本发明设计出用于检测BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、e19a2、e1a3、e13a3和e14a3这6种非常见融合型别的方法、引物、探针和试剂盒。先采取两管荧光定量PCR反应进行血液样本进行初筛，再对通过初筛判断属于a2或a3组的血液样本进行具体型别定量鉴定。这样既减少了筛查的成本又提高了检测的通量。本发明所述的检测方法、引物、探针和试剂盒其灵敏度高，特异性好，检测通量大，快速且准确的筛查及型别鉴定方法。
筛查和鉴定BCR-ABL非常见融合型别的方法、引物、探针和
试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及一种临床筛查BCR-ABL融合基因非常见融合型别的方法、引物、探针和试剂盒，采用实时荧光定量PCR技术，对人血液样本中BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、e19a2、e1a3、e13a3、e14a3这6种非常见型别进行初步筛查和型别鉴定。
背景技术
[0002] BCR-ABL融合基因是由9号染色体长臂易位至22号染色体长臂上，致使ABL原癌基因与BCR基因发生融合而产生的。t(9;22)(q34;q11)易位后的22号染色体又称为费城染色体(Ph染色体)。Ph染色体和BCR-ABL融合基因是慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia，CML)产生的分子基础。此外，BCR-ABL融合基因还可见于急性淋巴细胞白血病(AcuteLymphoblastic Leukemia，ALL)，少见于急性髓系白血病(Acute Myeloblastic Leukemia，AML)。
[0003] 当9号染色体与22号染色体发生易位时，9号染色体上的断裂位置通常位于ABL基因的第1内含子上，其次是第2内含子；而22号染色体上的断裂位置则可位于BCR基因的多个区段上，故会形成多种融合型别。在各种融合型别中，有三种是最常见的，分别为：e13a2（又称为b2a2）、e14a2（又称为b3a2）和e1a2；前两种融合型别就是常说的BCR-ABL P210,后者常称为BCR-ABL P190。除此以外，报道较多的非常见型别则有：e6a2、e8a2、e19a2、e1a3、e13a3和e14a3。在CML患者中，BCR-ABL e13a2和e14a2两种融合型共计占～
98%；而非常见融合型别至少占1-2%，甚至更多。在成人和儿童ALL患者中，BCR-ABL阳性率分别为～25%和～3%；这其中e13a2、e14a2和e1a2共计占～99%；而非常见融合型别也至少占1-2%。
[0004] 目前，临床在对疑似CML、ALL和AML患者做BCR-ABL融合基因筛查时，通常只针对e13a2、e14a2和e1a2三种型别做出检测，其他非常见的型别则是通过染色体核型分析或原位荧光杂交(FISH)技术检查时偶然发现。这种通过肉眼观察判断的筛查方式存在如下缺点：(1)对BCR-ABL融合基因非常见型别的筛查存在漏检的情况。首先，染色体核型分析的前提是需对样本中的有核细胞进行培养，具有核分裂相；若细胞培养失败，无核分裂相，则无法进行分析。其次，在细胞培养增殖过程中，某类细胞会过度生长，若正常细胞过度生长，则会将病变细胞“淹没”掉，造成染色体核型正常的假象。而在无法抽取骨髓的情况下，抽取外周血做染色体核型分析，也会有假阴性出现。再者，有些病例染色体的易位极其微小，出现隐匿性的Ph染色体，这是在靠肉眼观察进行分析的染色体检查中无法发现的。而FISH方法检测BCR-ABL融合时，虽然不用培养细胞，对隐匿性的Ph染色体也能检测到，但其检查费用过高，大部分患者都不会选择该方法进行检测，故起不到真正筛查的作用。(2)无法区分BCR-ABL的具体型别，因而就无法有针对性地进行微小残留病灶(Minimal Residua Disease，MRD)的监控。染色体核型分析是通过肉眼对染色体的易位进行识别；同样，FISH是借助荧光信号，观察不同染色体的融合，亚微观的变化是无法观察到的。(3)检测成功率及灵敏度低。
[0005] 目前，即使有针对性地对BCR-ABL融合基因非常见型别进行鉴定，也是先通过进行多重PCR(mμltiplex PCR)或巢式PCR(nested PCR)方法进行扩增，再结合琼脂糖凝胶电泳或测序。多重PCR结合琼脂糖凝胶电泳或测序进行筛查的缺点如下：(1)存在非特异的扩增，电泳时会出现多条PCR产物条带，易出现假阳性；(2)通过电泳进行分析时结果判断存在主观性，特别是在对MRD的监控时，临界结果无法进行明确的分析判断，而通过测序会到导致成本增加，而且时间周期极大地延长；(3)灵敏度低于巢式PCR及荧光PCR；(4)只能进行定性检测；(5)耗时长，若通过电泳鉴定PCR产物需要5-6小时；若通过测序鉴定，则需要10-12小时。而巢式PCR结合琼脂糖凝胶电泳或测序进行筛查也存在如下缺点：(1)过程繁琐，易污染，电泳鉴定时临界结果的判断较主观；(2)PCR反应体系多，成本高，不适用于高通量的样本检测；(3)只能进行定性检测；(4)耗时长，若通过电泳鉴定PCR产物需要5-6小时；若通过测序鉴定，则需要10-12小时。故无论是先通过进行多重PCR(mμltiplex PCR)还是巢式PCR(nested PCR)方法进行扩增，再利用琼脂糖凝胶电泳或测序来鉴定BCR-ABL融合基因非常见型别，都不能同时满足灵敏度高和特异性好的优点。
