通过双溶剂法提取极性脂质

摘要

一种使用两亲性溶剂组和疏水性溶剂组从植物材料，特别是完整的藻类细胞分离极性脂质的方法。一些实施方案包括使完整的藻类细胞脱水和然后从所述藻类细胞提取极性脂质。所述方法提供单步和多步提取工艺，其允许藻类极性脂质从湿藻类生物质中有效分离同时避免提取混合物的乳化。这些极性脂质为可用作表面活性剂、去垢剂和食品添加剂的高价值产物。在提取极性脂质之后在藻类生物质中剩余的中性脂质可用于产生可再生燃料。

权利要求

1.一种从完整的藻类细胞分离极性脂质的方法，其包括：提供包含完整藻类细胞的湿藻类生物质，所述完整藻类细胞包含极性脂质；

通过去除胞外水分而使所述湿藻类生物质脱水以将所述湿藻类生物质的固体含量增加至5%w/w至50%w/w之间，从而产生部分脱水的湿藻类生物质；

将所述部分脱水的湿藻类生物质与两亲性溶剂组和疏水性溶剂组混合以产生包含较重相和较轻相的提取混合物，其中所述较重相包含两亲性溶剂组和部分脱水的湿藻类生物质，且所述较轻相包含疏水性溶剂组和极性脂质；

将所述提取混合物的较重相与所述提取混合物的较轻相分离；以及将所述极性脂质从所述较轻相中分离以产生极性脂质级分。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱水通过离心、过滤、沉降或漂浮分级分离进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在加入所述疏水性溶剂组之前添加一定量的两亲性溶剂组以将所述提取混合物的极性指数调节至约6.5至6.7。

4.根据权利要求3所述的方法，其中在加入所述两亲性溶剂组之后添加一定量的疏水性溶剂组以将所述提取混合物的极性指数调节至约5.7至5.9。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述两亲性溶剂组为丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、丁酮、二甲醚和丙醛、2-丙醇、乙腈、叔丁醇、1-丙醇、水、重水(D2O)、乙二醇、甘油或其组合。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水性溶剂组为丙烷、丁烷、戊烷、丁烯、丙烯、石脑油、烷烃、己烷、戊烷、庚烷、辛烷、酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、芳烃、甲苯、苯、环己烷、四氢呋喃、卤代烷烃、氯仿、三氯乙烯、醚、二乙醚、柴油、喷气燃料、汽油及其组合。

7.根据权利要求1所述的方法，其中将所述较重相与所述较轻相分离包括滗析、膜过滤或离心。

8.根据权利要求1所述的方法，其中将所述极性脂质从所述较轻相分离包括蒸发或蒸馏。

9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括回收所述疏水性溶剂组。

10.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括浓缩且回收所述疏水性溶剂组。

11.根据权利要求1所述的方法，其中加热所述提取混合物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述提取混合物用微波、水、蒸汽、热油或电力进行加热。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取混合物在加压反应器中进行加热。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述加压反应器为分批反应器或连续反应器。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述提取混合物用微波、水、蒸汽、热油或电力进行加热。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取混合物在大气压力下进行加热。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述提取混合物用微波、水、蒸汽、热油或电力进行加热。

说明书

通过双溶剂法提取极性脂质

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求于2011年11月1日提交的标题为"Extraction of Polar Lipids by a Two Solvent Method"的美国专利申请No.13/286,889的优先权，美国专利申请No.13/286,889为于2011年4月6日提交的标题为"Extraction with Fractionation of Oil and Proteinaceous Material from Oleaginous Material"的美国专利申请No.13/081,197的部分继续申请案，美国专利申请No.13/081,197要求于2010年4月6日提交的标题为"Extraction with Fractionation of Oil and Proteinaceous Material from Oleaginous Material"的美国临时申请No.61/321,290和于2010年4月6日提交的标题为"Extraction With Fractionation of Oil and Co-Products from Oleaginous Material"的美国临时申请No.61/321,286的权益，这些专利申请的全部内容据此通过引用并入本文。发明领域

[0003] 本发明涉及提取和分级分离藻类产物，包括但不限于油类和蛋白质。特别地，本文公开的方法和系统涉及极性脂质的分离。更具体地说，本文所述的系统和方法以两亲性和疏水性溶剂利用分步提取和分级分离来加工湿藻类生物质。

[0004] 发明背景

[0005] 石油为一类主要由烃组成的天然资源。从地球中提取石油是非常昂贵的、危险的且通常以牺牲环境为代价。此外，世界范围内的石油储备正在迅速减少。由于运输和将石油转化成有用的燃料(诸如汽油和喷气燃料)所需的加工，成本还增加了。

[0006] 近年来，藻类由于其生产脂质的能力已经获得了显著的重要性，所述脂类可用于生产可持续的生物燃料。这种能力可用于生产可再生燃料、减少全球气候变化和处理废水。藻类作为生物燃料原料的优越性来自多种因素，包括与典型的陆生油料作物相比高的每英亩产量，基于非食物的原料资源，使用另外的非生产性、非可耕性土地，采用多种水源(淡水、咸水、盐水和废水)，生产生物燃料和有价值的副产物(诸如类胡萝卜素和叶绿素)两者。

[0007] 在过去的几十年中，已经对世界范围内数千物种的藻类的脂质产量进行了筛选和研究。其中，已经鉴定了富含脂质产量的约300个物种。脂质组成和含量在生命周期的不同阶段变化且受环境和培养条件的影响。由于藻类细胞壁的生化组成和物理性质的显著差异性，用于提取的策略和方法根据所用的单独藻类物种/株系是相当不同的。考虑到藻类细胞壁的厚度和藻类细胞的较小尺寸(约2至约20nm)，传统的物理提取工艺(诸如挤压)对藻类的效果不是很好。此外，与从种子中回收的典型油相比，藻类油中的大量极性脂质带来精制问题。

[0008] 收获后，培养物中典型藻类浓度的范围为约0.1-1.0%(w/v)。这意味着在尝试提取油之前必须去除每单位重量藻类多达1000倍的水量。目前，现有的含油材料油提取方法严格地要求几乎完全干燥的供料以改善所提取的油的产率和品质。由于加热藻类团块以使其充分干燥所需的能量的量，所以将藻类供料至生物燃料的工艺变得不经济。通常，在高温下挤压或压碎供料以强化提取。由于藻类的单细胞微量性质，这些步骤对于现有设备可能不起作用。此外，藻类油由于存在双键长链脂肪酸是非常不稳定的。在传统提取方法中使用的高温引起油的降解，从而增加这些方法的成本。

[0009] 本领域已知通过使用己烷作为溶剂从干燥的藻类团块中提取油。该工艺为能量密集型的。使用热来干燥以及使用己烷来提取生产较低品质的产物，因为这种类型的加工引起脂质和蛋白质降解。

[0010] 藻类油提取可分为两类：破坏性方法或非破坏性方法。

[0011] 破坏性方法包括通过机械、热、酶促或化学方法裂解细胞。大多数破坏性方法产生乳液，这需要昂贵的清洗工艺。藻类油含有很大百分比的极性脂质和蛋白质，这增强提高中性脂质的乳化。乳化被溶液中留存的营养素和盐组分进一步化。该乳液为含有中性脂质、极性脂质、蛋白质和其它藻类产物的复杂混合物，其需要深入精制工艺来分离中性脂质，所述中性脂质为转化为生物燃料的供料。

[0012] 非破坏性方法提供低产率。乳化(Milking)是使用溶剂或化学品来从生长的藻类培养物中提取脂质。虽然有时用于提取藻类产物，但是由于溶剂毒性和细胞壁破坏，乳化对于一些物种的藻类可能不起作用。这种复杂性使得难以开发通用的工艺。此外，由于培养基中溶剂的最大可获得浓度，所需溶剂的体积将是庞大的。

[0013] 因此，为了克服这些缺陷，本领域存在对用于提取和分级分离藻类产物，尤其是藻类油、藻蛋白和藻类类胡萝卜素的改进方法和系统的需求。该工艺可通过将高度非极性溶剂引入至提取系统来进一步改进，从而避免蒸发和循环所有用于提取的溶剂的成本。

[0014] 发明概述

[0015] 本文所述的实施方案一般涉及从含油材料中(包括例如，藻类生物质)提取不同极性脂质的系统和方法。特别地，本文所述的实施方案涉及使用不同极性的溶剂和/或一系列的膜式滤器从藻类生物质中提取不同极性脂质。在一些实施方案中，所述滤器为微滤器。

