一种基于发光金纳米簇检测米托蒽醌的方法转让专利
申请号 : CN201310544623.0
文献号 : CN103575715B
文献日 : 2016-02-10
发明人 : 冯大千 , 刘国良 , 王伟
申请人 : 盐城工学院
摘要 :
本发明公开了一种基于发光金纳米簇检测米托蒽醌的方法，包括以下步骤：制备金纳米簇，在469nm波长光的激发下，测定金纳米簇在619nm波长处的荧光强度，记为F0；在步骤一中加入不同质量米托蒽醌后，测定含有不同浓度米托蒽醌的金纳米簇在469nm波长光激发下，在619nm波长处的荧光强度，记为F，根据加入不同质量米托蒽醌后，荧光强度的变化值，计算出加入米托蒽醌前后金纳米簇荧光强度的变化值与米托蒽醌浓度的线性关系；将待测样品加入金纳米簇中，测试其加入前后在469nm波长光的激发下，在619nm波长处的荧光强度的变化值，根据得到的线性关系，计算出加入米托蒽醌的质量或浓度建立的检测。该方法具有高选择性、高灵敏度、简便、易行等特点。
权利要求 :
1.一种基于发光金纳米簇检测米托蒽醌的方法，包括以下步骤：步骤一，制备金纳米簇，在469nm波长光的激发下，测定金纳米簇在619nm波长处的荧光强度，记为F0；步骤二，在步骤一中加入不同质量米托蒽醌后，测定含有不同浓度米托蒽醌的金纳米簇在469nm波长光激发下，在619 nm波长处的荧光强度，记为F，根据加入不同质量米托蒽醌后，荧光强度的变化值，计算出加入米托蒽醌前后金纳米簇荧光强度的变化值与米托蒽醌浓度的线性关系；步骤三，将待测样品加入金纳米簇中，测试其加入前后在469nm波长光的激发下，在
619nm波长处的荧光强度的变化值，根据步骤二得到的线性关系，计算出加入米托蒽醌的质量或浓度。
2. 如权利要求1所述的基于发光金纳米簇检测米托蒽醌的方法，其特征在于荧光强度测试时仪器的狭缝宽度设定为5 nm。
3. 如权利要求1或2所述的基于发光金纳米簇检测米托蒽醌的方法，其特征在于步骤一中金纳米簇的制备步骤为：制备 10 mg/mL的四氯金酸溶液，取刚制备的溶液加入到牛血清白蛋白溶液中，期间进行剧烈搅拌，使之充分混均，2分钟后，再加入NaOH溶液，继续搅拌◦
12小时，保持温度在37 C。
说明书 :
一种基于发光金纳米簇检测米托蒽醌的方法
技术领域
[0001] 本发明属于米托蒽醌药物检测领域，具体涉及基于水溶性发光纳米金簇的生物传感荧光检测抗癌药物米托蒽醌新方法。
背景技术
[0002] 米托蒽醌是正在被临床上广泛使用的一种新型抗癌药物，属于蒽醌类抗癌药物，其对多数恶性肿瘤均有显著的临床功效[参见：Thackery, Ellen. The Gale
Encyclopedia of Cancer: L-Z. Detroit: Thomson Gale. 2002, pp: 708-710.]，对该药物的定量测定有助于临床医学诊断。当前，蒽醌类抗癌药物的测定方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、HPLC-MS联用法，而光谱分析研究很少，且仅有的荧光光谱法和分光光度法大都有缺陷例如灵敏度低、选择性差，因此，寻找新的高灵敏、高选择性、简便、快速的光谱检测新方法具有重要的研究意义。《分析化学》2012年12月8卷12期中《米托蒽醌在金电极上的电化学研究及其应用》报道了一种利用金电极检测米托蒽醌的方法，其实验方法为步骤一：金电极的处理, 将金电极用Al2O3粉抛光,在无水乙醇、丙酮和纯水中分别超声洗涤5 min, 并重复3次,然后进行电化学活化处理（即在0. 5 mol/L H2SO4 中于－0.3～
1.5 V电位范围内进行循环伏安(CV) 扫描）,直到获得稳定的循环伏安响应；步骤二循环伏安(CV)实验先将金电极在BR缓冲溶液中进行多次循环伏安扫描(扫描范围为－0.5～