发明内容
[0006] 鉴于目前筛查BCR-ABL融合基因非常见型别方法的不足，本发明设计出用于检测BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、e19a2、e1a3、e13a3和e14a3这6种非常见融合型别的方法、引物、探针和试剂盒，从而能够高灵敏度地、高特异性地、高通量地并且快速准确地筛查和鉴定BCR-ABL融合基因非常见型别。
[0007] 本发明的目的在于提供用于筛查BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、e19a2、e1a3、e13a3和e14a3这6种非常见融合型别的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的核苷酸序列如下：
[0008] E6F：5’-GAGCCAGAAGCAACAAAGATG-3’
[0009] E8F：5’-TTCCTGTCCAGCATCAATGAG-3’
[0010] E19F：5’-TGGAGGAGGTGGGCATCTA-3’
[0011] A2R：5’-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3’
[0012] A2P：5’-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0013] E1F：5’-CTCGCAGAACTCGCAACAG-3’
[0014] E13F：5’-GATGCTGACCAACTCGTGTGT-3’
[0015] E14F：5’-GTCATCGTCCACTCAGCCAC-3’
[0016] A3R：5’-TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0017] A3P：5’-FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’。
[0018] 进一步地，所述引物和探针还包括用于扩增作为内参的管家基因ABL的引物和探针，其核苷酸序列如下：
[0019] ABL-F：5’-GATACGAAGGGAGGGTGTACCA-3’
[0020] ABL-R：5’-CTCGGCCAGGGTGTTGAA-3’
[0021] ABL-P：5’-FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA-3’。
[0022] 本发明还提供了用于鉴定BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、e19a2、e1a3、e13a3和e14a3这6种非常见融合型别的引物和探针，其特征在于，
[0023] 鉴定e6a2型别的引物和探针的核苷酸序列如下：
[0024] E6F：5’-GAGCCAGAAGCAACAAAGATG-3’
[0025] A2R：5’-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3’
[0026] A2P：5’-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0027] 鉴定e8a2型别的引物和探针的核苷酸序列如下：
[0028] E8F：5’-TTCCTGTCCAGCATCAATGAG-3’
[0029] A2R：5’-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3’
[0030] A2P：5’-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0031] 鉴定e19a2型别的引物和探针的核苷酸序列如下：
[0032] E19F：5’-TGGAGGAGGTGGGCATCTA-3’
[0033] A2R：5’-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3’
[0034] A2P：5’-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0035] 鉴定e1a3型别的引物和探针的核苷酸序列如下：
[0036] E1F：5’-CTCGCAGAACTCGCAACAG-3’
[0037] A3R：5’-TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0038] A3P：5’-FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’