[0016] 在本发明的一些实施方案中，使用单种溶剂和水来提取和分级分离含油材料中存在的组分。在其它实施方案中，这些组分包括但不限于蛋白质、极性脂质和中性脂质。在其它实施方案中，使用多于一种溶剂。在其它实施方案中，使用溶剂的混合物。所公开的方法允许湿藻类生物质的组分的分离和分级分离。本文所述系统和方法的又一个方面为实现初步精制的能力，因为系统中的疏水性溶剂选择性地将产物进一步分离成脂质和非脂质组分。所使用的两亲性溶剂的量将取决于系统中的水量。将疏水性溶剂的量最小化以便减少去除溶剂的后续加工。

[0017] 在一些实施方案中，本文所述的方法和系统可用于从含油材料中提取脂质副产物。此类副产物的实例包括但不限于蛋白质材料、叶绿素和类胡萝卜素。本发明的实施方案允许以允许生成燃料和营养产物的方式从藻类生物质中同时提取和分级分离藻类产物。

[0018] 在本发明的一个实施方案中，提供一种从含油材料中分级分离油和蛋白质材料的提取方法。

[0019] 在又一实施方案中，从大致上包含完整的藻类细胞的藻类生物质中选择性地去除产物的方法包括将藻类生物质与第一溶剂组合并以产生第一提取混合物，所述第一提取混合物包括第一大致上固相和第一液相；将所述第一提取混合物的第一液相的至少一部分与第一大致上固相分离；将所述第一提取大致上固相与第二溶剂组合并以产生第二提取混合物，所述第二提取混合物包括第二大致上固相和第二液相，其中所述第二提取混合物的极性小于第一提取混合物；将所述第二提取混合物的第二液相的至少一部分与第二大致上固相分离；将所述第二提取大致上固相与第三溶剂组合并以产生第三提取混合物，所述第三提取混合物包括第三大致上固相和第三液相，其中所述第三提取混合物的极性小于所述第二提取混合物；且将所述第三提取混合物的第三液相的至少一部分与所述第三大致上固相分离。

[0020] 在本发明的一些方面，所述方法进一步包括将第一溶剂组的至少一部分从第一液相的分离部分去除以获得第一提取产物。在其它方面，所述方法进一步包括将第二溶剂组的至少一部分从第二液相的分离部分去除以获得第二提取产物。在其它方面，所述方法进一步包括将第三溶剂组的至少一部分从第三液相的分离部分去除以获得第三提取产物。

[0021] 在其它方面，溶剂组包含水可混溶的溶剂或水不可混溶的溶剂。在某些方面，溶剂组包含两种水可混溶的溶剂或两种水不可混溶的溶剂。在其它方面，溶剂组包含一种或多种水可混溶的溶剂以及一种或多种水不可混溶的溶剂。在其它方面，将第一、第二和/或第三提取混合物加热至低于其沸点的温度。在另一个方面，提取混合物在大于大气压的压力下。在一些方面，第一、第二和第三组溶剂组中的至少一者包含一种或多种两亲性溶剂。在又另一个方面，一种或多种水可混溶的溶剂中的至少一种选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈。在其它方面，第一、第二和第三组溶剂组中的至少一者包含乙醇。在其它方面，将溶剂组以1:1重量/重量比加入至生物质中。

[0022] 在其它方面，包含藻类生物质的细胞未经干燥或未遭破坏。在又一方面，将藻类生物质解冻。在本发明的又一方面，所述方法进一步包括调节第一、第二和第三提取混合物中的至少一者的pH以优化蛋白质提取。在本发明的其它方面中，当从藻类生物质中选择性地提取产物时，同时将藻类生物质至少部分地脱水。在本发明的其它方面，第一、第二和第三提取大致上固相包括大致上完整的藻类细胞。

[0023] 本发明的实施方案包括从完整的藻类细胞分离极性脂质的方法，其包括提供包含完整的藻类细胞的湿藻类生物质，所述完整的藻类细胞包含极性脂质；通过去除胞外水分将湿藻类生物质脱水以使湿藻类生物质的固体含量加入至约5%w/w至约50%w/w，从而产生部分脱水的湿藻类生物质；将部分脱水的湿藻类生物质与两亲性溶剂组和疏水性溶剂组混合以产生包含较重相和较轻相的提取混合物，其中所述较重相包含两亲性溶剂组和部分脱水的湿藻类生物质，且较轻相包含疏水性溶剂组和极性脂质；将提取混合物的较重相与提取混合物的较轻相分离；以及将极性脂质从较轻相中分离以产生极性脂质级分。

[0024] 本发明的一些实施方案包括从完整的藻类细胞分离蛋白质的方法，其包括提供包含完整的藻类细胞的湿藻类生物质，所述完整的藻类细胞包含水、藻类蛋白质和极性脂质；通过去除胞外水分将湿藻类生物质脱水以使湿藻类生物质的固体含量加入至5%至50%，从而产生部分脱水的藻类生物质；将部分脱水的湿藻类生物质与两亲性溶剂组和疏水性溶剂组混合以产生包含较重相和较轻相的提取混合物，其中所述较重相包含水、两亲性溶剂组、部分脱水的湿藻类生物质和藻类蛋白质，且较轻相包含疏水性溶剂组和极性脂质；将提取混合物的较重相与提取混合物的较轻相分离；将部分脱水的湿藻类生物质从提取混合物的较重相中分离以产生包含蛋白质、水和两亲性溶剂组的蛋白质混合物；以及将蛋白质从蛋白质混合物中分离以产生蛋白质级分。

[0025] 其它的实施方案包括从完整的藻类细胞分离蛋白质的方法，其包括提供包含完整的藻类细胞的湿藻类生物质，所述完整的藻类细胞包含水、藻类蛋白质和极性脂质；将湿藻类生物质与两亲性溶剂组和疏水性溶剂组混合以产生包含较重相和较轻相的提取混合物，其中所述较重相包含水、两亲性溶剂组、湿藻类生物质和藻类蛋白质，且较轻相包含疏水性溶剂组和极性脂质；将提取混合物的较重相与提取混合物的较轻相分离；将湿藻类生物质从提取混合物的较重相中分离以产生包含蛋白质、水和两亲性溶剂组的蛋白质混合物；以及将蛋白质从蛋白质混合物中分离以产生蛋白质级分。

[0026] 本发明的进一步实施方案包括从完整的藻类细胞分离中性脂质的方法，其包括提供包含完整的藻类细胞的湿藻类生物质，所述完整的藻类细胞包含蛋白质、极性脂质和中性脂质；将湿藻类生物质与第一两亲性溶剂组和第一疏水性溶剂组混合以产生包含第一较重相和第一较轻相的第一提取混合物，其中所述第一较重相包含第一两亲性溶剂组、中性脂质、蛋白质和湿藻类生物质，且第一较轻相包含第一疏水性溶剂组和极性脂质；将提取混合物的第一较轻相与提取混合物的第一较重相分离；将湿藻类生物质从提取混合物的第一较重相中分离以产生包含中性脂质的分离的湿藻类生物质，和包含蛋白质、水和第一两亲性溶剂组的蛋白质混合物；将分离的藻类生物质与第二两亲性溶剂组和第二疏水性溶剂组混合以产生包含第二较重相和第二较轻相的第二提取混合物，其中所述第二较重相包含第二亲水性溶剂组和分离的湿藻类生物质，且第二较轻相包含第二疏水性溶剂组和中性脂质；将第二较重相与第二较轻相分离；以及将中性脂质从第二较轻相中分离以产生中性脂质级分。

[0027] 一些实施方案进一步包括通过离心、过滤、沉降或漂浮分级分离来进行脱水。其它实施方案包括添加一定量的两亲性溶剂组以在加入疏水性溶剂组之前将提取混合物的极性指数调节至约6.5至6.7。其它实施方案包括添加一定量的疏水性溶剂组以在加入两亲性溶剂组之后将提取混合物的极性指数调节至约5.7至5.9。在其它实施方案中，两亲性溶剂组为丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、丁酮、二甲醚和丙醛、2-丙醇、乙腈、叔丁醇、1-丙醇、水、重水(D2O)、乙二醇、甘油或其组合。在其它实施方案中，疏水性溶剂组为丙烷、丁烷、戊烷、丁烯、丙烯、石脑油、烷烃、己烷、戊烷、庚烷、辛烷、酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、芳烃、甲苯、苯、环己烷、四氢呋喃、卤代烷烃、氯仿、三氯乙烯、醚、二乙醚、柴油、喷气燃料、汽油及其组合物。

