5遍；

[0080] 5)绞碎：将经注射用水清洗过的猪脾脏放入绞肉机初绞1-2遍；

[0081] 6)匀浆：用HCl溶液将注射用水的pH值调节至4-6，与绞碎后的猪脾脏按重量比1-2:1混合，经胶体磨匀浆，得匀浆液；

[0082] 7)装瓶、储存：将匀浆液分装于无热源的瓶子后，立即保存于-40℃以下，保存时间不超过20天；

[0083] 8)反复冻融：将瓶装匀浆液经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后立即于-40℃以下冷冻，反复冻融3-6次；

[0084] 9)离心：将反复冻融后的匀浆液于4℃、5500-8000r/min离心15-30min，收集上清液；

[0085] 10)微滤：将步骤9)得到的上清液采用0.1-0.45μm盒式膜包进行切向流微滤：当微滤透过物体积达到上清液体积的2/3-3/4时，对微滤截留物进行恒体积透析，至微滤透过物体积增加了微滤截留物体积的0.1-1倍为止，收集微滤透过物即为澄清液；

[0086] 11)超滤：将步骤10)得到的澄清液采用5-10KD盒式膜包进行切向流超滤：当超滤透过物体积达到澄清液体积的4/5-6/7时，对超滤截留物进行恒体积透析，至超滤透过物体积增加了超滤截留物体积的1-2.5倍为止，收集超滤透过物即为猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品；

[0087] 12)灭活：将β-丙内酯与猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品，按体积比1：4000-100000混匀，在4℃下80-200r/min的转速下灭活6-24h，灭活后置于37℃下水解
2-8h；

[0088] 13)pH调节：将灭活后的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的pH值调节至6.8-7.2；

[0089] 14)渗透压调节：将pH调节后的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的渗透压调节至280-320mosm/kg；

[0090] 15)除菌：将渗透压调节后的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品采用0.1μm的除菌过滤器除菌，即得猪疫苗特异性猪脾脏转移因子；

[0091] 16)质量检测：猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的性状为微黄色或黄色透明液体，多肽含量不低于2.5mg/mL，核糖含量不低于50μg/mL，内毒素含量不超过10EU/mL，按照《中国兽药典》的要求进行检测后应无菌，pH值为6.8-7.2，渗透压值为280-320mosm/kg，磺基水杨酸蛋白质定性测定为阴性，鉴别检验中在250-260nm的波长处有最大吸收、OD260nm/OD280nm的比值应不低于1.9，脱E受体法效力检验不低于10.0%，安全检验合格，即为质量检测合格。

[0092] 所述步骤16)质量检测的具体操作为：

[0093] A.性状：猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的性状为微黄色或淡黄色透明液体（若加入酚红，猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的性状为红色或淡红色透明液体）；

[0094] B.多肽含量测定：猪疫苗特异性猪脾脏转移因子按福林酚法进行测定，每毫升多肽含量应不低于2.5mg；

[0095] 福林酚法：

[0096] 试剂：

[0097] a）碱性铜溶液：溶液Ⅰ进行5倍稀释后与溶液Ⅱ，以50:1的比例混合，混合后即为碱性铜溶液，此试剂只能用1天，过期失效；

[0098] b）酚溶液；

[0099] 操作法：

[0100] a）对照品溶液的制备：取牛血清白蛋白对照品，加水制成每毫升中含250ug的溶液；

[0101] b）供试品溶液的制备：取猪疫苗特异性猪脾脏转移因子适量，用水进行适当稀释作为供试品溶液；

[0102] c）标准曲线的制备：取7支试管，精密量取对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置带塞刻度试管中，各加水至1.0mL，再分别加入碱性铜溶液5.0ml，摇匀，于室温下放置10min，各加入酚溶液0.5mL，立即混匀，置室温放置30min，然后于500nm的波长处测定吸收度；同时以不加标准蛋白试管（0管）中的溶液作为空白对照，以对照品溶液浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归；相关系数不低于0.99；

[0103] d）测定法：精密量取供试品溶液1.0mL，照标准曲线的制备项下的方法，自“再分别加入碱性铜溶液”起，以标准曲线中的0管为空白，依法测定吸收度；根据吸收度从回归方程中求得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，求出供试品多肽含量；