[0039] 鉴定e13a3型别的引物和探针的核苷酸序列如下：
[0040] E13F：5’-GATGCTGACCAACTCGTGTGT-3’
[0041] A3R：5’-TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0042] A3P：5’-FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’
[0043] 鉴定e14a3型别的引物和探针的核苷酸序列如下：
[0044] E14F：5’-GTCATCGTCCACTCAGCCAC-3’
[0045] A3R：5’-TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0046] A3P：5’-FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’。
[0047] 进一步地，鉴定选自e6a2、e8a2、e19a2、e1a3、e13a3和e14a3型别中任一种型别的引物和探针的核苷酸序列还包括扩增作为内参的管家基因ABL的引物和探针，其核苷酸序列如下：
[0048] ABL-F：5’-GATACGAAGGGAGGGTGTACCA-3’
[0049] ABL-R：5’-CTCGGCCAGGGTGTTGAA-3’
[0050] ABL-P：5’-FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA-3’
[0051] 本发明还提供了一种筛查和鉴定BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、e19a2、e1a3、e13a3和e14a3这6种非常见融合型别的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0052] (1)提取血液样本中的RNA；
[0053] (2)将步骤(1)中的RNA逆转录cDNA;
[0054] (3)利用荧光PCR扩增步骤(2)所述的cDNA，进行所述非常见融合型别的初步筛查；
[0055] (4)若通过步骤(3)的初步筛查，确定所述血液样本不是所述非常见融合型别，则检测结束；若通过步骤(3)的初步筛查，确定所述血液样本为所述非常见融合型别，则再通过荧光PCR扩增进行具体型别定量鉴定。
[0056] 进一步地，利用所述步骤（3）的初步筛查判断所述血液标本属于a2组、a3组或不是所述非常见融合型别。
[0057] 进一步地，用于所述步骤（3）的扩增引物和探针的核苷酸序列为：
[0058] E6F：5’-GAGCCAGAAGCAACAAAGATG-3’
[0059] E8F：5’-TTCCTGTCCAGCATCAATGAG-3’
[0060] E19F：5’-TGGAGGAGGTGGGCATCTA-3’
[0061] A2R：5’-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3’
[0062] A2P：5’-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0063] E1F：5’-CTCGCAGAACTCGCAACAG-3’
[0064] E13F：5’-GATGCTGACCAACTCGTGTGT-3’
[0065] E14F：5’-GTCATCGTCCACTCAGCCAC-3’
[0066] A3R：5’-TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0067] A3P：5’-FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’。
[0068] 进一步地，根据步骤（3）中的判断结果，若是a2组，则进行e6a2，e8a2，e19a2型别鉴定；若是a3组，则进行e1a3，e13a3，e14a3型别鉴定。
[0069] 进一步地，在所述步骤（4）中，用于通过所述荧光PCR扩增进行具体型别定量鉴定的引物和探针的核苷酸序列为：
[0070] 鉴定e6a2型别的引物和探针的核苷酸序列如下：
[0071] E6F：5’-GAGCCAGAAGCAACAAAGATG-3’
[0072] A2R：5’-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3’
[0073] A2P：5’-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0074] 鉴定e8a2型别的引物和探针的核苷酸序列如下：
[0075] E8F：5’-TTCCTGTCCAGCATCAATGAG-3’
[0076] A2R：5’-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3’