[0028] 在一些实施方案中，将较重相与较轻相分离包括滗析、膜过滤或离心。在其它实施方案中，将极性脂质与较轻相分离包括蒸发或蒸馏。在其它实施方案中，回收疏水性溶剂。在其它实施方案中，浓缩且回收疏水性溶剂。在其它实施方案中，回收两亲性溶剂。在其它实施方案中，浓缩且回收疏水性溶剂。

[0029] 在其它实施方案中，加热提取混合物。在其它实施方案中，用微波、水、蒸汽、热油或电力加热提取混合物。在一些实施方案中，在大气压力下加热提取混合物。在其它实施方案中，在加压反应器中加热提取混合物。在其它实施方案中，加压反应器为分批反应器或连续反应器。

[0030] 其它的实施方案包括从完整的藻类细胞分离中性脂质的方法，其包括提供包含完整的藻类细胞的湿藻类生物质，所述完整的藻类细胞包含蛋白质、极性脂质和中性脂质；通过去除胞外水分将湿藻类生物质脱水以使湿藻类生物质的固体含量加入至5%至50%，从而产生部分脱水的湿藻类生物质；将部分脱水的湿藻类生物质与第一两亲性溶剂组和第一疏水性溶剂组混合以产生包含第一较重相和第一较轻相的第一提取混合物，其中所述第一较重相包含第一两亲性溶剂组、中性脂质、蛋白质和部分脱水的湿藻类生物质，且第一较轻相包含第一疏水性溶剂组和极性脂质；将提取混合物的第一较轻相与提取混合物的第一较重相分离；将提取混合物的第一较重相中的部分脱水的湿藻类生物质与第一两亲性溶剂组分离以产生包含中性脂质的分离的部分脱水的湿藻类生物质，和包含蛋白质、水和第一两亲性溶剂组的蛋白质混合物；将分离的部分脱水的湿藻类生物质与第二两亲性溶剂组和第二疏水性溶剂组混合以产生包含第二较重相和第二较轻相的第二提取混合物，其中所述第二较重相包含第二亲水性溶剂组和分离的部分脱水的湿藻类生物质，且第二较轻相包含第二疏水性溶剂组和中性脂质；将第二较重相与第二较轻相分离；以及将中性脂质从第二较轻相中分离。

[0031] 在一些实施方案中，在中性脂质从第二较轻相中分离之前加热第二较轻相。在一些实施方案中，通过蒸发或蒸馏从第二较轻相中去除第二疏水性溶剂组，从而产生中性脂质级分。在其它实施方案中，蒸发第一和第二两亲性溶剂组中的至少一者。在其它实施方案中，回收第一和第二疏水性溶剂组中的至少一者。在其它实施方案中，冷却且回收第一和第二疏水性溶剂组中的至少一者。在其它实施方案中，冷却且回收第一和第二两亲性溶剂组中的至少一者。在其它实施方案中，回收第一和第二两亲性溶剂组中的至少一者。在其它实施方案中，加热第一和第二提取混合物中的至少一者。在其它实施方案中，第一和第二提取混合物中的至少一者用微波、水、蒸汽、或热油或电力进行加热。在一些实施方案中，第一和第二提取混合物中的至少一者在大气压力下进行加热。在其它实施方案中，第一和第二提取混合物中的至少一者在加压反应器中进行加热。在一些实施方案中，加压反应器为分批反应器或连续反应器。

[0032] 附图简述

[0033] 图1A为根据本发明的示例性实施方案的方法中包括的步骤的流程图。

[0034] 图1B为根据本公开的脱水工艺的示例性实施方案的示意图。

[0035] 图2为根据本公开的提取系统的示例性实施方案的示意图。

[0036] 图3为显示使用包括完全极性范围的一系列溶剂对冻干的藻类生物质的索氏(Sohxlet)提取的比较图，显示最大非破坏性藻类油提取效率和极性对极性脂质和非极性脂质提取的影响。

[0037] 图4A&B为显示在三种不同温度使用甲醇和石油醚的两步溶剂提取工艺中的中性脂质(A)纯度和(B)回收率的图示。

[0038] 图5A&B为显示在三种不同温度使用甲醇水溶液和石油醚的两步溶剂提取工艺中的中性脂质(A)纯度和(B)回收率的图示。

[0039] 图6为显示在三种不同温度使用甲醇水溶液和石油醚的两步溶剂提取工艺中的脂质回收率的图。

[0040] 图7为示出溶剂与固体生物质比率对脂质回收率的影响的图。

[0041] 图8为示出甲醇水溶液的单步提取回收中不同提取水溶液对干生物质的效力的图。

[0042] 图9为示出多步甲醇提取对累积总脂质产率和中性脂质纯度的影响的图。

[0043] 图10为示出使用湿生物质和乙醇的脂质累积回收率的图。

[0044] 图11为示出比较微波辅助的提取和常规提取系统的提取时间的图。

[0045] 图12A为根据本公开的示例性实施方案的方法中包括的步骤的流程图，其并入了蛋白质提取步骤。图12A中的所有单位均为磅。

[0046] 图12B为根据本公开的示例性提取工艺中包括的步骤的流程图。

[0047] 图13为描述本发明的实施方案之一的流程图和质量平衡图，其中通过提取和分级分离加工1000磅藻类生物质以便从藻类生物质分离中性脂质、极性脂质和蛋白质。

[0048] 图14为描述本发明的实施方案之一的流程图，其中可以加工藻类团块以形成各种产物。

[0049] 图15为描述本发明的实施方案之一的流程图，其中加工藻类中性脂质以形成各种产物。

[0050] 图16为描述本发明的实施方案之一的流程图，其中加工藻类中性脂质以形成燃料产品。

[0051] 图17为描述本发明的实施方案之一的流程图，其中从淡水藻类生物质选择性地提取藻类蛋白质。

[0052] 图18为描述本发明的实施方案之一的流程图，其中从盐水藻类生物质选择性地提取藻类蛋白质。

[0053] 图19为描述本发明的实施方案之一的流程图，其中从盐水或淡水藻类生物质提取所选的藻类蛋白质。

[0054] 图20为描述本发明的实施方案之一的流程图，其中从盐水或淡水藻类生物质提取所选的藻类蛋白质。

[0055] 图21为示出使用本文所述的方法在提取之前和之后的栅藻属某种(Scenedescemus sp)细胞的照片。该细胞在提取之前和之后都是大致上完整的。

[0056] 图22为用单溶剂(两亲性)系统提取蛋白质的示例性提取方案的示意图。

[0057] 图23为用双溶剂(两亲性/疏水性)系统提取极性脂质和蛋白质的示例性提取方案的示意图。

[0058] 图24为用双溶剂(两亲性/疏水性)系统提取中性脂质和蛋白质的示例性提取方案的示意图。

[0059] 图25为用双溶剂(两亲性/疏水性)系统提取中性脂质、极性脂质和蛋白质的示例性提取方案的示意图。

[0060] 图26为显示乙醇提取概念的示意图。

[0061] 发明详述

[0062] 定义

[0063] 本文使用的术语“管道”或其任何变化形式包括可经由其输送流体的任何结构。管道的非限制性实例包括管子、配管、管槽或其它封闭结构。

[0064] 本文使用的术语“储器”或其任何变化形式包括能够保留流体的任何实体结构。储器的非限制性实例包括池塘、罐、湖、桶或其它类似的结构。

[0065] 本文使用的术语“约”或“大约”被定义为接近本领域普通技术人员所理解的，且在一个非限制性实施方案中该术语被定义为在10%内，优选地在5%内，更优选地在1%内，且最优选地在0.5%内。

[0066] 本文使用的术语“抑制”或“减少”或这些术语的任何变化形式包括为实现所需结果的任何可测量的降低或完全抑制。

[0067] 本文使用的术语“有效的”意指足以实现所需的、期望的或预期的效果。

[0068] 所用的词“一(a)”或“一个(an)”在本文当与联合术语“包含”使用时，可以意指“一个(one)”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。

[0069] 本文使用的术语“或”意指“和/或”，除非明确地指出仅是指备选项或备选项为相互排斥的，尽管本公开支持仅是指备选项和“和/或”的定义。

[0070] 所用的术语“湿”如本文所用，用于意指含有约50%至约99.9%含水量。含水量可位于胞内或胞外。

[0071] 所用的术语“溶剂组”如本文所用，用于意指包含一种或多种溶剂的组合物。这些溶剂可为两亲性的(也称为两亲性或略微非极性的)、亲水性的或疏水性的(也称作亲脂性的)。在一些实施方案中，这些溶剂为水可混溶的，而在另一些中，它们为水中不可混溶的。可用于实施本发明方法的溶剂的非限制性实例包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、和乙腈、烷烃(己烷、戊烷、庚烷、辛烷)、酯(乙酸乙酯、乙酸丁酯)、酮(甲基乙基酮(MEK)、甲基异丁基酮(MIBK))、芳烃(甲苯、苯、环己烷、四氢呋喃)、卤代烷烃(氯仿、三氯乙烯)、醚类(二乙醚)以及混合物(柴油、喷气燃料、汽油)。

