本发明涉及筛选反硝化真菌的方法，特别涉及一种筛选专性好氧反硝化真菌的方法，所述方法包括富集专性好氧反硝化真菌培养基的制备、涂布培养、纯化培养、鉴定包括好氧反硝化能力鉴定、专性好氧菌鉴定、分子生物学鉴定。通过多次重复培养、筛选，得到三种专性好氧反硝化真菌，将获得的菌应用去除水体中的硝酸盐，在28小时内的硝酸盐去除率分别达到85.25%、88.51%和89.54%，这不仅是对好氧反硝化菌属种类的补充，而且可以为好氧反硝化技术在实际水环境中的除氮应用提供更广阔的空间。
1.一种筛选专性好氧反硝化真菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）：富集专性好氧反硝化真菌培养基的制备：所述培养基每升包括溴百里酚蓝
0.01-0.02克、琼脂18-25克、葡萄糖酸钠为5-10克、硝酸钠和亚硝酸钠混合物为1.8-2.4克，所述硝酸钠：亚硝酸钠=1：0.5、磷酸二氢钠1-2.0克、氯化钙0.01-0.03克、硫酸镁
0.01-0.02克、碳酸氢钠0.2-0.5克、硫酸亚铁0.01-0.02克、硫酸锰0.01-0.02克、硫酸锌
0.01-0.03克、氯化铜0.01-0.03克、硫酸钴0.01-0.02克；将除溴百里酚蓝外的各成分分别加入到一起并混合均匀，灭菌；将溴百里酚蓝溶于无水乙醇中，在无菌条件下将其加入到上述灭菌后的培养基中并再次混合均匀，制成富集专性好氧反硝化真菌培养基平板；
步骤（2）：涂布培养：将待筛选的反硝化真菌混合液均匀的涂布到步骤（1）中制备的富集专性好氧反硝化真菌培养基的平板上；在保持氧气充足的条件下，30℃下倒置培养7-10天，直至培养基颜色从绿变蓝；
步骤（3）：挑取步骤（2）培养基中由绿变蓝的绒毛状菌株，再次在步骤（1）所制备的培养基上划线分离，在保持氧气充足的条件下，30℃下倒置培养7-10天；重复上述过程，直至富集专性好氧反硝化真菌培养基上出现的蓝色菌株清晰、外形一致、无伴生菌和杂菌，为止。
2.根据权利要求1所述的筛选专性好氧反硝化真菌的方法，其特征在于步骤（1）所述的富集专性好氧反硝化真菌培养基的制备：所述培养基每升包括溴百里酚蓝0.015克；琼脂22克；葡萄糖酸钠为8克；硝酸钠和亚硝酸钠混合物为2.0克，所述硝酸钠：亚硝酸钠=1：0.5；磷酸二氢钠1.8克；氯化钙0.02克；硫酸镁0.01克；碳酸氢钠0.4克；硫酸亚铁
0.015克、硫酸锰0.015克、硫酸锌0.02克、氯化铜0.01克、硫酸钴0.01克。
3.根据权利要求1所述的筛选专性好氧反硝化真菌的方法，其特征在于，还包括步骤（4）专性好氧反硝化真菌的鉴定方法，包括好氧反硝化能力鉴定、专性好氧菌鉴定、分子生物学鉴定：步骤A：好氧反硝化能力鉴定
制备好氧反硝化性能鉴定培养基每升好氧反硝化性能鉴定培养基组成如下：硝酸钠
1-1.5克；磷酸二氢钾1-1.5克；葡萄糖酸钠5-10克；水90-120毫升；氯化钙0.01-0.03克；硫酸镁0.01-0.02克；碳酸氢钠0.2-0.5克；微量元素混合液：硫酸亚铁0.01-0.02克，硫酸锰0.01-0.02克，、硫酸锌0.01-0.03克、氯化铜0.01-0.03克，硫酸钴0.01-0.02克；
将上述组成依次加入到锥形瓶中，121℃灭菌20分钟；制备指示剂，所述指示剂组成成分如下：4-氨基苯磺酰胺20g，N-1-萘乙二胺盐酸盐1g，磷酸50mL，水250mL，稀释到 500mL；将菌株接种于所述的好氧反硝化性能鉴定培养基，在氧气充足的条件下，30℃下倒置培养3-5天后向培养基中加入指示剂，如培养基变红，则表明待测菌株具有好氧反硝化能力；
将步骤（A）鉴定后的菌株接种于专性好氧反硝化真菌培养基上，并转移到厌氧瓶中冲入氮气后密封；30℃下培养1个月；如菌株无生长迹象，说明该菌种为专性好氧菌；
将步骤（B）鉴定后的菌株分别进行DNA提取并进行PCR扩增，然后进行测序；分别使用GenBank中BLAST程序和MycoBank中的基因数据库与测序结果进行比对，并参照真菌鉴定手册，得到菌株的种属。