[0077] A2P：5’-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0078] 鉴定e19a2型别的引物和探针的核苷酸序列如下：
[0079] E19F：5’-TGGAGGAGGTGGGCATCTA-3’
[0080] A2R：5’-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3’
[0081] A2P：5’-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0082] 鉴定e1a3型别的引物和探针的核苷酸序列如下：
[0083] E1F：5’-CTCGCAGAACTCGCAACAG-3’
[0084] A3R：5’-TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0085] A3P：5’-FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’
[0086] 鉴定e13a3型别的引物和探针的核苷酸序列如下：
[0087] E13F：5’-GATGCTGACCAACTCGTGTGT-3’
[0088] A3R：5’-TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0089] A3P：5’-FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’
[0090] 鉴定e14a3型别的引物和探针的核苷酸序列如下：
[0091] E14F：5’-GTCATCGTCCACTCAGCCAC-3’
[0092] A3R：5’-TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0093] A3P：5’-FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’。
[0094] 本发明还提供了一种筛查和鉴定BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、e19a2、e1a3、e13a3和e14a3这6种非常见融合型别的试剂盒，包括血液RNA提取液、逆转录试剂、PCR扩增反应体系，所述PCR扩增反应体系包括引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的核苷酸序列如下：
[0095] E6F：5’-GAGCCAGAAGCAACAAAGATG-3’
[0096] E8F：5’-TTCCTGTCCAGCATCAATGAG-3’
[0097] E19F：5’-TGGAGGAGGTGGGCATCTA-3’
[0098] A2R：5’-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3’
[0099] A2P：5’-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0100] E1F：5’-CTCGCAGAACTCGCAACAG-3’
[0101] E13F：5’-GATGCTGACCAACTCGTGTGT-3’
[0102] E14F：5’-GTCATCGTCCACTCAGCCAC-3’
[0103] A3R：5’-TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0104] A3P：5’-FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’
[0105] ABL-F：5’-GATACGAAGGGAGGGTGTACCA-3’
[0106] ABL-R：5’-CTCGGCCAGGGTGTTGAA-3’
[0107] ABL-P：5’-FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA-3’。
[0108] 由于BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、e19a2、e1a3、e13a3和e14a3这6种非常见融合型别的发生率低，故本发明通过引物探针的设计优化，采取两管PCR反应先用多重引物结合荧光PCR的方法进行血液样本初筛，再对属于a2组或a3组的血液标本进行具体型别定量鉴定的方法，这样减少了筛查的成本，又提高了检测的通量。