[0072] 两亲性溶剂的非限制性实例包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈及其组合。食品级乙醇也预期可用于所公开的方法中。

[0073] 疏水性溶剂的非限制性实例包括烷烃(己烷、戊烷、庚烷、辛烷)、酯(乙酸乙酯、乙酸丁酯)、酮(甲基乙基酮(MEK)、甲基异丁基酮(MIBK))、芳烃(甲苯、苯、环己烷、四氢呋喃)、卤代烷烃(氯仿、三氯乙烯)、醚类(二乙醚)、混合物(柴油、喷气燃料、汽油)及其组合。

[0074] 溶剂回收方法的非限制性实例包括蒸发、渗透蒸发、溶剂组分的选择吸附、汽提及其组合。全蒸发为通过在渗透物侧产生真空经由聚合物膜选择性地去除溶剂组分的蒸汽的工艺。将选择性吸附用于乙醇产业，以使用沸石从乙醇水溶液中去除少量水。汽提可用于非温度敏感性操作。

[0075] 本文使用的术语“界面层”意指包含和邻接相界的区域，在该区域内溶剂组的极性指数显著不同于另一种邻接的溶剂组的极性指数。

[0076] 本文使用的术语“极性指数”是指由Snyder,L.R.“Classification of the Solvent Properties of Common Liquids”Journal of Chromatography,92(2):223-230(1974年5月)所述的无量纲指数斯奈德极性指数(Snyner Polarity Index)。

[0077] 本文使用的术语“油”包括含有中性脂质和极性脂质的组合物。本文使用的术语“藻类油(algae oil)”和“藻类油(algal oil)”可互换使用。

[0078] 本文使用的术语“扩散物”或“渗透物”可以指已通过分离装置(包括但不限于滤器或膜)的材料。

[0079] 本文使用的术语“滞留物”可以指在扩散物已通过分离设备之后剩余的材料。

[0080] 本文使用的词“包含(comprising)”(以及包含的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包括的任何形式，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)，或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，诸如“包含(contains)”和“含有(contain)”)为包括性的或开放式的且不排除附加的、未提及的要素或方法步骤。

[0081] 本文使用的术语“极性脂质”或其任何变化形式包括但不限于磷脂和糖脂。

[0082] 本文使用的术语“中性脂质”或其任何变化形式包括但不限于甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、类胡萝卜素、蜡、甾醇。

[0083] 本文使用的术语“固相”是指通常较为固态的材料的集合，而并非旨在意指该相中的所有材料均为固体。因此，具有大量固体同时保留一些液体的相涵盖在该术语的含义内。同时，本文使用的术语“液相”是指通常较为液态的材料的集合，且此类集合可包括固体材料。

[0084] 本文使用的术语“生物柴油”是指来源于藻类的脂肪酸的甲酯或乙酯。

[0085] 本文使用的术语“营养品”是指提供健康和/或医学益处的食品。非限制性实例包括类胡萝卜素，胡萝卜素，叶黄素诸如玉米黄质、虾青素和叶黄素。

[0086] 本文使用的术语“生物燃料”是指来源于生物来源的燃料。非限制性实例包括生物柴油、喷气燃料、柴油、调合用喷气燃料(jet fuel blend stock)和调合用柴油(diesel blend stock)。

[0087] 本文使用的术语“杂质”，当与极性脂质结合使用时，是指与目标产物共提取或与目标产物具有相同性质的除目标产物之外的所有组分。

[0088] 本文使用的术语“润滑剂”，当与极性脂质结合使用时，是指加氢处理的藻类脂质诸如C16-C20烷烃。

[0089] 本文使用的术语“去垢剂”，当与极性脂质结合使用时，是指糖脂、磷脂及其衍生物。

[0090] 本文使用的术语“食品添加剂”，当与极性脂质结合使用时，是指大豆卵磷脂代替品或来源于藻类的磷脂。

[0091] 本文使用的术语“非甘油物质”是指与甘油级分分离的任何杂质。进一步清除步骤将去除存在的大多数以生产药用级甘油。

[0092] 本文使用的术语“不饱和脂肪酸”是指具有至少一个碳双键的脂肪酸。不饱和脂肪酸的非限制性实例包括棕榈油酸、十七碳酸、硬脂酸、油酸、十八碳烯酸、亚油酸、γ-亚油酸、α-亚油酸、花生酸、二十碳烯酸、高γ亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(eicosapenenoic acid)、二十二碳酸、二十二碳二烯酸、二十一碳五烯酸、二十二碳四烯酸。主链中具有20个或更多个碳原子的脂肪酸通常被称为“长链脂肪酸”。主链中具有19个或更少个碳原子的脂肪酸通常被称为“短链脂肪酸”。

[0093] 不饱和长链脂肪酸包括但不限于ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸和ω-9脂肪酸。本文使用的术语“ω-3脂肪酸”是指，但不限于表1中列出的脂肪酸。

[0094] 表1

[0095]

[0096]

[0097] 本文使用的术语“调合用喷气燃料”是指具有适合用作喷气燃料的碳链长度的烷烃。

[0098] 本文使用的术语“调合用柴油”是指具有适合用作柴油的碳链长度的烷烃。

[0099] 本文使用的术语“动物饲料”是指来源于藻类的物质，可以被动物食用并为动物提供营养支持。

[0100] 本文使用的术语“人类食物”是指来源于藻类的物质，可以被人类食用并为动物提供营养支持。来源于藻类的人类食品可含有必需营养素，诸如碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素或矿物质。

[0101] 本文使用的术语“生物除污”是指使用藻类生长以从工业废水或市政废水去除污染物，诸如但不限于硝酸盐、磷酸盐和重金属。

[0102] 本文使用的术语“废水”是指含有多种污垢物或污染物(包括但不限于硝酸盐、磷酸盐和重金属)的工业废水或城市废水。

[0103] 本文使用的术语“富含的”意指约50%或更高含量。

[0104] 本文使用的术语“大致上”应指主要地。

[0105] 本文使用的术语“球蛋白”是指盐溶性蛋白质。

[0106] 本文使用的术语“白蛋白”是指水溶性蛋白质。

[0107] 本文使用的术语“谷蛋白”是指碱溶性蛋白质。

[0108] 本文使用的术语“醇溶谷蛋白”是指醇溶性蛋白质。醇溶谷蛋白的非限制性实例为麦醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白、燕麦蛋白。

[0109] 本文使用的术语“藻类培养物”是指培养基中的藻类细胞。

[0110] 本文使用的术语“藻类生物质”是指至少部分脱水的藻类培养物。

[0111] 本文使用的术语“脱水的”是指去除至少一些水。

[0112] 本文使用的术语“藻类糊”是指具有允许其流动的流体性质的部分脱水的藻类培养物。通常，藻类糊的含水量为约90%。

[0113] 本文使用的术语“藻类块”是指缺少藻类糊的流体性质且趋于结块的部分脱水的藻类培养物。通常，藻类饼的含水量为约60%或更低。

[0114] 盐水藻类细胞包括但不限于海洋和盐水藻类物种。盐水藻类细胞存在于自然界的水体中，诸如，但不限于海、洋和河口。盐水藻类种类的非限制性的实例包括微拟球藻属某种、杜氏藻属某种。

[0115] 淡水藻类细胞存在于自然界的水体中，诸如，但不限于湖和池塘。淡水藻类物种的非限制性的实例包括栅藻属某种、鞭毛藻属某种。

[0116] 可用于本发明方法的微藻的非限制性实例为以下门之一的成员：绿藻门、蓝藻门(蓝藻细菌)和不等鞭毛门。在某些实施方案中，可用于本发明方法的微藻为以下纲之一的成员：硅藻纲、大眼藻纲和金藻纲。在某些实施方案中，可用于本发明方法的微藻为以下属之一的成员：微拟球藻属、小球藻属、杜氏藻属、栅藻属、月牙藻属、颤藻属、席藻属、螺旋藻属、双眉藻属和棕鞭藻属。

