本发明提供了通过给予动物神经退行性疾病缓解量的褪黑素以缓解动物神经退行性疾病的方法。通常而言，褪黑素给予的量为0.1ng/kg/天至约10mg/kg/天，或者约0.2ng/天至约3g/天。在优选的方法中，所述褪黑素作为食品组合物的一部分给予。
1.在动物中缓解神经退行性疾病的方法，该方法包括给予动物神经退行性疾病缓解量的褪黑素。
2.权利要求1的方法，其中所述褪黑素给予的量为约0.1ng/kg/天至约10mg/kg/天。
3.权利要求1的方法，其中所述褪黑素给予的量为约0.2ng/天至约3g/天。
4.权利要求1的方法，其中所述褪黑素在可食用组合物中给予。
5.权利要求4的方法，其中所述褪黑素作为膳食补充剂给予。
6.权利要求4的方法，其中所述可食用组合物为食品组合物。
7.权利要求6的方法，其中所述食品组合物为人用或宠物食品组合物。
8.权利要求6的方法，其中所述食品组合物为犬科或猫科食品组合物。
9.权利要求6的方法，其中所述食品组合物为狗或猫的食品组合物。
10.权利要求1的方法，其中所述动物为人类或宠物。
11.权利要求10的方法，其中所述宠物为犬科或猫科动物。
13.在动物中激活自噬信号通路的方法，该方法包括给予动物自噬信号通路激活量的褪黑素。
14.权利要求13的方法，其中所述褪黑素给予的量为约0.1ng/kg/天至约10mg/kg/天。
15.权利要求13的方法，其中所述褪黑素给予的量为约0.2ng/天至约3g/天。
16.权利要求13的方法，其中所述褪黑素在可食用组合物中给予。
17.权利要求16的方法，其中所述褪黑素作为膳食补充剂给予。
18.权利要求16的方法，其中所述可食用组合物为食品组合物。
19.权利要求18的方法，其中所述食品组合物为人用或宠物食品组合物。
20.权利要求18的方法，其中所述食品组合物为犬科或猫科食品组合物。
21.权利要求18的方法，其中所述食品组合物为狗或猫的食品组合物。
22.权利要求13的方法，其中所述动物为人类或宠物。
23.权利要求22的方法，其中所述宠物为犬科或猫科动物。
25.在动物中抑制mTOR表达的方法，该方法包括给予动物mTOR表达抑制量的褪黑素。
26.权利要求25的方法，其中所述褪黑素给予的量为约0.1ng/kg/天至约10mg/kg/天。
27.权利要求25的方法，其中所述褪黑素给予的量为约0.2ng/天至约3g/天。
28.权利要求25的方法，其中所述褪黑素在可食用组合物中给予。
29.权利要求28的方法，其中所述褪黑素作为膳食补充剂给予。
30.权利要求28的方法，其中所述可食用组合物为食品组合物。
31.权利要求30的方法，其中所述食品组合物为人用或宠物食品组合物。
32.权利要求30的方法，其中所述食品组合物为犬科或猫科食品组合物。
33.权利要求30的方法，其中所述食品组合物为狗或猫的食品组合物。
34.权利要求25的方法，其中所述动物为人类或宠物。
35.权利要求34的方法，其中所述宠物为犬科或猫科动物。
37.在动物中抑制S6激酶表达的方法，该方法包括给予动物S6激酶表达抑制量的褪黑素。
38.权利要求37的方法，其中所述褪黑素给予的量为约0.1ng/kg/天至约10mg/kg/天。
39.权利要求37的方法，其中所述褪黑素给予的量为约0.2ng/天至约3g/天。
40.权利要求37的方法，其中所述褪黑素在可食用组合物中给予。
41.权利要求40的方法，其中所述褪黑素作为膳食补充剂给予。
42.权利要求40的方法，其中所述可食用组合物为食品组合物。
43.权利要求42的方法，其中所述食品组合物为人用或宠物食品组合物。
44.权利要求42的方法，其中所述食品组合物为犬科或猫科食品组合物。
45.权利要求42的方法，其中所述食品组合物为狗或猫的食品组合物。
46.权利要求37的方法，其中所述动物为人类或宠物。
47.权利要求46的方法，其中所述宠物为犬科或猫科动物。
49.影响与动物mTOR表达增加相关的一或多种病症或疾病的方法，该方法包括给予动物病症或疾病影响量的褪黑素。
50.权利要求49的方法，其中所述褪黑素给予的量为约0.1ng/kg/天至约10mg/kg/天。
51.权利要求49的方法，其中所述褪黑素给予的量为约0.2ng/天至约3g/天。