[0109] 本发明引物探针的设计及筛查体系的分组如下：根据BCR-ABL在融合过程中，ABL基因上的断裂位置相对固定的特点，将筛查体系分为两组：a2组（断裂位置位于ABL基因第1内含子），由e6a2，e8a2，e19a2型别组成；a3组（断裂位置位于ABL基因第2内含子），由e1a3，e13a3，e14a3型别组成。同时，在ABL基因的第2外显子上设计a2组的下游引物和荧光探针；在第3外显子上设计a3组的下游引物和荧光探针。随后，根据下游引物设计与之适宜进行PCR反应的的上游引物。a2组的上游引物分别位于BCR基因的第6外显子、第8外显子和第19外显子；这样与下游引物组合正好能检测e6a2、e8a2、e19a2三种型别。同理，a3组的上游引物分别位于BCR基因的第1外显子、第13外显子和第14外显子，与下游引物组合检测e1a3、e13a3和e14a3三种型别。这种设计三条上游引物共用一条下游引物和探针的配对方式，减少了一管反应体系中由于存在多条引物探针而相互抑制干扰的情况，既节约了成本又增加了检测体系的灵敏度和特异性。同时不论是在a2组还是在a3组中，由于在每组内下游引物是共用的，所以应当遵循先设计同组的共有下游引物再设计同组内不同融合型别的上游引物的原则，不然若事先设计同组内的一个融合型别的上游引物再设计其下游引物，然后设计同组内的另一个融合型别的上游引物再设计其下游引物，很有可能产生两次设计的下游引物不一致的现象，而导致下游引物重新设计，从而带来极大的时间浪费。
[0110] 据统计，在这6种非常见融合型别中，任何一种型别的发生率大概在1-2%，因而容易在临床检测中被忽视和漏检。若采用在单管中利用多重荧光PCR进行筛查，针对每个型别的探针所采用的荧光基团必需是不同的，这不仅会增加检测成本，则灵敏度、特异性不能满足临床的要求，结果可靠性也较差。若对每个型别都进行单独鉴定，则需要进行六管检测，同时也鉴于在这6种非常见融合型别中，任何一种型别的发生率仅仅为1-2%左右，这就意味着在1000份血液样品中，至少由980份样品不属于这6种非常见融合型别中的任何一种，如果对这至少980份样品都进行六管检测，那么不仅要消耗病人更多的血样样本，同时也极大地增加试剂和人力成本。本发明利用一条下游引物探针对应多条上游引物的组合方式，先进行定性筛查后进行定量分型，将初筛检查的反应体系缩减到两管，这样就可在初筛阶段将上述至少980份样品排除掉，就不用再进行后续的定量检测和分型，因此这不仅节约了成本，又增加了一个批次检测的通量，为高通量的血液样本筛查工作提供便利。再者，针对每个型别的探针可共用相同的荧光基团，也有助降低试剂开发成本，为便于产品的开发。此外，将这种组合方式与荧光定量PCR技术相结合，避免巢式PCR的开盖反应，提高了结果的准确性，避免污染的发生；也提高了结果的易判断性，使检测结果更加客观易读。最后，在具体型别鉴定时引入ABL标准曲线，既进行了分型，又进行了定量，有利于在临床上结合骨髓检查、染色体核型分析、免疫分型等结果综合评估疾病的发生发展及预后，同时有针对性地进行MRD监控，预测复发风险。
附图说明
[0111] 图1是本发明引物和探针设计位置图
[0112] 图2是使用本发明引物、探针和检测方法对一个待检血液样本进行筛查及型别鉴定的荧光扩增曲线图
[0113] 图3是使用本发明引物、探针和检测方法对第二个待检血液样本进行筛查及型别鉴定的荧光扩增曲线图
[0114] 图4是使用本发明引物、探针和检测方法对第三个待检血液样本进行筛查及型别鉴定的荧光扩增曲线图
[0115] 图5是使用本发明引物、探针和检测方法对第四个待检血液样本进行筛查及型别鉴定的荧光扩增曲线图
[0116] 图6是使用本发明引物、探针和检测方法对第五个待检血液样本进行筛查及型别鉴定的荧光扩增曲线图
[0117] 图7是使用本发明引物、探针和检测方法对第六个待检样本进行筛查及型别鉴定的荧光扩增曲线图
[0118] 图8是使用本发明引物、探针和检测方法对第七个待检血液样本进行筛查的荧光扩增曲线图
具体实施方式
[0119] 实施例1：
[0120] 血液RNA的提取：在1.5ml离心管中加入1ml1×红细胞裂解液，取待检血液样本0.5ml，颠倒混匀。离心4000rpm，3min，吸弃上清，加红细胞裂解液洗涤一次，得所需细胞；
加l ml TotalRNA Isolation Reagent(上海普飞生物技术有限公司)，反复吹吸直至无明显细胞团块，加入氯仿200μl，漩涡混匀30s，冰上静置10min。接着，4℃离心14,000rpm，
10min。用移液器吸取上清液450μl转移至另一离心管中，加入等体积的预冷异丙醇，颠倒混匀后在冰上静置10min。4℃离心14,000rpm，10min。然后用75％的乙醇和无水乙醇分别洗涤离心一次。室温干燥5min，加入50μl DEPC-H2O溶解，获得RNA提取液。
[0121] 10×红细胞裂解液配方为：NH4Cl82g，NaHCO38.4g，EDTA-Na23.72g，加ddH2O定容至1000ml。
[0122] 实施例2：
[0123] 逆转录：取实施例1中的RNA提取液4μl（浓度约200ng/μl）加1μl Primer mix（ReverTra AceqPCR RT Kit，购自东洋纺（上海）生物科技有限公司）和3μl DEPC-H2O混匀，70℃预变性5min；冰上骤冷1min后加入4μl5*RT buffer（ReverTra Ace qPCR RT Kit），1μl Enzyme Mix（ReverTra Ace qPCR RT Kit），并加7μl DEPC-H20至总体积为20μl。37℃60min反应后98℃5min灭活，所得即为待检血液样本的cDNA。
[0124] 实施例3：