[0117] 可用于本发明方法的微藻物种的非限制性实例包括：东方曲壳藻(Achnanthes orientalis)、阿格门氏藻属某些种(Agmenellum spp.)、透明茧形藻属(Amphiprora hyaline)、咖啡形双眉藻(Amphora coffeiformis)、咖啡形双眉藻线形变种(Amphora coffeiformis var.linea)、Amphora、咖啡形双眉藻斑点变种(coffeiformis var.punctata)、、咖啡形双眉藻泰勒氏变种(Amphora coffeiformis var.taylori)、咖啡形双眉藻细薄变种(Amphora coffeiformis var.tenuis)、优美双眉藻(Amphora delicatissima)、优美双眉藻头状变种(Amphora delicatissima var.capitata)、双眉藻某种(Amphora sp.),鱼腥藻属(Anabaena)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、镰形纤 维 藻 (Ankistrodesmus falcatus)、Boekelovia hooglandii、Borodinella sp.、布 朗尼 葡萄 藻(Botryococcus braunii)、Botryococcus sudeticus、小型 片球 藻(Bracteococcus minor)、Bracteococcus medionucleatus、四 鞭藻(Carteria)、纤 细角毛藻(Chaetoceros gracilis)、牟勒氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、牟勒氏角毛藻亚盐变种(Chaetoceros muelleri var.subsalsum)、角毛藻某种(Chaetoceros sp.)、Chlamydomas perigranulata、无硝小球藻(Chlorella anitrata)、南极洲小球藻(Chlorella antarctica)、黄绿小球藻(Chlorella aureoviridis)、念珠菌小球藻(Chlorella Candida)、囊状小球藻(Chlorella capsulate)、干燥小球藻(Chlorella desiccate)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)、淡褐小球藻(Chlorella fusca)、淡褐小球藻空泡变种(Chlorella fusca var.vacuolata)、Chlorella glucotropha、水溪小球藻(Chlorella infusionum)、Chlorella infusionum var.actophila、Chlorella infusionum var.auxenophila、凯 氏 小 球 藻(Chlorella kessleri)、Chlorella lobophora、Chlorella luteoviridis、Chlorella luteoviridis var.aureoviridis、Chlorella luteoviridis var.lutescens、Chlorella miniata、极微小球藻(Chlorella minutissima)、突变小球藻(Chlorella mutabilis)、夜间小球藻(Chlorella nocturna)、卵圆形小球藻(Chlorella ovalis)、小形小球藻(Chlorella parva)、嗜光小球藻(Chlorella photophila)、Chlorella pringsheimii、原始 小球 藻(Chlorella protothecoides)、、原 始小 球藻 酸居 变种 (Chlorella protothecoides var.acidicola)、规则小球藻(Chlorella regularis)、规则小球藻小型 变 种 (Chlorella regularis var.minima)、Chlorella regularis var.umbricata、Chlorella reisiglii、嗜糖小球藻(Chlorella saccharophila)、海洋小球藻椭圆变种(Chlorella saccharophila var.ellipsoidea)、海水小球藻(Chlorella salina)、单纯小球藻(Chlorella simplex)、耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)、小球藻某种(Chlorella sp.)、球孢小球藻(Chlorella sphaerica)、Chlorella stigmatophora、万尼氏小球藻(Chlorella vanniellii)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、Chlorella vulgaris fo.Tertia、普通小球藻自养变种(Chlorella vulgaris var.autotrophica)、普通小球藻绿色变种(Chlorella vulgaris var.viridis)、普通小球藻普通变种
(Chlorella vulgaris var.vulgaris)、Chlorella vulgaris var.vulgaris fo.Tertia、Chlorella vulgaris var.vulgaris fo.Viridis、Chlorella xanthella、Chlorella zofingiensis、Chlorella trebouxioides、普 通 小 球 藻(Chlorella vulgaris)、水溪绿球藻(Chlorococcum infusionum)、绿球藻某种(Chlorococcum sp.)、绿梭藻属(Chlorogonium)、蓝隐藻属某种(Chroomonas sp.)、金球藻属某种(Chrysosphaera sp.)、球钙板藻属某种(Cricosphaera sp.)、隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、隐藻属某种(Cryptomonas sp.)、隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)、梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana),小环藻属某种(Cyclotella sp.)、杜氏藻某种(Dunaliella sp.)、拜尔代维勒杜氏藻(Dunaliella bardawil)、Dunaliella bioculata、颗粒状杜氏藻(Dunaliella granulate)、海生杜氏藻(Dunaliella maritime)、微小杜氏藻(Dunaliella minuta)、巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)、Dunaliella peircei、Dunaliella primolecta、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、陆生杜氏藻(Dunaliella terricola)、Dunaliella tertiolecta、绿色杜氏藻(Dunaliella viridis)、Dunaliella tertiolecta、绿色独球藻(Eremosphaera viridis)、独球藻属某种(Eremosphaera sp.)、后棘藻属某种(Ellipsoidon sp.)、裸藻属某些种(Euglena spp.)、披刺藻某种(Franceia sp.)、克罗脆杆藻(Fragilaria crotonensis)、脆杆藻属(Fragilaria sp.)、蓝鼓藻属某种(Gleocapsa sp.)、丽丝藻属某种(Gloeothamnion sp.)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、膜胞藻属某种(Hymenomonas sp.)、lsochrysis aff.galbana、球等鞭金藻(lsochrysis galbana)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、微星藻属(Micractinium)、微星藻藻(Micractinium)、微小单针藻(Monoraphidium minutum)、单针藻属某种(Monoraphidium sp.)、侏囊菌属某种(Nannochloris sp.)、盐生微拟球藻(Nannochloropsis salina)、微拟球藻某种(Nannochloropsis sp.)、截形舟形藻(Navicula acceptata)、Navicula biskanterae、Navicula pseudotenelloides、具膜舟形藻(Navicula pelliculosa)、腐生舟形藻(Navicula saprophila)、舟形藻某种(Navicula sp.)、肾鞭藻某种(Nephrochloris sp.)、肾藻属某种(Nephroselmis sp.)、普通菱形藻(Nitschia communis)、亚历山大菱形藻(Nitzschia alexandrina)、新月菱形藻(Nitzschia closterium)、普通菱形藻(Nitzschia communis)、细端菱形藻(Nitzschia dissipata)、碎片菱形藻(Nitzschia frustulum)、汉氏菱形藻(Nitzschia hantzschiana)、平庸菱形藻(Nitzschia inconspicua)、中型菱形藻(Nitzschia intermedia)、小头菱形藻(Nitzschia microcephala)、微小菱形藻(Nitzschia pusilla)、Nitzschia pusilla elliptica、Nitzschia pusilla monoensis、四角形菱形藻(Nitzschia quadrangular)、菱形藻属某种(Nitzschia sp.)、棕鞭藻属某种(Ochromonas sp)、微细卵囊藻(Oocystisparva)、卵泡藻(Oocystis pusilla)、卵囊藻属某种(Oocystis sp.)、沼泽颤藻(Oscillatoria limnetica)、颤藻属某种(Oscillatoria sp.)、拟短形颤藻(Oscillatoria subbrevis)、Parachlorella kessleri、Pascheria acidophila、巴夫藻属某种(Pavlova sp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricomutum)、噬菌体属(Phagus)、席藻属(Phormidium)、扁藻属某种(Platymonas sp.)、颗石藻(Pleurochrysis carterae)、Pleurochrysis dentate、颗石藻属某种(Pleurochrysis sp.)、威克海姆原壁藻(Prototheca wickerhamii)、Prototheca stagnora、波多黎各原壁藻(Prototheca portoricensis)、Prototheca moriformis、饶氏原藻(Prototheca zopfii)、水生假小球藻(Pseudochlorella aquatica)、塔胞藻属某种(Pyramimonas sp.)、桑椹藻属(Pyrobotrys)、不透明红球菌(Rhodococcus opacus)、Sarcinoid chrysophyte、被甲栅藻(Scenedesmus armatus)、裂殖壶菌(Schizochytrium)、水绵属(Spirogyra)、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、裂丝藻属某种(Stichococcus sp.)、聚球藻属某种(Synechococcus sp.)、集胞藻属(Synechocystisf)、万寿菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetes patula)、四角藻属(Tetraedron)、、四爿藻某种(Tetraselmis sp.)、瑞典四爿藻(Tetraselmis suecica)、威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)和Viridiella fridericiana。

[0118] 在其它实施方案中，生物质可为植物材料，包括但不限于大豆、玉米、棕榈、亚麻荠(camelina)、麻疯树、芥花、椰子、花生、红花、棉籽、亚麻籽、向日葵、米糠和橄榄。