[0104] C.核糖含量测定：猪疫苗特异性猪脾脏转移因子按核糖含量测定法进行测定，每毫升核糖含量不应低于50μg；

[0105] 核糖含量测定法：

[0106] 试剂：

[0107] a）5%三氯醋酸：称取三氯醋酸5g，加蒸馏水溶解成100mL；

[0108] b）0.1%三氯化铁-盐酸溶液：称取三氯化铁（FeCl3·6H2O）0.5g，加浓盐酸溶解成500mL，可长期使用；

[0109] c）1%3,5-二羟基甲苯（苔黑酚）：称取3,5-二羟基甲苯1g，溶于100mL0.1%三氯化铁-盐酸溶液中，临用新配；

[0110] 操作方法：

[0111] a）对照品溶液的制备：精密称取D核糖对照品适量，用5%三氯醋酸制成每毫升含核糖20ug的溶液，摇匀；

[0112] b）供试品溶液的制备：取猪疫苗特异性猪脾脏转移因子适量，用5%三氯醋酸进行适当稀释作为供试品溶液；

[0113] c）标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置带塞刻度试管中，各加入5%三氯醋酸溶液至2.0mL，再分别加入1%3,5-二羟基甲苯溶液2.0mL，摇匀，置沸水浴中准确加热30min，迅速冷却至室温，以0号管为空白，照分光光度法（见现行《中国药典》附录），在650nm的波长处测定吸收度，以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归；相关系数不低于0.995；

[0114] d）测定法：精密量取供试品溶液2.0mL，照标准曲线的制备方法，自“再分别加入1%3,5-二羟基甲苯溶液2.0mL”起，依法测定吸收度；根据吸收度从回归方程中求得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，求出供试品核糖含量；

[0115] D.细菌内毒素测定：按现行《中国兽药典》附录进行检验，内毒素含量不超过10EU/mL；

[0116] E.无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长；

[0117] F.pH值测定：按现行《中国兽药典》附录进行检验，pH值应为6.8-7.2；

[0118] G.渗透压值测定：按现行《中国兽药典》附录进行检验，渗透压值为280-320mosm/kg；

[0119] H.蛋白质定性测定：将20%磺基水杨酸2mL与样品2mL，混匀，反应后无浑浊沉淀，反应为阴性；

[0120] I.鉴别检验：猪疫苗特异性猪脾脏转移因子做适当稀释后，按分光光度计法（按现行《中国兽医典》附录进行）测定OD260nm、OD280nm，并扫描图谱，在250-260nm的波长处有最大吸收，OD260nm/OD280nm的比值应不低于1.9；

[0121] J.效力检验：按脱E受体法进行检验，样品管淋巴细胞玫瑰花结百分率与对照管之差应不低于10.0%；

[0122] 脱E受体法：

[0123] 试剂：

[0124] a）Hank’s液：将0.3%磷酸二氢钾溶液、0.76%磷酸氢二钠溶液、2%氯化钾溶液及20%氯化钠溶液依次按20:20:20:40比例混合，加葡萄糖1g，溶解后混匀，用水稀释至1000ml，并用4%碳酸氢钠溶液调节pH值至7.2-7.3（临用时配制）；

[0125] b）阿氏液：取氯化钠0.420g、枸橼酸0.055g、枸橼酸钠0.766g、葡萄糖2.05g，加水溶解并稀释至1000mL，灭菌备用；

[0126] c）分离液：为淋巴细胞分离液；

[0127] d）绵羊抗凝血：取绵羊静脉血5mL，加入5mL阿氏液中，2-8℃冰箱保存；

[0128] e）固定液：用25%戊二醛溶液、3.5%碳酸氢钠溶液及Hank’s液依次按1:1:38比例混合；

[0129] f）姬姆萨染色液：取姬姆萨染料0.5g，加甘油33mL，55-60℃加热至姬姆萨染料溶解，冷至室温，加入甲醇33mL，室温放置24h后，用滤纸过滤，滤液即为原液；取姬姆萨染色液原液2mL，加Hank’s液6mL，摇匀，1500r/min离心10分钟，取上清液即得；

[0130] 操作方法：

[0131] a）脱E受体T淋巴细胞悬液的制备：取新鲜猪胸腺，去脂肪剪碎，加适量Hank’s液使成细胞悬液，经100目筛过滤，1500r/min离心3-5min，弃去上清液，加入少量Hank’s液打匀，将此溶液加入已具等量分离液的离心管中，用水平离心机以2000r/min离心20min，小心吸出中间层的淋巴细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤，混匀，1500r/min离心3-5min，弃去上清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入适量的Hank’s液，混匀，45℃恒温水浴保温30min（每隔5min振摇一次），1500r/min离心3-5min，弃去上清液；再加入适量的Hank’s液，混匀后，45℃恒温水浴保温30min，1500r/min离心3-5min，弃去上清液；用Hank’s液洗涤3次（操作同前），再用Hank’s液适当稀释并计数，使最终浓度约为1mL中6 6
3×10-5×10个细胞，为脱E受体淋巴细胞悬液；

[0132] b）绵羊红细胞悬液的制备：取适量绵羊抗凝血，用适量Hank’s液洗涤3次，1500r/min离心3-5min，弃上清，加Hank’s液稀释并计数，使绵羊红细胞最终浓度为脱E受体淋巴细胞悬液的8-10倍；

