多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物及其制备方法

摘要

多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物及其制备方法，将模板分子、功能单体混合溶解在致孔剂中，超声混匀，形成模板分子－功能单体复合物，再加入有效量的引发剂、交联剂，超声通氮气后密封；在氮气保护下，分子印迹聚合物采用热引发，置于振荡培养箱中进行聚合反应；聚合反应结束后，所得到的分子印迹聚合物用甲醇-冰醋酸进行洗脱，除去模板分子，再用甲醇洗至中性，然后真空干燥，得到多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物。本发明所制备的沉淀分子印迹聚合物微球，具有单分散性好、粒径均一、大小可控，制备简单、产率高等优点。减少了结合位点和印迹空穴的破坏，保证了聚合物对模板分子的高亲和力和高选择性。

权利要求

1.多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物，其特征在于由以下步骤制得： 将

348.5 mg人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的混合物，三者摩尔比为44:43:13，和

2.00 mmol功能单体AM溶于40 mL乙醇溶剂中，超声10 min溶解，预聚合2～4 h；再加入

10.00 mmol交联剂EGDMA和74.20 mg引发剂AIBN，超声10 min溶解；混合后的溶液通氮气10 min，恒温摇床升温至60 ℃，200 rpm聚合24 h；离心收集并以体积比9:1的甲醇-冰醋酸进行洗脱，除去模板分子，直到紫外分光光度仪在204 nm处检测不出模板分子，再用甲醇洗至中性，然后45 ℃真空干燥24 h，即得多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物。

2.多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于制备步骤为：

将348.5 mg人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的混合物，三者摩尔比为44:43:13，和2.00 mmol功能单体AM溶于40 mL乙醇溶剂中，超声10 min溶解，预聚合2～4 h；再加入10.00 mmol交联剂EGDMA和74.20 mg引发剂AIBN，超声10 min溶解；混合后的溶液通氮气10 min，恒温摇床升温至60 ℃，200 rpm聚合24 h；离心收集并以体积比9:1的甲醇-冰醋酸进行洗脱，除去模板分子，直到紫外分光光度仪在204 nm处检测不出模板分子，再用甲醇洗至中性，然后45 ℃真空干燥24 h，即得多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物。

说明书

多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种分子印迹聚合物的制备方法，尤其涉及一种多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 三七为五加科植物三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)的干燥根及根茎，具有增强机体功能、增加冠脉血流量、扩张血管、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集、降低血粘度等作用，是我国传统的珍贵药材之一。三七的主要有效成分是三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1，其中人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量较高。自古因其功效卓著颇受众多医家推崇，被誉为金疮杖疮之圣药，更是驰名中外“云南白药”的主要组成部分。自20世纪70年代以来，人们对三七单味药及其复方的化学成分、药理作用进行了大量的研究工作，然而由于三七所含成分复杂，且含量低，传统的分离方法如吸附树脂、活性炭等纯化三七活性皂苷，步骤繁多，操作繁琐，选择性差、分离效率低且重现性差，产品质量难以准确控制，严重影响了临床的用药安全，也是目前制约三七注射剂发展的瓶颈性问题。因此迫切需要一种高效分离三七活性皂苷的新方法。

[0003] 分子印迹技术是模仿“抗原-抗体”识别原理发展的一种特异性识别目标分子的技术。它以欲识别的分子为模板，通过共价或非共价键的方式与特定的功能单体用交联剂结合生成聚合物，然后用特定的溶剂将模板分子洗脱，得到具有特异性识别位点的分子印迹聚合物（molecular imprinted polymers，MIPs），从而对模板分子及其结构类似物表现出高度的特异性识别性能。由于分子印迹技术操作简单，对目标分子的特异性识别能力强，近年来在越来越多的领域广泛应用，并取得良好效果。应用多模板分子印迹聚合物来分离纯化三七活性皂苷的研究，尚未见文献报道。

发明内容

[0004] 解决的技术问题：本发明提供一种多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物及其制备方法，从而克服现有分离纯化技术的不足，使其能够简单、快速、特异性地吸附三七活性皂苷分子，实现对三七药材提取物中化学成分的选择性分离、高效富集。

[0005] 技术方案：多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物，由以下步骤制得：

[0006] 1)将模板分子、功能单体混合溶解在致孔剂中，超声混匀，静置2～4h，形成模板分子－功能单体复合物，再加入有效量的引发剂、交联剂，超声5～10min，通氮气5～10min，密封；其中，模板分子与功能单体的摩尔比为1:2～1:6，功能单体与交联剂的摩尔比为1:1～1:6；致孔剂的体积用量与模板分子的摩尔量之比为25～150ml/mmol；引发剂的用量是模板分子、功能单体和交联剂总质量的3%～5%；