52.权利要求49的方法，其中所述褪黑素在可食用组合物中给予。
53.权利要求52的方法，其中所述褪黑素作为膳食补充剂给予。
54.权利要求52的方法，其中所述可食用组合物为食品组合物。
55.权利要求54的方法，其中所述食品组合物为人用或宠物食品组合物。
56.权利要求54的方法，其中所述食品组合物为犬科或猫科食品组合物。
57.权利要求54的方法，其中所述食品组合物为狗或猫的食品组合物。
58.权利要求49的方法，其中所述动物为人类或宠物。
59.权利要求58的方法，其中所述宠物为犬科或猫科动物。
61.权利要求49的方法，其中所述病症或疾病为移植排斥、运动神经元疾病、癌症、心血管疾病和糖尿病。
62.权利要求49的方法，其中所述病症或疾病为老龄化。
63.包装产品，该包装产品包括至少一种适合于包含褪黑素的材料以及附着于该材料上的标签，它包括词语、图片、外观设计、首字母缩略词、标语、短语或其它图案或其组合，该标签表明了所述包装产品含有用于下列情况的化合物：缓解神经退行性疾病、激活自噬信号通路、抑制mTOR的表达、抑制S6激酶的表达、影响一或多种与动物mTOR表达增加有关的病症或疾病或其组合。
64.权利要求63的包装产品，该包装产品还包含褪黑素。
65.权利要求63的包装产品，该包装产品还包含至少一个视窗。
66.在体外神经元中抑制mTOR或S6激酶表达的方法，该方法包括将神经元暴露于mTOR表达抑制量的或S6激酶表达抑制量的褪黑素。
67.在体外细胞中抑制mTOR或S6激酶表达的方法，该方法包括将细胞暴露于mTOR表达抑制量的或S6激酶表达抑制量的褪黑素。
68.权利要求67的方法，其中所述细胞为获自完整动物的原代细胞、获自建立的细胞系的细胞或者从一种类型转化为另一种类型的细胞。
缓解神经退行性疾病的方法
[0001] 相关申请的交互参考
[0002] 本申请要求提交于2011年6月8日的美国临时申请序列号61/520332的优先权，其公开的内容全文引入本文作为参考。
技术领域
[0003] 从广义上讲，本发明涉及缓解神经退行性疾病的方法，更特别地讲，本发明涉及采用褪黑素缓解动物神经退行性疾病的方法。
背景技术
[0004] 神经退行性疾病与多种严重的并且致命的动物疾病有关，例如阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿氏病。这些迟发性疾病与由毒蛋白所导致的细胞内聚集体的形成有关。一种目前流行的理论是，这些细胞质毒性蛋白的聚集导致了神经退行性疾病，因为毒蛋白质能够引发神经细胞死亡。在这种情况下，神经细胞显然已经失去了降解这些毒蛋白质的能力。
[0005] 胞浆蛋白的降解是由被称为巨自噬的细胞过程所介导的，该过程也可以简单地称为自噬。在神经细胞中减少自噬会导致神经退行性病变。自噬的减少与ATG7基因或ATG5基因的缺陷有关，该基因产生的蛋白质在自噬中发挥重要的作用。
[0006] 多种蛋白激酶已经被证明能够调节自噬。其中研究的最为透彻的是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它能够调节细胞生长、细胞增殖、细胞运动、细胞存活、蛋白质合成和转录。mTOR属于磷脂酰肌醇3-激酶相关的激酶蛋白家族。当以灭活或去磷酸化形式存在时，mTOR能够激活自噬信号通路。US7052870公开了用于调节mTOR通路的方法。
[0007] 调节自噬的方法是已知的。雷帕霉素能够特异性地抑制mTOR，这使得自噬信号通路能够被诱导引发。然而，长期的雷帕霉素治疗具有副作用，包括伤口愈合不良和免疫抑制。
[0008] 因此，需要抑制mTOR表达、增加自噬并缓解动物神经退行性疾病的新方法。
[0009] 发明概述
[0010] 因此，本发明的目的是提供缓解动物神经退行性疾病的方法。
[0011] 本发明的另一个目的是提供激活动物自噬信号通路的方法。
[0012] 本发明的另一个目的是提供抑制动物mTOR表达的方法。
[0013] 本发明的另一个目的是提供抑制动物S6激酶表达的方法。