[0133] c）供试品的制备：取供试品，用Hank’s液配成每1.0mL中含0.5mg多肽的溶液；

[0134] d）取6支小试管，其中3支各加Hank’s液0.1ml作对照管，另3支各加供试品0.1mL作测定管，每管中各加脱E受体淋巴细胞悬液0.2mL，37℃保温1h后，加入绵羊红细胞悬液0.2mL，摇匀，以500r/min离心3min，放入4℃冰箱过夜，次日取出，吸弃上清液，每管中各加入固定液1滴，轻轻摇匀，静置10min，滴加染色液2滴并摇匀，静置15min开始计数（采用血细胞计数板），共数计数板16大方格上所有淋巴细胞的个数（不少于200个），统计其中的E玫瑰花结形成的淋巴细胞数（结合3个以上绵羊红细胞的淋巴细胞），求得结花百分率，取平均值，即为供试品管或对照管的E玫瑰花结百分率平均值；

[0135] 样品管淋巴细胞玫瑰花结百分率与对照管之差应不低于10.0%；

[0136] K.安全检验

[0137] a)热原质检验：采用体重1.7-3.0Kg健康家兔（雌兔应无孕）3只，单独饲养2日，无异常；每隔30min测体温1次，测2次，两次温差不超过0.2℃，以此两次的体温的平均值作为该兔的正常体温；当日使用的家兔，正常体温在38.0-39.6℃的范围内，且各兔间正常体温之差不超过1℃；试验用的注射器、针头及一切与本品接触的器皿，应灭热原；家兔在测定其正常体温15min内，自耳静脉缓缓注入规定剂量（注射量为每公斤体重0.5mL）温热至约38℃的本品，然后每隔30min测温一次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔升高的体温（当家兔升温为负值时，均以0℃计）；3只家兔体温升高的温度均应低于0.6℃，且3只家兔体温升高总和应低于1.4℃；

[0138] b)用鸡检验：用1日龄SPF雏鸡10只，将本品用无菌生理盐水稀释10倍后，每只鸡口服1mL，24h重复口服一次，观察5日；雏鸡应全部健活，且精神、采食、饮水、羽毛、粪便应均无异常；

[0139] c)异常毒性检验：用体重18-22g健康小鼠5只，每只小鼠腹腔注射本品0.5mL，观察7日；小鼠应全部健活，且精神、采食、饮水、羽毛、粪便应均无异常；

[0140] d)动物过敏检验：用体重250-350g健康豚鼠6只，隔日每只每次腹腔注射本品1.0mL，共3次，进行致敏；然后将其均分为2组，每组3只，分别在首次注射后第14日和第21日，由肌肉注射本品1.0mL进行攻击；每日观察每只动物的行为和体征；观察攻击后
30min内，动物无竖毛、呼吸困难、抽搐等过敏反应症状；肌肉注射本品2h内，不得出现过敏反应；如有竖毛、喷嚏、干呕、连续咳嗽3声或呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现抽搐、休克、死亡现象之一者，判本品不符合规定。

[0141] 进一步，本发明所述的猪疫苗为猪瘟疫苗、猪伪狂犬病疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪乙型脑炎病疫苗、猪细小病毒病疫苗、猪口蹄疫疫苗、猪圆环病疫苗、猪传染性胃肠炎疫苗、猪流行性腹泻疫苗中一种或几种。

[0142] 进一步，所述的步骤11）超滤后和步骤12）灭活前，将猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品经1-3KD盒式膜包进行切向流纳滤，使纳滤截留物体积达到转移因子粗制品体积的1/6-1/1.1倍，收集纳滤截留物即为高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品。

[0143] 所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的用途有以下几种：

[0144] 第一种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子1-6mL免疫每头猪。

[0145] 第二种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为稀释液，用2-6mL稀释液稀释一种与步骤1）中猪体内猪疫苗抗体阳性相对应的猪弱毒疫苗1-3头份，稀释后的猪弱毒疫苗分别免疫每头猪。

[0146] 第三种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为免疫佐剂，用0.05-0.1mL免疫佐剂混合一种与步骤1）中猪体内猪疫苗抗体阳性相对应的猪弱毒疫苗病毒液1-3头份，加入冻干保护剂后冻干，制成冻干猪弱毒疫苗，使用前将其稀释，分别免疫每头猪。

[0147] 第四种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为免疫佐剂，用0.1-0.5mL免疫佐剂混合一种与步骤1）中猪体内猪疫苗抗体阳性相对应的猪灭活疫苗病毒液1-3头份，再加入其他佐剂，制成猪灭活疫苗，分别免疫每头猪。