[0007] 2)在氮气保护下，分子印迹聚合物采用热引发，置于振荡培养箱中进行聚合反应，培养箱转速为100r/min～300r/min，聚合温度为50℃～70℃，聚合反应时间为20～36h；

[0008] 3)聚合反应结束后，所得到的分子印迹聚合物用甲醇-冰醋酸进行洗脱，除去模板分子，再用甲醇洗至中性，然后45℃真空干燥12～24h，得到多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物。

[0009] 多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物的制备方法，制备步骤为：

[0010] 1)将模板分子、功能单体混合溶解在致孔剂中，超声混匀，静置2～4h，形成模板分子－功能单体复合物，再加入有效量的引发剂、交联剂，超声5～10min，通氮气5～10min，密封；其中，模板分子与功能单体的摩尔比为1:2～1:6，功能单体与交联剂的摩尔比为1:1～1:6；致孔剂的体积用量与模板分子的摩尔量之比为25～150ml/mmol；引发剂的用量是模板分子、功能单体和交联剂总质量的3%～5%；

[0011] 2)在氮气保护下，分子印迹聚合物采用热引发，置于振荡培养箱中进行聚合反应，培养箱转速为100r/min～300r/min，聚合温度为50℃～70℃，聚合反应时间为20～36h；

[0012] 3)聚合反应结束后，所得到的分子印迹聚合物用甲醇-冰醋酸进行洗脱，除去模板分子，再用甲醇洗至中性，然后45℃真空干燥12～24h，得到多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物。

[0013] 所述的模板分子为人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1和三七皂苷R1，三者摩尔比为44:43:13。

[0014] 所述的功能单体为丙烯酰胺、甲基丙烯酸、烯丙基脲或4-乙烯基吡啶。

[0015] 所述的引发剂为偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰。

[0016] 所述的致孔剂为四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈、正丁醇、甲醇或乙醇。

[0017] 所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。

[0018] 所述甲醇-冰醋酸溶液的体积比为甲醇:冰醋酸=9:1。

[0019] 有益效果：其一：三七药材中存在的化合物结构非常相似，且含量低、干扰大，非选择性的分析材料很难对其进行分离纯化。本发明合成的多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物为药材中活性成分的高亲和力、高选择性分离提供了可能。

[0020] 其二：本发明所制备的沉淀分子印迹聚合物微球，与传统的本体分子印记聚合物相比较，具有单分散性好、粒径均一、大小可控，制备简单、产率高等优点。并且不需要碾磨，过筛等复杂的后处理过程，减少了结合位点和印迹空穴的破坏，保证了聚合物对模板分子的高亲和力和高选择性。

附图说明

[0021] 图1是实施例3合成的多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物的透射电镜图，其中■MIP，●NIP；

[0022] 图2是实施例3合成的多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物的动态吸附曲线，其中■MIP，●NIP；

[0023] 图3是实施例3合成的多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物的静态吸附曲线，其中■MIP，●NIP。

具体实施方式

[0024] 下面结合实施例对本发明做进一步说明。

[0025] 丙烯酰胺(AM)

[0026] 烯丙基脲(AU)

[0027] 甲基丙烯酸(MAA)

[0028] 4-乙烯基吡啶(4-VP)

[0029] 三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)

[0030] 乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)

[0031] 四氢呋喃(THF)

[0032] N，N-二甲基甲酰胺(DMF)

[0033] 偶氮二异丁腈(AIBN)

[0034] 实施例1：

[0035] 将348.5mg人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的混合物（三者摩尔比为44:43:13）和1.00mmol功能单体MAA溶于25mL DMF溶剂中，超声10min溶解，预聚合2～
4h。再加入6.00mmol交联剂EGDMA和48.72mg引发剂AIBN，超声10min溶解。混合后的溶液通氮气10min，恒温摇床升温至60℃，300rpm聚合24h。

[0036] 离心收集并以甲醇-冰醋酸进行洗脱（v/v，9:1），除去模板分子，直到紫外分光光度仪在204nm处检测不出模板分子，再用甲醇洗至中性，然后45℃真空干燥12h，即得多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物（MIP-1）。

[0037] 除合成过程中不添加模板分子三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1以外，其余步骤均与印迹聚合物制备步骤相同，得到非印迹聚合物（NIP-1）。

[0038] 实施例2：

[0039] 将348.5mg人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的混合物（三者摩尔比为44:43:13）和1.50mmol功能单体AU溶于30mL THF溶剂中，超声10min溶解，预聚合2～
4h。再加入6.00mmol交联剂TRIM和75.88mg引发剂AIBN，超声5min溶解。混合后的溶液通氮气10min，恒温摇床升温至50℃，200rpm聚合36h。

[0040] 离心收集并以甲醇-冰醋酸进行洗脱（v/v，9:1），除去模板分子，直到紫外分光光度仪在204nm处检测不出模板分子，再用甲醇洗至中性，然后45℃真空干燥24h，即得多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物（MIP-2）。

[0041] 除合成过程中不添加模板分子三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb以外，其余步骤均与印迹聚合物制备步骤相同，得到非印迹聚合物（NIP-2）。.