[0119] 公开了从湿的含油材料(包括例如，藻类生物质)中提取不同极性的脂质和副产物(如蛋白质)的系统和方法。特别地，本文所述的方法和系统涉及提取和分级分离藻类组分的能力，通过以逐渐变得极性较低的两亲性/疏水性溶剂和水混合物进行连续提取(即，随着从一个提取步骤进行到下一个，溶剂/水比率中的水逐渐减少)。换句话说，最初存在于藻类的间隙水(大约75%其重量)逐渐被两亲性/疏水性溶剂替换成两亲性/疏水性溶剂的恒沸物。这导致提取在每个步骤发展的极性可溶的组分，从而导致提取组分的同时分级分离。

[0120] 该工艺导致含有两相的混合物，一个较轻相和一个较重相。较轻相包含疏水性溶剂和极性脂质。非极性脂质也存在于该相中。较重相包含两亲性溶剂、水和剩余的藻类生物质。疏水性溶剂的存在允许从总提取物中存在的其它藻类组分中选择性提取脂质组分。这导致几乎不含蛋白质或水溶性藻类产物含量的更纯的脂质产物。

[0121] 在本发明的一些实施方案中，使用单种溶剂和水来提取和分级分离含油材料中存在的组分。在其它实施方案中，使用溶剂组和水提取和分级分离含油材料中存在的组分。在一些实施方案中，含油材料为湿的。在其它实施方案中，含油材料为藻类。

[0122] 极性脂质回收率主要取决于其离子电荷、水溶性和位置(胞内、胞外或膜结合的)。极性脂质的实例包括但不限于磷脂和糖脂。可用于分离和纯化极性脂质的策略可大致分为分批模式或连续模式。分批模式的实例包括沉淀(pH、有机溶剂)、溶剂提取和结晶。连续模式的实例包括离心、吸附、泡沫分离和沉淀以及膜技术(切向流过滤、渗滤和沉淀、超滤)。

[0123] 本发明的其它目的、特征和优点将从以下详述中变得明显。然而，应当理解，虽然详述和实施例指出了本发明的具体实施方案，但是仅以举例说明的方式给出。另外，根据详述，设想在本发明精神和范围内的变化和修改将对本领域技术人员变得明显。

[0124] 令人惊奇的是，所提出的非破坏性提取工艺导致大于90%的回收率。当剩余的生物质用于供料时，剩余生物质中的少量极性脂质增强了其价值。这至少部分地是因为生物质的高的长链不饱和脂肪酸含量。另外，乙醇提取物可进一步直接进行酯交换。此外，不同于现有常规方法，本文所述的方法和系统对于任何藻类是通用的，并通过使用水可混溶的有机溶剂梯度使得能够回收藻类中大部分有价值的组分，包括极性脂质。

[0125] 通过使用本发明获得的中性脂质级分具有低金属含量，从而增强脂质级分的稳定性且减少随后的加工步骤。金属由于其催化氧化的能力，容易使得中性脂质不稳定。此外，金属抑制加氢处理催化剂，使得在可以精制中性脂质混合物之前去除它们成为必要。本文公开的系统和方法允许提取在蛋白质和/或极性脂质级分中的金属。这是有利的，因为蛋白质和极性脂质并不受金属暴露的高度影响，且在一些情况下实际上被金属稳定。

[0126] 本文公开的系统和方法可以以湿生物质开始，降低干燥和脱水成本。与常规的提取工艺相比，公开的提取和分级分离工艺应具有相对低的操作成本，由于中等温度和压力条件、以及溶剂再循环。此外，常规提取工艺成本过高的，不能满足市场的需求。

[0127] 本文所述的系统和方法的又一方面为实现初步精制的能力，其在提取工艺期间分离中性脂质与极性脂质。示例性实施方案中使用的藻类油和先前实施方案中使用的植物油之间的差异包括单独脂质种类的百分比。将示例性藻类粗制油组成与植物油的比较示于以下表2：

[0128] 表2

[0129]藻类粗制油(w/w) 植物油(w/w)

[0130]中性脂质 30-90% 90-98%
磷脂 10-40% 1-2%
糖脂 10-40% <1%
游离脂肪酸 1-10% <3%
蜡 2-5% <2%
色素 1-4% Ppm

[0131] 对植物油进行脱胶(物理和/或化学)以便去除极性脂质(如，糖脂和磷脂)。已进行化学脱胶的植物油保留显著量的中性脂质。使用溶剂提取或超临界/次临界流体提取/膜技术将中性脂质级分进一步从脱胶材料中去除。相反，从含油藻类生物质分离中性脂质比从植物油原料困难得多，由于通常藻类油中发现存在大量的极性脂质(参见表2)。这是因为藻类油中存在更大百分比的极性脂质增强中性脂质的乳化。乳化被溶液中留存的营养素和盐组分进一步化。极性脂质以及金属的存在导致分离和利用中性脂质的加工困难。然而，由于极性脂质具有现存市场，其回收将为藻类油产生燃料的用途增加显著的价值。

[0132] 极性脂质由于其分子结构在性质上是表面活性剂且具有巨大的现存市场。用于生产极性脂质的许多现有技术为原材料或成本过高的。糖脂和磷脂的替代原料主要为藻类油、燕麦油、小麦胚芽油和植物油。藻类油通常含有约30-85%(w/w)极性脂质，取决于物种、细胞的生理状态、培养条件、收获时间和用于提取的溶剂。此外，每种极性脂质的甘油骨架具有附接的两个脂肪酸基团而不是中性脂质三酰甘油中的三个。与中性脂质相比，极性脂质的酯交换仅可获得基于质量仅三分之二的终产物，即，酯化脂肪酸。因此，极性脂质的去除和回收将不但在从藻类中生产高品质的生物燃料或甘油三酯方面是高度有益的，而且会产生增值的副产物糖脂和磷脂，其继而可以补偿基于藻类的生物燃料生产相关的成本。能够容易地回收和分级分离由藻类生产的各种油和副产物的能力对藻类油工艺的经济上的成功是有益的。

[0133] 本文所述的方法和系统的另一方面为从含油材料诸如藻类生物质中提取蛋白质的能力。从藻类生物质中提取蛋白质材料的本文公开的方法包括提取和分级分离的灵活和高度可定制的工艺。例如，在一些实施方案中，提取和分级分离发生在单步骤中，从而提供高效的工艺。来源于此类生物质的蛋白质适用于动物饲料、食品成分和工业产品。例如，此类蛋白质可用于诸如纤维、粘合剂、涂料、陶瓷、油墨、化妆品、纺织品、口香糖和生物可降解塑料的应用中。

[0134] 本文所述方法和系统的又一个方面涉及基于待提取的组分改变藻类生物质与溶剂的比率。在一个实施方案中，藻类生物质与等重量的溶剂混合。在又一个实施方案中，藻类生物质与较小重量的溶剂混合。在又一个实施方案中，藻类生物质与较大重量的溶剂混合。在一些实施方案中，基于待使用的溶剂和藻类生物质/溶剂混合物的所需极性，计算与藻类生物质混合的溶剂的量。在其它实施方案中，以若干步骤提取藻类团块。在示例性实施方案中，连续提取藻类生物质，首先以其重量的约50-60%的略微非极性的、水可混溶的溶剂。第二，使用溶剂中约70%的固体重量提取剩余的藻类固体。然后第三提取使用溶剂中约90%的固体重量进行。由于已被告知本发明的这些方面，通过为了选择性地提取藻类产物而将藻类生物质和/或固体残余物的比率调节至所需极性，本领域技术人员将能够使用不同极性的不同溶剂。

[0135] 例如，在优选的实施方案中，使用的溶剂为乙醇。通过改变溶剂的比率可选择性地分离组分。蛋白质可以用约50%乙醇从藻类生物质提取，极性脂质则用约80%乙醇，中性脂质则用约95%或更高比例的乙醇。如果使用甲醇，那么从藻类生物质中提取蛋白质的溶剂浓度将为约70%。极性脂质将需要约90%甲醇，以及中性脂质将需要约100%甲醇。

[0136] 本文所述的系统和方法的实施方案显示出令人惊异的和出乎意料的结果。首先，回收/提取工艺可对湿生物质进行。这是主要的经济学优点，因为示例性实施方案避免使用干燥和破坏细胞所需的大量能量。使用本发明的系统和方法从干藻类生物质中提取中性脂质远更有效。从公开工艺中获得的产率比通过常规提取获得的那些显著更高和更纯。这是因为常规提取经常产生乳液，使得组分分离极其困难。