[0148] 实施例1

[0149] 猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法，其包括以下步骤：

[0150] 1)用白扁豆饲喂健康猪，用量为每头猪每天30g，饲喂18天，然后对饲喂白扁豆的健康猪免疫猪繁殖与呼吸综合征疫苗3次以上，相邻2次免疫猪繁殖与呼吸综合征疫苗的时间间隔为7天，最后一次免疫猪繁殖与呼吸综合征疫苗后28天，检测猪繁殖与呼吸综合征抗体，选取猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性的猪屠宰，收获猪脾脏；

[0151] 2)低温保藏：收获的猪脾脏立即保存于-40℃，保存时间不超过20天；

[0152] 3)解冻猪脾脏：将低温保藏的猪脾脏经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后用纯化水洗3遍，弃去硬化、坏死的猪脾脏；

[0153] 4)去筋膜：解冻后去除猪脾脏表面的筋膜、脂肪组织，经注射用水洗3遍；

[0154] 5)绞碎：将经注射用水清洗过的猪脾脏放入绞肉机初绞1遍；

[0155] 6)匀浆：用HCl溶液将注射用水的pH值调节至4，与绞碎后的猪脾脏按重量比1:1混合，经胶体磨匀浆，得匀浆液；

[0156] 7)装瓶、储存：将匀浆液分装于无热源的瓶子后，立即保存于-40℃，保存时间不超过20天；

[0157] 8)反复冻融：将瓶装匀浆液经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后立即于-40℃冷冻，反复冻融3次；

[0158] 9)离心：将反复冻融后的匀浆液于4℃、5500r/min离心30min，收集上清液；

[0159] 10)微滤：将步骤9)得到的上清液采用0.1μm盒式膜包进行切向流微滤：当微滤透过物体积达到上清液体积的2/3时，对微滤截留物进行0.1倍恒体积透析，为使微滤截留物体积恒定，以与透过端流速相同的速度向微滤截留物补入注射用水，至微滤透过物体积增加了微滤截留物体积的0.1倍为止，收集微滤透过物即为澄清液；

[0160] 0.1μm盒式膜包的平均参数为：

[0161]

[0162] 11)超滤：将步骤10)得到的澄清液采用8KD盒式膜包进行切向流超滤：当超滤透过物体积达到澄清液体积的4/5时，对超滤截留物进行1倍恒体积透析，为使超滤截留物体积恒定，以与透过端流速相同的速度向超滤截留物补入注射用水，至超滤透过物体积增加了超滤截留物体积的1倍为止，收集超滤透过物即为猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品；再将猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品经1KD盒式膜包进行切向流纳滤，使纳滤截留物体积达到转移因子粗制品体积的1/2倍，收集纳滤截留物即为高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品；

[0163] 8KD盒式膜包的平均参数为：

[0164]

[0165] 12)灭活：将β-丙内酯与高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品，按体积比1：4000混匀，在4℃下80r/min的转速下灭活6h，灭活后置于37℃下水解2h；

[0166] 13)pH调节：将灭活后的高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的pH值调节至6.8，加入酚红；

[0167] 14)渗透压调节：将pH调节后的高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的渗透压调节至280mosm/kg；

[0168] 15)除菌：将渗透压调节后的高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品采用0.1μm的除菌过滤器除菌，即得高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子；

[0169] 16)质量检测：猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的性状为红色或淡红色透明液体，多肽含量不低于2.5mg/mL，核糖含量不低于50μg/mL，内毒素含量不超过10EU/mL，按照《中国兽药典》的要求进行检测后应无菌，pH值为6.8-7.2，渗透压值为280-320mosm/kg，磺基水杨酸蛋白质定性测定为阴性，鉴别检验中在250-260nm的波长处有最大吸收、OD260nm/OD280nm的比值应不低于1.9，脱E受体法效力检验不低于10.0%，安全检验合格，即为质量检测合格。

[0170] 所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的用途有以下几种：

[0171] 第一种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子2mL免疫每头猪。

[0172] 第二种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为稀释液，用2mL稀释液稀释猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗1头份，稀释后的猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗分别免疫每头猪。

[0173] 第三种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为免疫佐剂，用0.06mL免疫佐剂混合猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗病毒液1头份，加入冻干保护剂后冻干，制成冻干猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗，使用前将其稀释，分别免疫每头猪。

[0174] 第四种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为免疫佐剂，用0.2mL免疫佐剂混合猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗病毒液2头份，再加入其他佐剂，制成猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗，分别免疫每头猪。

[0175] 以上所述的免疫方式包括注射、滴鼻。

[0176] 实施例2

[0177] 猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法，其包括以下步骤：

[0178] 1)用白扁豆饲喂健康猪，用量为每头猪每天50g，饲喂21天，然后对饲喂白扁豆的健康猪依次免疫猪瘟疫苗、猪伪狂犬病疫苗，每种猪疫苗免疫3次以上，相邻两次免疫时间间隔为10天，最后一次免疫猪疫苗后20天，检测猪疫苗抗体，选取猪瘟或猪伪狂犬病抗体阳性的猪屠宰，收获猪脾脏；