[0014] 通过给予动物褪黑素可以实现一个或多个这些或其它的目的，所述褪黑素的量应当足以缓解神经退行性疾病、激活自噬信号通路、抑制mTOR的表达、抑制S6激酶的表达或其组合。通常而言，给予动物的褪黑激素的量为约0.1ng/kg/天至约10mg/kg/天，优选约0.5ng/kg/天至约5mg/kg/天，更优选约1ng/kg/天至约2mg/kg/天。
[0015] 本发明的其它目的、特征和优点对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0016] 发明详述
[0017] 定义
[0018] 术语“神经退行性疾病”是指神经元的结构或功能的渐进性的丧失，包括神经元死亡。
[0019] 术语“褪黑素”是指5-甲氧基-N-乙酰基色胺及其具有与-甲氧基-N-乙酰基色胺基本上相同的生物活性的衍生物或类似物，还包括它们的体内前体。该术语也是指在自噬信号通路上具有与5-甲氧基-N-乙酰基色胺基本上相同的生物活性的任何其它激素。
[0020] 术语“动物”是指可以受益于神经退行性疾病缓解的任何动物，包括人、鸟类、牛、犬、马、猫、hicrine、狼、鼠、羊或猪类。
[0021] 术语“宠物”是指家养动物，如狗、猫、鸟、兔、豚鼠、猪、雪貂、仓鼠、小鼠、沙鼠、乐趣马(pleasure horses)、牛、山羊、绵羊、驴、猪以及人类由于陪伴、娱乐、精神支持、外向显示和人类需要与其他物种的动物分享的所有其他功能所保持的外来物种。
[0022] 术语“ng/kg”是指每公斤动物体重所对应的纳克数。
[0023] 术语“mg/kg”是指每公斤动物体重所对应的毫克数。
[0024] 术语“膳食补充剂”是指除了正常动物饮食外意欲摄取的产品。膳食补充剂可以是任何形式，例如固体、液体、凝胶、片剂、胶囊剂、粉剂等。优选它们以方便的剂型提供。在一些实施方案中，它们以散装零售包装的形式提供，例如散装粉末、液体、凝胶或油。在其它实施方案中，补充剂以包含在其它食品中的批量形式提供，如小吃、零食、补充食品棒、饮料等。
[0025] 在本文中，范围采用简写形式，以避免必须列出和描述该范围内的每一个和所有的值。在适当情况下，可以选择范围内的任何适当的值作为上限值、下限值或该范围的端点值。
[0026] 除非上下文另有明确规定，否则本文所使用的词语的单数形式包括复数，反之亦然。因此，提及的“一”，“一个”和“该”通常包括各术语的复数形式。例如，提及“一种化合物”或“一种方法”包括多种这样的“化合物”或“方法”。同样，词语“包括”、“包含”和“含有”应当是非排他性的，而不是唯一的。同样，术语“包括”、“包含”和“或”都应该被解释为包括性的，除非这样的用法结构与上下文的内容明显相矛盾。
[0027] 术语“包括”或“含有”应当包括术语“基本上由...组成”和“由...组成”所涵盖的实施方案。同样，术语“基本上由......组成”应当包括术语“由...组成”所涵盖的实施方案。
[0028] 本文所公开的方法和组合物以及其它改进方案不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为正如本领域技术人员所理解的那样，它们可能会发生变化。另外，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而并非意欲限制或者限制所公开或要求保护的范围。
[0029] 除非另有说明，否则本文所使用的所有的技术和科学术语、本领域的术语以及缩写词均具有本发明领域或所述术语使用的领域的技术人员所通常理解的意义。虽然类似于或等同于本文描述的任何组合物、方法、制品或其它手段或材料可以用于实施本发明，但优选本文所述的组合物、方法、制品或其它手段或材料。
[0030] 本文所引用或参考的所有的专利、专利申请、出版物、技术和/或学术文章和其他参考资料以其在法律允许的范围内的全部内容在本文中引用作为参考。这些参考文献的讨论仅仅旨在总结其中作出的结论。申请人并非要承认任何此类专利、专利申请、出版物或参考文献或其任何部分都是相关的、具有实质性意义的或者属于现有技术。申请人特别保留对于此类专利、专利申请、出版物和其他参考文献作为具有相关性、具有实质性意义或者属于现有技术的任何断言的准确性和相关性进行挑战的权利。
发明内容
[0031] 一方面，本发明提供了缓解动物神经退行性疾病的方法。所述方法包括给予动物缓解神经退行性疾病量的褪黑素。