1.6 V)直至获得稳定的循环伏安曲线，然后加入适量米托蒽醌标准溶液,搅拌1 min，通氮除氧2 min后放入电极，等待4 min, 在－0.5～1.6 V电位范围内以80 mV/s的扫描速
率进行循环伏安扫描。每次测定完后,将电极用二次蒸馏水冲洗,并在空白底液中循环伏
安扫描至电流稳定,以除去吸附在电极表面的物质,达到活化电极的目的，实验表明，米托-9 -8 -8 -7
蒽醌的氧化峰电流与其浓度在1.0×10 ～1.0×10 mol/L、1.0×10 ～1.0×10 mol/
-7 -6
L、1.0×10 ～1.0×10 mol/L范围内均呈良好的线性关系，线性方程和相关系数分别为
y=1.2421x + 0.5639, r=0.9906； y=1.6952x + 10.3, r=0.9998； y=3.7636x + 23.575, -10 -7
r=0.9994。检出限可达5.6×10 mol/L；对1.0×10 mol/L的米托蒽醌平行测定10次
的相对标准偏差为3.8%。
Encyclopedia of Cancer: L-Z. Detroit: Thomson Gale. 2002, pp: 708-710.]，对该药物的定量测定有助于临床医学诊断。当前，蒽醌类抗癌药物的测定方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、HPLC-MS联用法，而光谱分析研究很少，且仅有的荧光光谱法和分光光度法大都有缺陷例如灵敏度低、选择性差，因此，寻找新的高灵敏、高选择性、简便、快速的光谱检测新方法具有重要的研究意义。《分析化学》2012年12月8卷12期中《米托蒽醌在金电极上的电化学研究及其应用》报道了一种利用金电极检测米托蒽醌的方法，其实验方法为步骤一：金电极的处理, 将金电极用Al2O3粉抛光,在无水乙醇、丙酮和纯水中分别超声洗涤5 min, 并重复3次,然后进行电化学活化处理（即在0. 5 mol/L H2SO4 中于－0.3～
1.5 V电位范围内进行循环伏安(CV) 扫描）,直到获得稳定的循环伏安响应；步骤二循环伏安(CV)实验先将金电极在BR缓冲溶液中进行多次循环伏安扫描(扫描范围为－0.5～
1.6 V)直至获得稳定的循环伏安曲线，然后加入适量米托蒽醌标准溶液,搅拌1 min，通氮除氧2 min后放入电极，等待4 min, 在－0.5～1.6 V电位范围内以80 mV/s的扫描速
率进行循环伏安扫描。每次测定完后,将电极用二次蒸馏水冲洗,并在空白底液中循环伏
安扫描至电流稳定,以除去吸附在电极表面的物质,达到活化电极的目的，实验表明，米托-9 -8 -8 -7
蒽醌的氧化峰电流与其浓度在1.0×10 ～1.0×10 mol/L、1.0×10 ～1.0×10 mol/
-7 -6
L、1.0×10 ～1.0×10 mol/L范围内均呈良好的线性关系，线性方程和相关系数分别为
y=1.2421x + 0.5639, r=0.9906； y=1.6952x + 10.3, r=0.9998； y=3.7636x + 23.575, -10 -7
r=0.9994。检出限可达5.6×10 mol/L；对1.0×10 mol/L的米托蒽醌平行测定10次
的相对标准偏差为3.8%。
发明内容
[0003] 近年来，贵金属纳米簇正在逐步成为可替代传统荧光基团的新型的荧光探针而备受关注，这主要是由于其具有超小尺寸、高量子产量、光稳定性、无毒等特性[参见：Zheng J.，Nicovich P. R.，Dickson R. M. Annu. Rev. Phys. Chem., 2007, 58, 409-431.]。尤其是以生物大分子物质如蛋白质作为模板合成出的具有水溶性、良好的生物相容性、发光的金纳米簇吸引了相当广泛的关注 [参见：Wei H., Wang Z., Yang L., Tian S., Hou C., Lu Y. Analyst，2010，135, 1406-1410.]。迄今为止，利用BSA为模板合成的荧光纳米金簇测定米托蒽醌的工作尚未见报道。