[0179] 2)低温保藏：收获的猪脾脏立即保存于-80℃，保存时间不超过20天；

[0180] 3)解冻猪脾脏：将低温保藏的猪脾脏经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后用纯化水洗5遍，弃去硬化、坏死的猪脾脏；

[0181] 4)去筋膜：解冻后去除猪脾脏表面的筋膜、脂肪组织，经注射用水洗4遍；

[0182] 5)绞碎：将经注射用水清洗过的猪脾脏放入绞肉机初绞2遍；

[0183] 6)匀浆：用HCl溶液将注射用水的pH值调节至5，与绞碎后的猪脾脏按重量比1.5:1混合，经胶体磨匀浆，得匀浆液；

[0184] 7)装瓶、储存：将匀浆液分装于无热源的瓶子后，立即保存于-80℃，保存时间不超过20天；

[0185] 8)反复冻融：将瓶装匀浆液经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后立即于-80℃冷冻，反复冻融6次；

[0186] 9)离心：将反复冻融后的匀浆液于4℃、6000r/min离心20min，收集上清液；

[0187] 10)微滤：将步骤9)得到的上清液采用0.22μm盒式膜包进行切向流微滤：当微滤透过物体积达到上清液体积的3/4时，对微滤截留物进行0.6倍恒体积透析，为使微滤截留物体积恒定，以与透过端流速相同的速度向微滤截留物补入注射用水，至微滤透过物体积增加了微滤截留物体积的0.6倍为止，收集微滤透过物即为澄清液；

[0188] 0.22μm盒式膜包的平均参数为：

[0189]

[0190] 11)超滤：将步骤10)得到的澄清液采用5KD盒式膜包进行切向流超滤：当超滤透过物体积达到澄清液体积的6/7时，对超滤截留物进行2倍恒体积透析，为使超滤截留物体积恒定，以与透过端流速相同的速度向超滤截留物补入注射用水，至超滤透过物体积增加了超滤截留物体积的2倍为止，收集超滤透过物即为猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品；然后再将猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品经1KD盒式膜包进行切向流纳滤，使纳滤截留物体积达到转移因子粗制品体积的1/6倍，收集纳滤截留物即为高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品；

[0191] 5KD盒式膜包的平均参数为：

[0192]

[0193] 12)灭活：将β-丙内酯与高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品，按体积比1：50000混匀，在4℃下150r/min的转速下灭活12h，灭活后置于37℃下水解6h；

[0194] 13)pH调节：将灭活后的高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的pH值调节至7.0，加入酚红；

[0195] 14）渗透压调节：将pH调节后的高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的渗透压调节至300mosm/kg；

[0196] 15)除菌：将渗透压调节后的高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品采用0.1μm的除菌过滤器除菌，即得高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子；

[0197] 16)质量检测：猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的性状为红色或淡红色透明液体，多肽含量不低于2.5mg/mL，核糖含量不低于50μg/mL，内毒素含量不超过10EU/mL，按照《中国兽药典》的要求进行检测后应无菌，pH值为6.8-7.2，渗透压值为280-320mosm/kg，磺基水杨酸蛋白质定性测定为阴性，鉴别检验中在250-260nm的波长处有最大吸收、OD260nm/OD280nm的比值应不低于1.9，脱E受体法效力检验不低于10.0%，安全检验合格，即为质量检测合格。

[0198] 所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的用途有以下几种：

[0199] 第一种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子6mL免疫每头猪。

[0200] 第二种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为稀释液，用6mL稀释液稀释一种与步骤1）中猪体内猪疫苗抗体阳性相对应的猪弱毒疫苗2头份，稀释后的猪弱毒疫苗分别免疫每头猪。

[0201] 第三种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为免疫佐剂，用0.1mL免疫佐剂混合一种与步骤1）中猪体内猪疫苗抗体阳性相对应的猪弱毒疫苗病毒液3头份，加入冻干保护剂后冻干，制成冻干猪弱毒疫苗，使用前将其稀释，分别免疫每头猪。

[0202] 第四种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为免疫佐剂，用0.5mL免疫佐剂混合一种与步骤1）中猪体内猪疫苗抗体阳性相对应的猪灭活疫苗病毒液2头份，再加入其他佐剂，制成猪灭活疫苗，分别免疫每头猪。