4.根据权利要求3所述的筛选专性好氧反硝化真菌的方法，其特征在于，步骤4中所述的好氧反硝化性能鉴定培养基每升所述培养基组成如下：硝酸钠1.3克、磷酸二氢钾1.3克、葡萄糖酸钠8克、水110毫升、氯化钙0.02克、硫酸镁0.01克、碳酸氢钠0.4克；微量元素混合液：硫酸亚铁0.015克、硫酸锰0.015克、硫酸锌0.01克、氯化铜0.015克，硫酸钴
一种筛选专性好氧反硝化真菌的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及筛选反硝化真菌的方法，特别涉及一种筛选专性好氧反硝化真菌的方法。
背景技术
[0002] 去除水体中的氮，对于控制水体富营养化起到关键作用。而在水体脱氮技术中，生物脱氮是一种高效、低成本的脱氮技术。传统意义上的生物脱氮依靠硝化细菌的硝化活动和反硝化细菌的反硝化活动。
[0003] 随着好氧反硝化现象得到科学证实后，好氧反硝化技术得到了不断的深入研究，而且好氧反硝化微生物能在有氧条件下进行反硝化除氮，这使得硝化和反硝化能够基本相同的条件下进行，可以降低处理成本这比传统的硝化-反硝化除氮具有明显的优势。发现和培养好氧反硝化菌群是研究好氧反硝化技术的重点之一，目前发现的好氧反硝化菌种中仍然以细菌为主，而好氧反硝化真菌研究的却很少，然而好氧反硝化细菌对环境要求较高在实际应用中并不理想。
[0004] 但是和好氧反硝化细菌相比，好氧反硝化真菌比细菌具有更强的环境适应性和耐受性。故筛选并鉴定出好氧反硝化真菌对于好氧反硝化技术应用于水体特别是难以实现厌氧的开放式的河流的脱氮提供了新的途径，具有更大的实际意义。目前筛选好氧反硝化真菌的方法，所筛选出的好氧反硝化真菌硝酸盐去除率较低。
发明内容
[0005] 本发明针对现有技术中的不足，提供一种筛选专性好氧反硝化真菌的方法。
[0006] 本发明的技术方案是：
[0007] 一种筛选专性好氧反硝化真菌的方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤（1）：富集专性好氧反硝化真菌培养基的制备：所述培养基每升包括溴百里酚蓝0.01-0.02克、琼脂18-25克、葡萄糖酸钠为5-10克、硝酸钠和亚硝酸钠混合物为1.8-2.4克，所述硝酸钠：亚硝酸钠=1：0.5、磷酸二氢钠1-2.0克、氯化钙0.01-0.03克、硫酸镁0.01-0.02克、碳酸氢钠0.2-0.5克、硫酸亚铁0.01-0.02克、硫酸锰0.01-0.02克、硫酸锌0.01-0.03克、氯化铜0.01-0.03克、硫酸钴0.01-0.02克；将除溴百里酚蓝外的各成分分别加入到一起并混合均匀，灭菌；将溴百里酚蓝溶于无水乙醇中，在无菌条件下将其加入到上述灭菌后的培养基中并再次混合均匀，制成富集专性好氧反硝化真菌培养基平板；
[0009] 步骤（2）：涂布培养：将待筛选的反硝化真菌混合液均匀的涂布到步骤（1）中制备的富集专性好氧反硝化真菌培养基的平板上；在保持氧气充足的条件下，30℃下倒置培养7-10天，直至培养基颜色从绿变蓝；
[0010] 步骤（3）：挑取步骤（2）培养基中由绿变蓝的绒毛状菌株，再次在步骤（1）所制备的培养基上划线分离，在保持氧气充足的条件下，30℃下倒置培养7-10天；重复上述过程，直至富集专性好氧反硝化真菌培养基上出现的蓝色菌株清晰、外形一致、无伴生菌和杂菌，为止。
[0011] 在以上方案的基础上，步骤（1）所述的富集专性好氧反硝化真菌培养基的制备：所述培养基每升包括溴百里酚蓝0.015克；琼脂22克；葡萄糖酸钠为8克；硝酸钠和亚硝酸钠混合物为2.0克，所述硝酸钠：亚硝酸钠=1：0.5；磷酸二氢钠1.8克；氯化钙0.02克；
硫酸镁0.01克；碳酸氢钠0.4克；硫酸亚铁0.015克、硫酸锰0.015克、硫酸锌0.02克、氯化铜0.01克、硫酸钴0.01克。