[0137] 示例性实施方案可适用于任何藻类或非藻类含油材料。示例性实施方案可用于任何水可略微混溶的非极性溶剂，包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈。具体实施方案可使用绿色可再生溶剂，诸如乙醇。所测试的醇溶剂导致分离的中性脂质的较高产率和纯度。与本文公开的其它溶剂相比，乙醇是购买相对经济的。在一些示例性实施方案中，提取和分级分离可以在一个步骤中进行，随后，如果需要，进行基于膜的纯化。所得生物质几乎无水的，并可以用比含水藻类浆料更少的能量来完全干燥。

[0138] 在一些示例性实施方案中，用于提取的溶剂为乙醇。其它实施方案包括但不限于环己烷、石油醚、戊烷、己烷、庚烷、二乙醚、甲苯、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙腈、异丙醇和甲醇。在一些实施方案中，在连续提取步骤中使用相同的溶剂。在其它实施方案中，在各个提取步骤中使用不同的溶剂。在其它实施方案中，将两种或多种溶剂混合且用于一个或多个提取步骤。

[0139] 在本文所述方法的一些实施方案中，在任何提取步骤中使用的两种或多种溶剂的混合物包括至少一种亲水性溶剂和至少一种疏水性溶剂。当使用此类混合物时，亲水性溶剂通过扩散从生物质中提取材料。同时，联合使用相对少量的疏水性溶剂，并且使其参与液体-液体分离，使得目标材料被浓缩在少量的疏水性溶剂中。然后两种不同的溶剂形成两层系统，该系统可以使用本领域已知的技术来分离。在这样的实施方式中，疏水性溶剂可为烷烃、酯、酮、芳烃、卤代烷烃、醚或商业用混合物(如，柴油、喷气燃料、汽油)中的任何一种或多种。

[0140] 在一些实施方案中，本文所述的提取工艺在一个或多个步骤中并入pH偏移。此类pH偏移可用于分离蛋白质材料。在一些实施方案中，提取工艺的pH为酸性(如，小于约5)。在一些实施方案中，提取工艺的pH为碱性(如，大于约10)。

[0141] 在常规提取操作中己烷的使用污染了藻类生物质，使得副产物不能用于食品中。本发明的实施方案优于本领域已知的那些，因为它们需要使用低得多的能量且使得产品适合用作燃料以及食品和营养补充剂。

[0142] 可以设想本说明书中讨论的任何实施方案可以以本发明的任何方法或系统实现，且反之亦然。此外，本发明系统可用于实现本发明的方法。

[0143] 示例性实施方案的描述

[0144] 对于从藻类中溶剂提取油，最佳情形是这样的溶剂，该溶剂选择性地提取三酰基甘油(TAG)，且以高回收率留下藻类细胞中的所有极性脂质和非TAG中性脂质(诸如蜡、甾醇)。第二选择将为选择性地提取极性脂质，然后提取不含极性脂质的更纯的中性脂质，导致高回收率。最后一个选择将为在一个或两个步骤中提取所有的脂质并实现非常高的回收率。

[0145] 现参考图1A，流程图100提供从含藻类生物质分级分离和纯化脂质中所用的方法的示例性实施方案中包括的步骤的概述。在第一步骤110中，收获藻类细胞。在随后的步骤120中，从藻类细胞中去除水来获得10-25%固体生物质。在步骤130中，对生物质进行基于溶剂的提取并收集级分。在一些实施方案中，步骤130也将并入基于pH的提取和级分收集。最后，可在步骤140中进行固/液相分离(包括但不限于诸如过滤、滗析和离心的技术)以分离出较少的脂质组分。

[0146] 藻类生物质在步骤110中收获时通常由约1-5g/L的总固体组成。所述生物质可在步骤120中使用技术(包括但不限于溶气浮选、膜过滤、絮凝、沉降、压滤、滗析或离心)进行部分脱水。脱水为从固体或半固体物质中去除一些、大多数、或所有的水。本发明的实施方案利用脱水技术从收获的藻类生物质中去除水。脱水可使用本文所述的任何方法或任何方法的组合以及本领域技术人员已知的任何其它方法进行。

[0147] 由步骤120产生的脱水性藻类生物质通常由约10-30%固体组成。然后该生物质可在多阶段逆流溶剂提取工艺(在各个阶段分离级分)中用水可略微混溶的非极性溶剂(如醇)进行提取。这种类型的工艺可降低资本和操作费用两者。在一些实施方案中，生物质也经历酸和/或碱提取以分级分离蛋白质材料。

[0148] 在一些实施方案中，藻类生物质的脱水可通过用溶剂诸如乙醇处理所收获的藻类生物质来进行。随后使藻类生物质沉淀出溶液，然后可通过诸如但不限于虹吸的方法去除液体。这种新型的脱水方法具有比已知方法低的资金和操作成本，能够实现溶剂再循环，降低干燥生物质的成本且在开始提取和/或分离藻类组分之前具有降低藻类生物质极性的附加益处。事实上，理论上本文所述的基于溶剂的沉淀工艺是有效的，部分是因为有机溶剂减少或中和藻类表面上的负电荷的事实。在本发明的一些实施方案中，将脱水方法合并以便去除更多的水。在一些实施方案中，在脱水工艺期间加入溶剂开始提取工艺。

[0149] 图1B示出脱水工艺300的示例性实施方式。对具有最终干重为约1g/L至约10g/L(即，0.1-1%w/w)的藻类培养物310进行水分离工艺320。工艺320可包括离心、滗析、沉降或过滤。在一个实施方案中，使用烧结金属管滤器来从培养物的水分离藻类生物质。当使用此类滤器时，将回收的水330直接再循环至其它藻类培养物。同时，回收的藻类生物质已被浓缩至“藻类糊”，其藻类密度高达约200g/L(即，10-20%w/w)。然后在基于溶剂的沉降工艺350中用溶剂340处理该浓缩的藻类糊。

[0150] 沉降工艺350包括将溶剂340加入至藻类糊以实现具有约1:1至约1:10的溶剂与生物质的比率(重量/重量)的混合物。使藻类在沉降容器中沉降，以及通过例如虹吸和/或滗析去除溶剂/水混合物360。通过众所周知的技术，诸如蒸馏和/或全蒸发，可对溶剂进行回收和再利用。预期剩余的湿生物质370在乙醇和水溶液中具有约30%至约60%w/w的固体含量。

[0151] 理想用于脱水的溶剂为工业上常用的密度大于1.1g/mL或小于0.9g/mL水溶性溶剂。实例包括异丙醇、丙酮、乙腈、叔丁醇、乙醇、甲醇、1-丙醇、重水(D2O)、乙二醇和/或甘油。如果溶剂密度大于1.1g/mL，那么藻类生物质将漂浮而不是在沉降器底部产生沉淀。

[0152] 图2为提取系统200的示例性实施方案的示意图。使用本领域已知的方法(包括但不限于移动带、螺旋输送机或经由提取腔)来运送湿或干藻类生物质。将用于提取的溶剂从分配到每个生物质槽位置的贮存罐再循环。过滤该提取混合物，将生物质固体返回到槽中且将提取物返回到贮存罐中。传送带上的固体根据提取需要的停留时间周期性地移动。每个贮存罐中的提取物可在饱和时被补充或被新鲜溶剂连续地替换。这也将大幅度地减少下游加工时间和成本。该实施方案包括主要储器210，传送机构220、多个分离装置241-248(如，膜过滤装置)、多个提取储器261-268和多个再循环泵281-287。在该实施方案中，主要储器210被划分成多个入口储器211-218。

[0153] 在操作工艺中，藻类生物质201设置在靠近传送机构220的第一末端221的第一入口储器211。此外，将溶剂205置于靠近传送机构220的第二末端222的入口储器218中。传送机构220使藻类生物质沿着传送机构220从第一末端221引导至第二末端222。当传送藻类生物质时，其通过多个分离装置241-248且被分成不同极性的级分。将通过分离装置241-248的扩散物部分引导至储器261-268中。

[0154] 例如，将通过第一分离装置241的藻类生物质的扩散物部分(如，含有液体和足够小以通过分离装置241的颗粒的部分)引导至主要储器261中。扩散物部分可从主要储器261循环返回至第一入口储器201中。藻类生物质不通过第一分离装置241的滞留物部分然后可通过传送机构220引导至第二入口储器212和第二分离装置242中，所述分离装置可包含比第一分离装置241更精细的分离或过滤介质。