[0203] 以上所述的免疫方式包括注射、滴鼻、喷雾等。

[0204] 实施例3

[0205] 猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法，其包括以下步骤：

[0206] 1)用白扁豆饲喂健康猪，用量为每头猪每天60g，饲喂30天，然后对饲喂白扁豆的健康猪依次免疫猪瘟疫苗、猪伪狂犬病疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪乙型脑炎病疫苗、猪细小病毒病疫苗、猪口蹄疫疫苗、猪圆环病疫苗、猪传染性胃肠炎疫苗、猪流行性腹泻疫苗，每种猪疫苗免疫2次以上，相邻两次免疫时间间隔为7天，最后一次免疫猪疫苗后28天，检测猪疫苗抗体，选取猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪乙型脑炎病、猪细小病毒病、猪口蹄疫、猪圆环病、猪传染性胃肠炎或猪流行性腹泻抗体阳性的猪屠宰，收获猪脾脏；

[0207] 2)低温保藏：收获的猪脾脏立即保存于-60℃，保存时间不超过20天；

[0208] 3)解冻猪脾脏：将低温保藏的猪脾脏经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后用纯化水洗4遍，弃去硬化、坏死的猪脾脏；

[0209] 4)去筋膜：解冻后去除猪脾脏表面的筋膜、脂肪组织，经注射用水洗5遍；

[0210] 5)绞碎：将经注射用水清洗过的猪脾脏放入绞肉机初绞1遍；

[0211] 6)匀浆：用HCl溶液将注射用水的pH值调节至6，与绞碎后的猪脾脏按重量比2:1混合，经胶体磨匀浆，得匀浆液；

[0212] 7)装瓶、储存：将匀浆液分装于无热源的瓶子后，立即保存于-40℃，保存时间不超过20天；

[0213] 8)反复冻融：将瓶装匀浆液经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后立即于-40℃冷冻，反复冻融5次；

[0214] 9)离心：将反复冻融后的匀浆液于4℃、8000r/min离心15min，收集上清液；

[0215] 10)微滤：将步骤9)得到的上清液采用0.45μm盒式膜包进行切向流微滤：当微滤透过物体积达到上清液体积的2/3时，对微滤截留物进行1倍恒体积透析，为使微滤截留物体积恒定，以与透过端流速相同的速度向微滤截留物补入注射用水，至微滤透过物体积增加了微滤截留物体积的1倍为止，收集微滤透过物即为澄清液；

[0216] 0.45μm盒式膜包的平均参数为：

[0217]

[0218] 11)超滤：将步骤10)得到的澄清液采用10KD盒式膜包进行切向流超滤：当超滤透过物体积达到澄清液体积的6/7时，对超滤截留物进行2.5倍恒体积透析，为使超滤截留物体积恒定，以与透过端流速相同的速度向超滤截留物补入注射用水，至超滤透过物体积增加了超滤截留物体积的2.5倍为止，收集超滤透过物即为猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品；然后将猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品经3KD盒式膜包进行切向流纳滤，使纳滤截留物体积达到转移因子粗制品体积的1/1.1倍，收集纳滤截留物即为高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品；

[0219] 10KD盒式膜包的平均参数为：

[0220]

[0221] 12)灭活：将β-丙内酯与高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品，按体积比1：100000混匀，在4℃下200r/min的转速下灭活24h，灭活后置于37℃下水解8h；

[0222] 13)pH调节：将灭活后的高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的pH值调节至7.2；

[0223] 14)渗透压调节：将pH调节后的高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的渗透压调节至320mosm/kg；

[0224] 15)除菌：将渗透压调节后的高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品采用0.1μm的除菌过滤器除菌，即得高浓度猪疫苗特异性猪脾脏转移因子；

[0225] 16)质量检测：猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的性状为微黄色或黄色透明液体，多肽含量不低于2.5mg/mL，核糖含量不低于50μg/mL，内毒素含量不超过10EU/mL，按照《中国兽药典》的要求进行检测后应无菌，pH值为6.8-7.2，渗透压值为280-320mosm/kg，磺基水杨酸蛋白质定性测定为阴性，鉴别检验中在250-260nm的波长处有最大吸收、OD260nm/OD280nm的比值应不低于1.9，脱E受体法效力检验不低于10.0%，安全检验合格，即为质量检测合格。

[0226] 所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的用途有以下几种：

[0227] 第一种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子3mL免疫每头猪。

[0228] 第二种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为稀释液，用6mL稀释液稀释一种与步骤1）中猪体内猪疫苗抗体阳性相对应的猪弱毒疫苗3头份，稀释后的猪弱毒疫苗分别免疫每头猪。

[0229] 第三种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为免疫佐剂，用0.09mL免疫佐剂混合一种与步骤1）中猪体内猪疫苗抗体阳性相对应的猪弱毒疫苗病毒液3头份，加入冻干保护剂后冻干，制成冻干猪弱毒疫苗，使用前将其稀释，分别免疫每头猪。