[0012] 在以上方案的基础上。还包括步骤4专性好氧反硝化真菌的鉴定方法，包括好氧反硝化能力鉴定、专性好氧菌鉴定、分子生物学鉴定：
[0013] 步骤A：好氧反硝化能力鉴定
[0014] 制备好氧反硝化性能鉴定培养基每升好氧反硝化性能鉴定培养基组成如下：硝酸钠1-1.5克；磷酸二氢钾1-1.5克；葡萄糖酸钠5-10克；水90-120毫升；氯化钙0.01-0.03克；硫酸镁0.01-0.02克；；碳酸氢钠0.2-0.5克；微量元素混合液：硫酸亚铁0.01-0.02克，硫酸锰0.01-0.02克，、硫酸锌0.01-0.03克、氯化铜0.01-0.03克，硫酸钴0.01-0.02克；将上述组成依次加入到锥形瓶中，121℃灭菌20分钟；制备指示剂，所述指示剂组成成分如下：4-氨基苯磺酰胺20g，N-1-萘乙二胺盐酸盐1g，磷酸50mL，水250mL，稀释到500mL；将菌株接种于所述的好氧反硝化性能鉴定培养基，在氧气充足的条件下，30℃下倒置培养3-5天后向培养基中加入指示剂，如培养基变红，则表明待测菌株具有好氧反硝化能力；
[0015] 步骤B：专性好氧菌鉴定
[0016] 将步骤（A）鉴定后的菌株接种于专性好氧反硝化真菌培养基上，并转移到厌氧瓶中冲入氮气后密封；30℃下培养1个月；如菌株无生长迹象，说明该菌种为专性好氧菌；
[0017] 步骤C：分子生物学鉴定
[0018] 将步骤（B）鉴定后的菌株分别进行DNA提取并进行PCR扩增，然后进行测序；分别使用GenBank中BLAST程序和MycoBank中的基因数据库与测序结果进行比对，并参照真菌鉴定手册，得到菌株的种属。
[0019] 在以上方案的基础上，所述的筛选专性好氧反硝化真菌的方法，步骤4中所述的好氧反硝化性能鉴定培养基每升所述培养基组成如下：硝酸钠1.3克、磷酸二氢钾1.3克、葡萄糖酸钠8克、水110毫升、氯化钙0.02克、硫酸镁0.01克、碳酸氢钠0.4克；微量元素混合液：硫酸亚铁0.015克、硫酸锰0.015克、硫酸锌0.01克、氯化铜0.015克，硫酸钴0.01克。
[0020] 本发明的有益效果是：本发明将采集的备选菌源通过接种于富集专性好氧反硝化真菌培养基上，通过多次重复培养、筛选，得到三种专性好氧反硝化真菌，将获得的菌应用去除水体中的硝酸盐，在28小时内的硝酸盐去除率分别达到85.25%、88.51%和89.54%。这不仅是对好氧反硝化菌属种类的补充，而且可以为好氧反硝化技术在实际水环境中的除氮应用提供更广阔的空间。
附图说明
[0021] 图1为本发明的筛选专性好氧反硝化真菌的方法的流程图；
[0022] 图2为本发明筛选的三种真菌不同底物下对硝酸盐去除率效果图；
[0023] 图3为本发明筛选的三种真菌对硝酸盐的降解规律效果图；
[0024] 图4为本发明筛选的三种真菌对亚硝酸盐的降解规律效果图。
具体实施方式
[0025] 本发明的具体实施方式如下：
[0026] 实施例1：
[0027] 胶州湾流域氮素污染较为严重，该流域富含多种微生物，故采用胶州湾流域某受污染的河流的底泥作为待选菌源。
[0028] 筛选专性好氧反硝化真菌的方法，包括以下步骤：
[0029] 步骤1：富集专性好氧反硝化真菌培养基的制备
[0030] 富集专性好氧反硝化真菌培养基的好坏直接影响是否能够很好地筛选出专性好氧反硝化真菌。每升专性好氧反硝化真菌培养基的组成为：溴百里酚蓝0.015克；琼脂22克；葡萄糖酸钠为8克；硝酸钠和亚硝酸钠混合物为2.0克，所述硝酸钠：亚硝酸钠=1：0.5；磷酸二氢钠1.8克；氯化钙0.02克；硫酸镁0.01克；碳酸氢钠0.4克；微量元素混合液：硫酸亚铁0.015克，硫酸锰0.015克，硫酸锌0.02克、氯化铜0.01克，硫酸钴0.01克等。