[0032] 另一方面，本发明提供了激活动物自噬信号通路的方法。所述方法包括给予动物自噬信号通路激活量的褪黑素。
[0033] 另一方面，本发明提供了在动物中抑制mTOR表达的方法。所述方法包括给予动物mTOR表达抑制量的褪黑素。
[0034] 另一方面，本发明提供了提供了在动物中抑制S6激酶表达的方法。所述方法包括给予动物S6激酶表达抑制量的褪黑素。
[0035] 另一方面，本发明提供了影响一或多种与动物mTOR表达增加有关的病症或疾病的方法。所述方法包括给予动物病症或疾病影响量的褪黑素。褪黑素可以用于影响任何与动物mTOR表达增加有关的病症或疾病，例如移植排斥、老化、年龄相关视网膜疾病、运动神经元疾病、视网膜病、癌症、心血管疾病和糖尿病。通常而言，将褪黑激素给予动物以降低mTOR的表达，从而以有益于动物的方式影响疾病的状态，例如，改善动物的健康状况、减轻病症或疾病的严重程度或减轻疾病或病症所能导致的症状。
[0036] 本发明基于下列基础发现：褪黑素在动物中对于下列一或多种情况有效：缓解神经退行性疾病、激活自噬信号通路、抑制mTOR的表达或抑制S6激酶的表达。虽然不希望受任何理论的约束，但是申请人认为褪黑素能够影响mTOR和S6激酶的表达，调节此类表达能够激活神经元中的自噬信号通路并且能够缓解由于神经元中毒蛋白积聚所导致的神经退行性疾病。
[0037] 对于本发明方法而言，将褪黑素以对于下列情况有效的量给予动物：缓解神经退行性疾病、激活自噬信号通路、抑制mTOR的表达、抑制S6激酶的表达、影响一或多种与mTOR表达增加有关的病症或疾病或其组合。在各种实施方案中，给予动物褪黑素的量为约0.1ng/kg/天至约10mg/kg/天，优选约0.5ng/kg/天至约5mg/kg/天，更优选约1ng/kg/天至约2mg/kg/天。在其它实施方案中，给予动物的褪黑素的量为约0.2ng/天至约50mg/天，优选约0.5ng/天至约20mg/天，更优选约1ng/天至约10mg/天。在其它实施方案中，给予动物的褪黑素的量为约0.05mg/天至约5mg/天，优选约0.3mg/天至约3mg/天，更优选约0.1mg/天至约1mg/天。技术人员可以根据动物的种属、年龄、大小、体重、健康情况、疾病状态等选择给予动物的褪黑素的量。
[0038] 褪黑素可以采用任何适当的方法给予，优选口服。通常，褪黑素可以以胶囊、凝胶剂、片剂或其它适当的口服剂型的形式给予。在优选的实施方案中，褪黑素可以作为可食用组合物的一部分给予，优选食品组合物或膳食补充剂。在某些实施方案中，褪黑素作为宠物食品组合物的成分给予，优选为犬科如狗或猫科如猫制备的食品组合物。在最优选的实施方案中，所述食品组合物是为狗或猫配制的。在其它实施方案中，褪黑素作为膳食补充剂给予。
[0039] 对于口服给药而言，褪黑素可以根据常规方法与可药用赋形剂一起结合制成例如片剂或胶囊，所述赋形剂例如为粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或羧甲基淀粉纳)或润湿剂(如十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域中已知的方法进行包衣。口服给药的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或混悬液的形式，或者它们可以为干产物，在使用前用水或其它适宜载体重构。这种液体制剂可以通过常规方法采用药学上可接受的添加剂制备，所述添加剂例如助悬剂(如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)、乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)、非水性载体(例如，ationd oil、油性酯、乙醇或分馏植物油)和防腐剂(如甲基或丙基-对羟基苯甲酸酯或山梨酸)。适当的话，该制剂也可含有缓冲盐、矫味剂、着色剂和甜味剂。口服给药制剂可以经过适当地配制，以使褪黑激素控制释放。在一个优选的实施方案中，褪黑激素可以结合到片剂或胶囊剂中。