[0230] 第四种：将所述的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子作为免疫佐剂，用0.3mL混合一种与步骤1）中猪体内猪疫苗抗体阳性相对应的猪灭活疫苗病毒液3头份，再加入其他佐剂，制成猪灭活疫苗，分别免疫每头猪。

[0231] 以上所述的免疫方式包括注射、饮水、拌料、滴鼻、喷雾等。

[0232] 将本发明制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子与现有转移因子进行对比试验。其中，以下试验中所用到的现有转移因子均是按专利号为201110126248.9，专利名称为《一种猪脾转移因子注射液的生产方法》的中国发明专利进行制备的转移因子。

[0233] A、本发明实施例1制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子与现有转移因子进行增强猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗免疫保护力的对比实验

[0234] 疫苗与毒株为：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）CH-1R弱毒冻干疫苗病毒含量6.0 5.0
为10 TCID50/头份；高致病性PRRSV（HP-PRRSV）TJ-F5株病毒含量为3×10 TCID50/mL。

[0235] 实验动物：选取PRRSV、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪伪狂犬病毒（PRV）抗原与抗体均为阴性的、日龄相同、体重相近、2窝健康检验用仔猪共20头，免疫前在全排风正压恒温恒湿检验猪舍同居饲养，34日龄免疫接种后在全排风正压恒温恒湿检验猪舍隔离饲养，62日龄转至全排风负压恒温恒湿检验猪舍隔离攻毒饲养。

[0236] 实验设计：34日龄，将20头实验猪随机分为4组（如表1所示）。免疫CH-1R弱毒疫苗后28d，4个组都用HP-PRRSV TJ-F5株攻毒，每日观察临床症状，攻毒后第28d结束实验，剖检实验猪，观察剖检变化。

[0237] 表1实验设计

[0238]

[0239] 临床症状及疫苗保护率分析：免疫后，4组实验猪都无应激无不良反应。攻毒后，D组临床症状表现为聚堆、喜卧、食欲下降、呼吸困难、咳嗽、眼结膜炎、分泌黏性鼻液、拉稀、消瘦等，于11、12、13、14分别死亡2头、1头、1头、1头；A组临床症状表现为嗜睡、聚堆、喜卧、食欲下降、呼吸困难、咳嗽、分泌黏性鼻液、拉稀、消瘦等，于14和15d分别死亡3头、1头，余下1头16d后好转；C组于3～15d表现为嗜睡、聚堆、喜卧、食欲下降、分泌黏性鼻液、拉稀等，于16和17d分别死亡1头、2头，余下2头17d后好转；B组，仅1头猪表现喜卧等轻微一过性反应（于第20d死亡），其余猪食欲及精神状态始终良好（具体如图1所示）。

[0240] 实验动物剖检变化分析：攻毒后，B组腹股沟淋巴结轻微肿大，肺脏轻微小叶性肺炎；C组腹股沟淋巴结肿大出血，肺肿胀、局部轻微实变、轻度度小叶性肺炎，胃底黏膜出血；A组腹股沟淋巴结肿大出血，颌下淋巴结肿大，肺肿胀、局部轻微实变、淤血、中度小叶性肺炎，肺间质增宽，胃底黏膜出血；D组淋巴结肿大出血，肺肿胀、尖叶及心叶出现片状实变，肺有肉样变、淤血、间质增宽，胃底黏膜出血。

[0241] 本实验结果表明，CH-1R弱毒疫苗对HP-PRRSV TJ-F5株的交叉保护率为40%，本发明实施例1制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子与CH-1R弱毒疫苗联合免疫对HP-PRRSVTJ-F5株的交叉保护率达到80%，而现有转移因子与CH-1R弱毒疫苗联合免疫对HP-PRRSVTJ-F5株的交叉保护率为20%。且攻毒后实验猪的临床症状及剖检病变，B组轻微；C组较B组严重；而A组较B、C组严重，但比D组明显减轻。

[0242] 实验结果显示CH-1R弱毒疫苗与本发明实施例1制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子联合免疫的免疫效果明显优于与现有转移因子联合免疫。

[0243] B、本发明实施例2制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子对猪瘟疫苗的免疫增效试验

[0244] 现有脾转移因子按专利号为201110126248.9，专利名称为《一种猪脾转移因子注射液的生产方法》的中国发明专利进行制备的转移因子。本发明实施例2制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子与现有脾转移因子对猪瘟疫苗的免疫增效试验。