[0004] 本发明的目的是提供一种基于水溶性发光纳米金簇的生物传感荧光检测抗癌药物米托蒽醌新方法，以解决现有检测米托蒽醌技术中的不足。本发明的技术方案如下：一种基于发光金纳米簇检测米托蒽醌的方法，包括以下步骤：步骤一，制备金纳米簇，在469nm波长光的激发下，测定金纳米簇在619nm波长处的荧光强度，记为F0；步骤二，在步骤一中加入不同质量米托蒽醌后，测定含有不同浓度米托蒽醌的金纳米簇在469nm波长光激发
下，在619 nm波长处的荧光强度，记为F，根据加入不同质量米托蒽醌后，荧光强度的变化值，计算出加入米托蒽醌前后金纳米簇荧光强度的变化值与米托蒽醌浓度的线性关系；步骤三，将待测样品加入金纳米簇中，测试其加入前后在469nm波长光的激发下，在619nm波长处的荧光强度的变化值，根据步骤二得到的线性关系，计算出加入米托蒽醌的质量或浓度。
下，在619 nm波长处的荧光强度，记为F，根据加入不同质量米托蒽醌后，荧光强度的变化值，计算出加入米托蒽醌前后金纳米簇荧光强度的变化值与米托蒽醌浓度的线性关系；步骤三，将待测样品加入金纳米簇中，测试其加入前后在469nm波长光的激发下，在619nm波长处的荧光强度的变化值，根据步骤二得到的线性关系，计算出加入米托蒽醌的质量或浓度。
[0005] 所述荧光强度测试时仪器的狭缝宽度设定为5 nm。
[0006] 所述步骤一中金纳米簇的制备步骤为：制备 10 mg/mL的四氯金酸溶液，取刚制备的溶液加入到牛血清白蛋白溶液中，期间进行剧烈搅拌，使之充分混均，2分钟后，再加入◦NaOH溶液，继续搅拌12小时，保持温度在37 C。
[0007] 本发明的有益技术效果：
[0008] 1、本发明的检测方法具有高选择性、高灵敏度、简便、易行等特性。
[0009] 2、该检测方法可以推广到蒽醌类抗癌药物的测定，以及其它药物的检测中。
[0010] 3、该方法的建立可以为药物的高灵敏、快速检测提供新思路。
附图说明
[0011] 图1发光纳米金簇荧光猝灭检测米托蒽醌示意图
[0012] 图2加入实施例1中不同浓度的米托蒽醌药物后的金纳米簇的荧光强度值。
[0013] 具体实施方式：
[0014] 实施例1
[0015] 以BSA为模板合成具有荧光特性的纳米金簇：荧光纳米金簇的合成是根据文献报道的方法 [参见：Xie J.，Zheng Y., Ying J. Y. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131,
888-889.]，做了一些改进，过程如下：首先，将1g四氯金酸溶于100 mL双蒸水，形成10 mg/mL的储备液。然后，取4.1 mL刚制备的溶液加入到10 mL浓度为50 mg/mL牛血清白蛋白
◦
溶液中，反应温度37 C，期间进行剧烈搅拌，使之充分混均。2分钟后，再加入1 mL浓度为◦
1.0 mol/L NaOH溶液，继续搅拌12小时，保持温度在37 C。改进后，合成时间由三天缩短为12小时。制备出的金纳米簇探针，具有稳定的荧光特性，在619 nm波长处有最大发射峰，激发波长为469 nm。
888-889.]，做了一些改进，过程如下：首先，将1g四氯金酸溶于100 mL双蒸水，形成10 mg/mL的储备液。然后，取4.1 mL刚制备的溶液加入到10 mL浓度为50 mg/mL牛血清白蛋白
◦
溶液中，反应温度37 C，期间进行剧烈搅拌，使之充分混均。2分钟后，再加入1 mL浓度为◦
1.0 mol/L NaOH溶液，继续搅拌12小时，保持温度在37 C。改进后，合成时间由三天缩短为12小时。制备出的金纳米簇探针，具有稳定的荧光特性，在619 nm波长处有最大发射峰，激发波长为469 nm。