[0031] 制备过程：将除溴百里酚蓝外的各成分分别加入到一起并混合均匀，之后将此得到的培养基进行灭菌，然后将溴百里酚蓝溶于无水乙醇中，之后在无菌条件下将其加入到上述灭菌后的培养基中并再次混合均匀，然后趁热倒入到平板上放置凝固，得到的便是富集专性好氧反硝化真菌培养基。
[0032] 步骤2：稀释及涂布
[0033] 取0.1毫升待筛选的混合菌源分别置于多个容器中内，采用灭菌水分别稀释108倍，将各自稀释好的稀释菌液置于空气浴摇床内保持温度为30℃恒温振荡十五分钟摇匀；混合均匀后分别取0.1-0.5毫升均匀的涂布到装有富集专性好氧反硝化真菌培养基的平板上。将涂布后的富集专性好氧反硝化真菌培养基倒置放入恒温培养箱中于30℃下培养。
在保持氧气充足的条件下，培养7-10天以上培养基颜色从绿变蓝后，表示专性好氧反硝化真菌出现。
[0034] 步骤3：挑取步骤（2）培养基中由绿变蓝的绒毛状菌株，:在无菌条件下采用接种环挑取该培养基中由绿变蓝的绒毛状菌株在另外一个从未用过的专性好氧反硝化真菌培养基上进行划线分离，划线后将其倒置放入恒温培养箱。在保持氧气充足的条件下，恒温箱保持30℃培养7天-10天。
[0035] 重复以上划线、培养这个过程，即恒温箱培养后的各富集专性好氧反硝化真菌培养基由绿变蓝后，再次在无菌条件下采用接种环挑取该培养基中由绿变蓝的绒毛状菌株在新的专性好氧反硝化真菌培养基上进行划线分离，在保持氧气充足的条件下，恒温培养箱内保持30℃培养7-10天。
[0036] 重复以上划线、培养这个过程5次，即得到纯种的反硝化真菌三种，分别命名为HYFXHZJ-1、HYFXHZJ-2和HYFXHZJ-3。
[0037] 步骤4：将所得到的3种专性好氧反硝化真菌进一步鉴定，包括好氧反硝化能力鉴定、专性好氧菌鉴定、分子生物学鉴定：
[0038] 步骤A：好氧反硝化能力鉴定
[0039] 制备好氧反硝化性能鉴定培养基每升好氧反硝化性能鉴定培养基组成如下：硝酸钠1.3克；磷酸二氢钾1.3克；葡萄糖酸钠8克；水110毫升；氯化钙0.02克；硫酸镁0.01克；碳酸氢钠0.4克；微量元素混合液：硫酸亚铁0.015克，硫酸锰0.015克，、硫酸锌0.01克、氯化铜0.015克，硫酸钴0.01克；将上述组成依次加入到锥形瓶中，121℃灭菌20分钟。制备指示剂，所述指示剂组成成分如下：4-氨基苯磺酰胺20g，N-1-萘乙二胺盐酸盐1g，磷酸50mL，水250mL，稀释到 500mL；将菌株接种于所述的好氧反硝化性能鉴定培养基，在氧气充足的条件下，30℃下倒置培养3-5天后向培养基中加入指示剂，培养基变红，表明待测菌株均具有好氧反硝化能力；
[0040] 步骤B：专性好氧菌鉴定
[0041] 将步骤（A）鉴定后的菌株接种于专性好氧反硝化真菌培养基上，并转移到厌氧瓶中冲入氮气后密封；30℃下培养1个月，菌株无生长迹象，说明该菌种为专性好氧菌；
[0042] 步骤C：分子生物学鉴定
[0043] 将步骤（B）鉴定后的菌株分别进行DNA提取并进行PCR扩增，然后进行测序；分别使用GenBank中BLAST程序和MycoBank中的基因数据库与测序结果进行比对，并参照真菌鉴定手册，得到菌株的种属。
[0044] 三种专性好氧反硝化真菌的好氧反硝化性能鉴定：
[0045] 将筛选得到的上述三种专性好氧反硝化真菌按照15%的接种量接种于人工配水中，配水采用蔗糖为底物，硝酸盐浓度为50mg/L、亚硝酸盐35mg/L，在30℃下摇床培养28小时后，硝酸盐和亚硝酸盐的去除率的结果见图2。三种专性好氧反硝化真菌的去除能力见图3、图4。
[0046] 图2中，三种专性好氧反硝化真菌在不同底物下硝酸盐和亚硝酸盐降解效果明显，在28小时内的硝酸盐去除率分别达到85.25%、88.51%和89.54%；亚硝酸盐分别达到83.72%、76.54%和81.21%。
[0047] 图3、图4中，三种专性好氧反硝化真菌在蔗糖为底物下随时间对硝酸盐和亚硝酸盐的降解规律，在降解28小时后硝酸盐和亚硝酸盐达到较高的去除率，随着继续降解，硝酸盐和亚硝酸盐的去除率变化不大。