[0245] 诊断试剂：猪瘟正向间接血凝诊断液、阳性血清、阴性血清、稀释液，由中国农科院兰州兽医研究所提供。

[0246] 动物分组及处理：将未免猪瘟疫苗、日龄相同、体重接近的健康仔猪60头，随机分为3组，每组20头，在35d、75d分别进行猪瘟疫苗的首免、二免，猪瘟疫苗首免及二免的剂量分别为1头份/猪、2头份/猪。A组使用本发明实施例2制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子稀释猪瘟疫苗，首免为2mL转移因子+猪瘟疫苗1头份/猪，二免为4mL转移因子+猪瘟疫苗2头份/猪；B组使用现有脾转移因子稀释猪瘟疫苗，首免为2mL转移因子+猪瘟疫苗1头份/猪，二免为4mL转移因子+猪瘟疫苗2头份/猪；C组使用生理盐水稀释猪瘟疫苗，首免为2mL生理盐水+猪瘟疫苗1头份/猪，二免为4mL生理盐水+猪瘟疫苗2头份/猪。分别在免疫前3d、首免后7、14、21d及二免后7、14、21、28、60d进行采血，分离血清，检测猪瘟IHA抗体效价。所得数据用单因素方差分析和最小显著性差法（LSD）分析，P<0.05为差异显著。

[0247] 抗体效价监测：依据《猪瘟诊断技术规程》SY/T007-2000，采用正向间接血凝试验(IHA)。

[0248] 结果与分析：猪瘟疫苗首免及二免后28d内，3组的IHA抗体效价逐渐增加，效价由高至低依次为A、C、B组，A组于首免21d后显著高于其他组(P<0.05)，C组于二免14d后显著高于B组(P<0.05)，结果如表2所示。试验结果可知，本发明实施例2制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子对猪瘟疫苗的免疫具有增效效果，且效果优于现有转移因子。

[0249] 表2免疫增效试验猪瘟IHA抗体监测结果（单位：log2）

[0250]组别 免疫前首免后 二免后

[0251]3d 7d 14d 21d 7d 14d 21d 28d 60d
A组 4.45a 4.90a 5.85a 6.75a 7.30a 7.85a 8.25a 8.80a 8.10a
B组 4.55a 4.60a 4.80a 4.90b 5.05b 5.25b 5.50b 5.95b 5.45b
C组 4.50a 4.65a 5.00a 5.35b 5.55b 5.85c 6.15c 6.95c 6.30c

[0252] 注：数据上标字母相同表示差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(P<0.05)。

[0253] C、本发明实施例3制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子提高T淋巴细胞增殖率试验

[0254] 现有脾转移因子按专利号为201110126248.9，专利名称为《一种猪脾转移因子注射液的生产方法》的中国发明专利进行制备的转移因子。本发明实施例3制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子与现有转移因子进行提高T淋巴细胞增殖率试验。

[0255] 试验动物：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪伪狂犬病毒（PRV）抗原与抗体均为阴性的同窝健康检验用仔猪15头，购自福州郊区某猪场，隔离饲养于全排风正压恒温恒湿检验猪舍。

[0256] 动物分组及处理：实验前3d，采血进行猪外周血T淋巴细胞增殖试验。21日龄时实验猪随机分为3组开始实验，每组各5头实验猪，分别为对照组（每头猪肌肉注射2mL现有转移因子）、实验组（每头猪肌肉注射2mL本发明实施例3制备的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子）和空白组（每头猪肌肉注射2mL生理盐水）。注射后1、3、5、7、14、21和28d采血进行猪外周血T淋巴细胞增殖试验。所得数据（刺激指数（SI值））用单因素方差分析和最小显著性差法（LSD）分析，P<0.05为差异显著。

[0257] 外周血T淋巴细胞增殖率检测：经预试验确定检测方案，将分离的淋巴细胞用完全RPMI-1640配制成原始浓度为1×106个/mL的细胞悬液。在96孔细胞培养板上，每组设试验孔（淋巴细胞悬液100uL；25ug/mL PHA-P100uL)、对照孔(淋巴细胞悬液100uL；完全RPMI-1640培养基100uL)、空白孔(完全RPMI-1640培养基200uL)各5孔。置5%C02培养箱中37℃培养44h，再向各孔加入5mg/mL MTT溶液20ul，继续培养4h，取出后小心吸净上清液，每孔加入二甲基亚飒100ul溶解细胞，微型振荡器震荡混匀，避光放置10min，以490nm为测量波长，以630nm为参考波长，测得OD值。淋巴细胞转化水平以SI值表示即：

[0258] SI=（试验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值），计算各组SI值。

[0259] 结果与分析：注射转移因子能显著提高猪外周血T淋巴细胞的转化率(P<0.05)，SI值由高至低依次为实验组、对照组、空白组，实验组于注射3d后显著高于其他组(P<0.05)，对照组于注射后第7、14d显著高于空白组(P<0.05)，结果如表3所示。实验结果表明，本发明实施例3制备的转移因子能增强猪的细胞免疫功能，且效果优于现有转移因子。

[0260] 表3淋巴细胞转化率(SI值)

[0261]

[0262] 注：数据上标字母相同表示差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(P<0.05)。