[0016] 利用制备得到的荧光金纳米簇探针检测抗癌药物米托蒽醌具体步骤：取300 μL制备的纳米金簇样品，加入到离心管中，然后加入一系列浓度的米托蒽醌药物工作溶液，分别检测不同浓度米托蒽醌对金纳米簇探针的荧光信号的影响（终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54 µg/mL）。用双蒸水稀释到终体积为3 mL，混合均匀，进行测定。在469 nm波长光的激发下，测试金纳米簇的荧光光谱，仪器的狭缝宽度设定为5 nm， 检测619 nm波长处的发射峰荧光强度。测试加入药物后样品的荧光信号，记录在该最大发射峰位置的荧光强度，表示为：ΔF = F0 – F, 其中，F0 和 F分别为纳米金簇自身及加入抗癌药物后的荧光强度。加入药物，探针的荧光信号出现荧光猝灭现象，且随着药物浓度的增加，探针荧光信号强度随之减弱，在2~20 µg/mL浓度范围内，米托蒽醌浓度与探针的荧光强度呈现出良好的线性关系，其检出限为1 µg/mL。
[0017] 人血清样品测试：取新鲜人血清样品，加入适量的酚－氯仿－异戊醇 (v/v/v =25: 24: 1) 溶液沉淀样品中的蛋白质，高速离心后取上清液稀释100倍作为待测溶液。在PE管中依次加入300 μL血样、300 μL合成的纳米金簇、一定量的米托蒽醌，用双蒸水稀释到3 mL，混合均匀，然后进行分析测定，结果见表1。
[0018] 表1 人血清样品的测试结果
[0019]
[0020] 实施例2
[0021] 利用制备得到的荧光金纳米簇探针检测抗癌药物柔红霉素具体步骤：取300 μL制备的纳米金簇样品，加入到离心管中，然后加入一系列浓度的柔红霉素药物工作溶液，分别检测不同浓度柔红霉素对金纳米簇探针的荧光信号的影响（终浓度为0、2、4、10、20、50、70、100、110、120、130、140 µg/mL）。用双蒸水稀释到终体积为3 mL，混合均匀，进行测定。
在469 nm波长光的激发下，测试金纳米簇的荧光光谱，仪器的狭缝宽度设定为5 nm，检测
619 nm波长处的发射峰荧光强度。测试加入药物后样品的荧光信号，记录在该最大发射峰位置的荧光强度，表示为：ΔF = F0 – F, 其中，F0 和F分别为纳米金簇自身及加入抗癌药物后的荧光强度。加入药物，探针的荧光信号出现荧光猝灭现象，且随着药物浓度的增加，探针荧光信号强度随之减弱，在1~18 µg/mL浓度范围内，柔红霉素浓度与探针的荧光强度呈现出良好的线性关系，其检出限为0.5 µg/mL。
在469 nm波长光的激发下，测试金纳米簇的荧光光谱，仪器的狭缝宽度设定为5 nm，检测
619 nm波长处的发射峰荧光强度。测试加入药物后样品的荧光信号，记录在该最大发射峰位置的荧光强度，表示为：ΔF = F0 – F, 其中，F0 和F分别为纳米金簇自身及加入抗癌药物后的荧光强度。加入药物，探针的荧光信号出现荧光猝灭现象，且随着药物浓度的增加，探针荧光信号强度随之减弱，在1~18 µg/mL浓度范围内，柔红霉素浓度与探针的荧光强度呈现出良好的线性关系，其检出限为0.5 µg/mL。
[0022] 人血清样品测试：取新鲜人血清样品，加入适量的酚－氯仿－异戊醇 (v/v/v =25: 24: 1) 溶液沉淀样品中的蛋白质，高速离心后取上清液稀释100倍作为待测溶液。在PE管中依次加入300 μL血样、300 μL合成的纳米金簇、一定量的柔红霉素，用双蒸水稀释到3 mL，混合均匀，然后进行分析测定，结果见表2。
[0023] 表2 人血清样品的测试结果
[0024]
[0025] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。