[0042] 实施例3：

[0043] 将348.5mg人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的混合物（三者摩尔比为44:43:13）和2.00mmol功能单体AM溶于40mL乙醇溶剂中，超声10min溶解，预聚合2～
4h。再加入10.00mmol交联剂EGDMA和74.20mg引发剂AIBN，超声10min溶解。混合后的溶液通氮气10min，恒温摇床升温至60℃，200rpm聚合24h。

[0044] 离心收集并以甲醇-冰醋酸进行洗脱（v/v，9:1），除去模板分子，直到紫外分光光度仪在204nm处检测不出模板分子，再用甲醇洗至中性，然后45℃真空干燥24h，即得多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物（MIP-3）。

[0045] 除合成过程中不添加模板分子三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1以外，其余步骤均与印迹聚合物制备步骤相同，得到非印迹聚合物（NIP-3）。

[0046] 实施例4：

[0047] 将348.5mg人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的混合物（三者摩尔比为44:43:13）和2.00mmol功能单体4-VP溶于50mL乙醇溶剂中，超声10min溶解，预聚合2～
4h。再加入9.00mmol交联剂TRIM和180.21mg引发剂AIBN，超声10min溶解。混合后的溶液通氮气5min，恒温摇床升温至70℃，100rpm聚合36h。

[0048] 离心收集并以甲醇-冰醋酸进行洗脱（v/v，9:1），除去模板分子，直到紫外分光光度仪在204nm处检测不出模板分子，再用甲醇洗至中性，然后45℃真空干燥12h，即得多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物（MIP-4）。

[0049] 除合成过程中不添加模板分子三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1以外，其余步骤均与印迹聚合物制备步骤相同，得到非印迹聚合物（NIP-4）。

[0050] 测试实施例：

[0051] 取上述实施例3中合成的分子印迹聚合物及非印迹聚合物进行如下测试实验。

[0052] 测试实施例1.透射电镜

[0053] 图1是本发明合成的多模板单分散三七活性皂苷分子印迹聚合物的透射电镜图，可见，制备的印迹聚合物微球粒度均匀，单分散性好。

[0054] 测试实施例2.动态吸附试验

[0055] 精密称取MIP与NIP（20.0mg）各5份，置于15mL三角瓶中，分别分散在5mL，2.5mmol/L的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的乙醇混合溶液中，室温振摇。分别在1，2，3，4和5h时取上清液，0.22μm尼龙膜滤过，取续滤液稀释定容，紫外-可见分光光度仪于204nm处测定吸附前后样品的浓度，根据式（1）计算出平衡吸附量Qe，平行操作三次。

[0056]

[0057] 式中：C0和Ce分别为模板分子的起始浓度和平衡浓度(mmol/L)；V为吸附溶液的体积(mL)；m为印记聚合物的质量(g)。

[0058] 从图2可以看出，随着吸附时间的增加，印迹材料对印迹分子的吸附量不断上升，4h后基本达到吸附平衡。实验表明，印迹材料具有较快的吸附速率，而传统的本体聚合制备的MIP吸附平衡时间一般为12～24h。其原因是本发明采用沉淀聚合合成的分子印迹聚合物单分散性好、粒径均一、印迹位点分布均匀，而且避免了本体聚合研磨时印迹位点的破坏。

[0059] 测试实施例3.静态吸附试验

[0060] 精密称取MIP与NIP（20.0mg）各5份，置于15mL三角瓶中，分别加入1.0mmol/L，1.5mmol/L，2.0mmol/L，2.5mmol/L和3.0mmol/L三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的乙醇混合溶液5mL，超声分散，室温振摇4h，取上清液，0.22μm尼龙膜滤过，取续滤液稀释定容，紫外-可见分光光度仪于204nm处测定各样品的浓度，根据式（1）计算出平衡吸附量Qe，平行操作三次。

[0061] 从图3可以看出，MIP的最大吸附量远大于NIP，表明MIP对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的吸附不同于物理吸附，而是一种有特异性识别位点的选择性吸附，这种分子识别特性来自于该聚合物的结合基团与模板分子的功能基之间的氢键作用和空穴的几何选择性。

[0062] 上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。