[0125] 荧光PCR初筛：根据如表1所示的各材料及用量配置初筛试剂。初筛试剂共含3个反应管：a2组、a3组和ABL各一管；其中ABL为内参检测管，用于判断RNA提取质量是否符合要求。加入实施例2中所得cDNA各2μl。按如下程序进行检测：95℃预变性30s；95℃10s，58℃35s，共40个循环；58℃时采集荧光。HUNDERBIRD Probe qPCR Mix购自东洋纺（上海）生物科技有限公司。
[0126] 表1
[0127]
[0128] 实施例4：
[0129] 将第一个待检血液样本按实施例1-3所述的方法进行RNA提取，获得cDNA及荧光PCR初筛，初筛显示第一个待检血液样本属于a2组。所得结果如图2-A所示。然后对a2组的各个型别进行分别鉴定及定量。试剂配置如表2所示，并加入所获得的cDNA各2μl。检测程序同实施例3。经鉴定第一个待检血液样本为BCR-ABL融合基因e8a2型别，所得结果如图2-B所示，根据检测软件计算得出其相对定量结果（BCR-ABL e8a2/ABL）为161.81%。
最后将该样本进行测序验证，确定为BCR-ABL融合基因e8a2型别。
[0130] 表2
[0131]
[0132] 实施例5：
[0133] 对第二个待检血液样本按实施例1-3所述进行RNA提取，获得cDNA及荧光PCR初筛，所得结果如图3-A所示：初筛显示第二个待检血液样本属于a3组。再对a3组的各个型别进行分别鉴定及定量。试剂配置如表3所示，并加入所获得的cDNA各2μl。检测程序同实施例3。所得结果如图3-B所示：经鉴定第一个待检血液样本为BCR-ABL融合基因e1a3型别，根据检测软件计算得出其相对定量结果（BCR-ABL e1a3/ABL）为50.97%。将该样本进行测序检测验证，确定为BCR-ABL融合基因e1a3型别。
[0134] 表3
[0135]
[0136] 实施例6：
[0137] 对第三个待检血液样本按实施例1-3所述进行RNA提取，获得cDNA及荧光PCR初筛，所得结果如图4-A所示：初筛显示第三个待检血液样本属于a3组。再对a3组的各个型别进行分别鉴定及定量。试剂配置及检测程序同实施例5。所得结果如图4-B所示：经鉴定第三个待检血液样本为BCR-ABL融合基因e13a3型别，根据检测软件计算得出其相对定量结果（BCR-ABL e13a3/ABL）为384.62%。将该样本进行测序检测验证，确定为BCR-ABL融合基因e13a3型别。
[0138] 实施例7：
[0139] 对第四个待检血液样本按实施例1-3所述进行RNA提取，获得cDNA及荧光PCR初筛，所得结果如图5-A所示：初筛显示第四个待检血液样本属于a2组。再对a2组的各个型别进行分别鉴定及定量。试剂配置及检测程序同实施例4。所得结果如图5-B所示：经鉴定第四个待检血液样本为BCR-ABL融合基因e19a2型别，根据检测软件计算得出其相对定量结果（BCR-ABL e19a2/ABL）为70.88%。将该样本进行测序检测验证，确定为BCR-ABL融合基因e19a2型别。
[0140] 实施例8：
[0141] 对第五个待检血液样本按实施例1-3所述进行RNA提取，获得cDNA及荧光PCR初筛，所得结果如图6-A所示：初筛显示第五个待检血液样本属于a2组。再对a2组的各个型别进行分别鉴定及定量。试剂配置及检测程序同实施例4。所得结果如图6-B所示：经鉴定第五个待检血液样本为BCR-ABL融合基因e6a2型别，根据检测软件计算得出其相对定量结果（BCR-ABL e6a2/ABL）为70.95%。将该样本进行测序检测验证，确定为BCR-ABL融合基因e6a2型别。
[0142] 实施例9：
[0143] 对第六个待检血液样本按实施例1-3所述进行RNA提取，获得cDNA及荧光PCR初筛，所得结果如图7-A所示：初筛显示第六个待检血液样本属于a3组。再对a3组的各个型别进行分别鉴定及定量。试剂配置及检测程序同实施例5。所得结果如图7-B所示：经鉴定第六个待检血液样本为BCR-ABL融合基因e14a3型别，根据检测软件计算得出其相对定量结果（BCR-ABL e14a3/ABL）为96.29%。将该样本进行测序检测验证，确定为BCR-ABL融合基因e14a3型别。
[0144] 实施例10：
[0145] 对第七个待检血液样本按实施例1-3所述进行RNA提取，获得cDNA及荧光PCR初筛，所得结果如图8所示：第七个待检血液样本不属于a2组，也不属于a3组，产品每个人排除第七个待检血液样本为e6a2，e8a2，e19a2，e1a3，e13a3，e14a3型别的可能性。经染色体核型分析结果确认为核型正常。
[0146] 实施例11：
[0147] 根据实施例4至实施例10所得的BCR-ABL融合基因型别结果，进行总结。结果如表4所示。
[0148] 表4
[0149]
[0150] 由表4可知，本发明设计出用于检测BCR-ABL融合基因非常见融合型别e6a2、e8a2、e19a2、e1a3、e13a3和e14a3的方法、引物、探针和试剂盒能够检测这六种型别。所检测的结果均与测序检测或染色体核型分析获得的结果相一致。