[0040] 给予动物的褪黑素可以是任何适合于给予动物的褪黑素。褪黑素可以获自任何适当的来源，包括合成的或天然的。优选的褪黑素来源是合成的褪黑素，例如在片剂、胶囊中和舌下片形式中。其它来源包括获自天然来源的褪黑素，例如来源于藻类、真菌和植物，如种子和核桃。褪黑素可以源自混合的褪黑素来源，包括天然的或合成的。对于可食用的组合物而言，褪黑素通常源自藻类或其它天然成分，它可以作为可食用组合物例如宠物食品组合物的成分包含在内。
[0041] 另一方面，本发明提供了用于包含本发明褪黑素的包装产品。该包装产品包括至少一种适合于包含褪黑素的材料以及附着于该材料上的标签，它包括词语、图片、外观设计、首字母缩略词、标语、短语或其它图案及其组合，该标签表明包装产品含有用于下列情况的化合物：缓解神经退行性疾病、激活自噬信号通路、抑制mTOR的表达、抑制S6激酶的表达、影响一或多种与动物mTOR表达增加有关的病症或疾病或其组合。通常，此类设计包括词语“缓解神经退行性疾病”或“激活自噬”或“抑制mTOR表达”或“抑制S6激酶表达”或“影响一或多种与mTOR表达增加有关的病症或疾病”或“延缓老化”或印刷在材料商的相似表述。任何适合于包含褪黑素的包装结构和包装材料均可以用于本发明，例如由纸、塑料、箔、金属等制造的包、盒、药囊、瓶、罐、袋等。在优选的实施方案中，所述包装产品还包含褪黑素。在各种实施方案中，所述包装产品还包含至少一个视窗(window)，它使得无需打开包装产品即可以观看到包装内容物。在某些实施方案中，所述视窗为包装材料的透明部分。在另外的实施方案中，所述视窗为包装材料的缺失部分。
[0042] 另一方面，本发明提供了在体外神经元中抑制mTOR或S6激酶表达的方法。所述方法包括将神经元暴露于mTOR表达抑制量的或S6激酶表达抑制量的褪黑素。通常，将神经元暴露于含有或不含血清的细胞培养基，该培养基通常含有非常低水平的或者检测不到水平的褪黑素。因此，将神经元暴露于富含合成褪黑素或提取的或天然来源的褪黑素的介质中能够抑制mTOR或S6激酶的表达、诱导自噬过程或缓解神经退行性疾病。
[0043] 另一方面，本发明提供了在体外抑制细胞mTOR或S6激酶表达的方法。这些细胞包括但不限于获自完整动物的原代细胞、获自建立的细胞系的细胞或者由一种类型转化为另一种类型的细胞。所述方法包括将细胞暴露于mTOR表达抑制量的或S6激酶表达抑制量的褪黑素。通常，将细胞暴露于含有或不含血清的细胞培养基，该培养基通常含有非常低水平的或者检测不到水平的褪黑素。因此，将细胞暴露于富含合成褪黑素或提取的或天然来源的褪黑素的介质中能够抑制mTOR或S6激酶的表达、诱导自噬过程或缓解神经退行性疾病。实施例
[0044] 本发明可以通过下列实施例来进一步说明，但是应当理解，除非另有明确说明，这些实施例仅仅是用于说明的目的，并非用于限制本发明的范围。
[0045] 实施例1
[0046] 细胞培养方法：市售Madin Darby犬肾(MDCK)细胞获自ATCC，作为永生化细胞的储备混悬液。将MDCK细胞于37℃、95%的空气/5%的CO2的氛围中在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养，该培养基含有10%胎牛血清和1%抗生素/抗微生物溶液(在DMEM中)。更换培养基并且采用含有0.05%胰蛋白酶的溶液每1－2天将细胞传代一次。对于2
RNA提取而言，将细胞以50,000-60,000个细胞/cm 的接种密度涂布于35mm的盘中。接种后24小时，将培养基更换为对照培养基(在DMEM中)或实验培养基(在DMEM中+1nM褪黑素)。分别于暴露于对照培养基或实验培养基后第1、3或5天收集细胞。在收集细胞的当天更换其余盘中的培养基。
[0047] 采用RNAlater RNA稳定剂并且根据制造商的说明(Ambion,Austin,Texas)自MDCK细胞裂解液收集总RNA。在培养基处理的第1、3和5天，通过半定量qPCR分析mTOR、S6激酶和TATA box结合蛋白基因的mRNA转录。TATA盒结合蛋白基因转录用于归一化mTOR和S6激酶的表达，因为它广泛用作“管家”基因。
[0048] 实施例2
[0049] 重复实施例1的步骤。获自实施例1和实施例2的数据如表1所示。
[0050] 表1
[0051]