[0155] 可将通过第二分离装置242的扩散物部分段引导至第二储器262，然后经再循环泵282再循环回至第二入口储器212。可将不通过第二分离装置242的藻类生物质的滞留物或提取部分通过传送机构220引导至第三入口储器213。对于入口储器213-218和分离装置243-248可重复该工艺，以使每个阶段的滞留物部分引导至随后的入口储器，而将滞留物部分引导至再循环储器且循环返回至当前入口储器。

[0156] 在示例性实施方案中，将用最高的水与略微非极性溶剂的比率(即，极性最大的混合物)来提取第一级分，而将用最纯的略微非极性溶剂(即，极性最小的混合物)来提取最后级分。因此该工艺以级分极性递减的顺序提取组分。第一级分的功能为去除残留水且便于溶剂提取工艺。随后的级分富含极性脂质，而最终级分富含中性脂质。

[0157] 可酯化所述油级分以释放长链不饱和脂肪酸。类胡萝卜素和长链不饱和脂肪酸可使用诸如分子蒸馏和非分子蒸馏结合的工艺从油中分离。所有的脂肪酸可使用分子蒸馏从类胡萝卜素中分离。可使用简易的蒸馏柱来分级分离馏出物以分离低链脂肪酸用于精制。长链不饱和脂肪酸作为高沸点残余物保留在该柱中。

[0158] 在一些非限制性实施方案中，本文所述的提取系统和方法并入一个或多个步骤来从含油材料(如，藻类生物质)分离蛋白质材料。此类蛋白质提取步骤使用pH调节来实现蛋白质的分离和提取。例如，在一个非限制性实施方案中，为了蛋白质提取优化第一分离设备中溶剂的pH，从而产生富含蛋白质材料的第一级分。根据目标蛋白质的pKa调节蛋白质提取步骤的pH。目标蛋白质的pKa可使用本领域技术人员已知的方法来确定，包括但不限于使用泊松-玻尔兹曼方程(Poisson-Boltzmann equation)、经验方法、基于分子动力学的方法或者使用滴定曲线。

[0159] 在一些实施方案中，溶剂pH为碱性。例如，在一些实施方案中，溶剂pH大于约10。在其它实施方案中，溶剂pH在约10至约12的范围内。在其它实施方案中，溶剂pH为约
10、约11或约12。在其它实施方案中，溶剂pH为酸性。例如，在一些实施方案中，溶剂pH小于约5。在其它实施方案中，溶剂pH在约2至约5的范围内。在其它实施方案中，溶剂pH为约2、约3、约4、约4.5或约5。然后将第一分离设备的提取部分引导至随后的入口储器以实现基于极性的提取和分级分离。在又一非限制性实施方案中，通过类似的方法(即，溶剂pH调节)将蛋白质材料在最终分离装置中分离。

[0160] 溶剂pH的调节根据本领域技术人员已知的方法来进行。例如，酸性pH通过向溶剂流中混合适当的酸来实现。用于蛋白质提取的示例性酸包括但不限于磷酸、硫酸和盐酸。类似地，碱性pH通过向溶剂流添加和混合适当的碱来实现。用于蛋白质提取的示例性碱包括但不限于氢氧化钾和氢氧化钠。

[0161] 在一些实施方案中，蛋白质提取在分离自本文所述的提取和分级分离系统中进行。例如，在一些实施方案中，将藻类生物质浸泡在pH-调节的溶剂混合物中，随后经由适当的分离技术(如，离心或过滤)分离。然后如本文所述地将剩余固体并入基于极性的提取和分级分离系统。类似地，在一些实施方案中，将来自基于极性的提取和分级分离工艺的剩余提取物暴露于pH-调节的溶剂混合物中以在提取工艺结束时分离蛋白质材料。

[0162] 如图3所示，通过使用允许脂质从固体材料中分离的索氏提取工艺深入分析溶剂和对提取的影响，开发了基于极性的溶剂选择和分级分离理论。索氏提取系统用于快速筛选用于脂质类选择性和回收的溶剂。对包括宽范围极性的来自各种化学类别的溶剂(诸如烷烃、环烷烃、烷基卤化物、酯、酮)进行了测试。在提取之前，使用针对藻类油估算的标准化方法(诸如布莱-戴亚(Bligh-Dyer)脂质提取方法)以一式三份进行测试待提取生物质的脂质含量和组成。生物质含有22.16%总脂质，其中49.52%为中性脂质。

[0163] 图3展示通过使用各种极性和非极性溶剂结合索氏提取工艺提取干藻类团块而收集的数据。根据烷烃溶剂的链长，在无破坏和溶剂提取的情况下可实现60-70%纯度的中性脂质和15-45%的总脂质回收率。所测试的最长链烷烃溶剂(庚烷)回收60%的中性脂质和42%的总脂质。如图3所示，使用溶剂和传统提取方法(诸如己烷)提取干藻类团块的效果是低效的、昂贵的且产率低。本文公开的系统和方法解决这些低效，通过控制略微非极性溶剂与水的比例以便分离出不同极性的组分，且组分的损失最少。

[0164] 低级碳醇溶剂对于极性脂质更具选择性。中性脂质纯度对于甲醇为22%，而对于乙醇为45%。异丙醇未显示在极性和非极性脂质之间的任何选择性，产生52%纯的中性脂质产物。甲醇回收67%的总脂质和多于90%的极性脂质。因此，甲醇是本发明实施方案的优异候选物，其中甲醇可用于在使用庚烷或己烷提取中性脂质之前从含油材料中选择性地提取极性脂质。所测试的其它溶剂类别未显示对脂质类别的任何选择性，因为中性脂质纯度接近49%，与原始生物质中存在的脂质组成相似。此外，用这些溶剂实现的总脂质回收率的范围为约15-35%，使得这些溶剂不适用于选择性提取特定脂质类别或总脂质提取。

[0165] 来自索氏分析的结果使用下文实施例1所述的标准实验室规模分批溶剂提取装置得到证实。对于第一步骤选择的溶剂是甲醇以回收极性脂质，且在第二步骤中选择石油醚以回收中性脂质。所有的提取用1:10固体:溶剂比率进行。在该实验中各个提取步骤为1小时长。进行的其它实验(数据未示出)指出，约45分钟或更长时间对于成功提取是足够长的。该保留时间取决于系统的热和质量传递。

[0166] 在不同温度40℃、50℃和65℃下进行甲醇提取以确定哪个最佳。石油醚提取在35℃(该温度接近溶剂的沸点)下进行。之所以选择石油醚是因为其对于中性脂质的高选择性、低沸点和在提取之后观察到的产物品质。

[0167] 图4A示出在65℃甲醇提取步骤之后进行的石油醚提取中的中性脂质纯度大于80%，证明这两个提取步骤的组合增强了最终粗制油产品的中性脂质含量。图4B示出总中性脂质回收率很低且在第一步骤中存在显著量的中性脂质损失。

[0168] 为了使甲醇提取步骤中中性脂质的损失最小化，可通过向溶剂添加水来增加溶剂的极性。图5A和5B示出用70%v/v甲醇水溶液提取上述生物质，然后用石油醚提取的结果。图5A示出石油醚提取中的中性脂质纯度比通过使用纯甲醇实现的中性脂质纯度高得多。此外，通过在第一提取步骤中使用甲醇水溶液大大减少中性脂质的损失。如图5B中观察到，在高温的甲醇提取改进中性脂质纯度，但是在随后的步骤中略微降低总脂质回收率。

[0169] 在一些示例性实施方案中，控制提取工艺的温度以确保存在于藻类生物质中的藻类组分的最佳稳定性。藻类蛋白质、类胡萝卜素和叶绿素为表现温度敏感性的藻类组分的实例。在其它实施方案中，在已从藻类生物质中提取温度敏感性藻类组分之后升高温度。

[0170] 在其它示例性实施方案中，调节提取工艺的温度以优化所需产物的产率。提取可在环境温度至(但低于)提取混合物的沸点下运行。在其它实施方案中，根据所需产物的溶解度改变提取工艺的温度。在其它实施方案中，根据待提取的生物质的藻类株系优化提取温度。升高的提取温度增加所需化合物的溶解度且降低增强提取回收率的提取混合物的粘度。

[0171] 在一些实施方案中，提取在压力下运行以升高提取混合物的沸点。在这些实施方式中，将压力加入至防止沸腾必需的程度，同时保持提取混合物的温度低于任何所需产物将开始降解、变性、分解、或被破坏的温度。

[0172] 在一些示例性实施方案中，提取在所用溶剂的沸点附近、在进行提取的条件(如，大气压或高压)下进行。在其它实施方案中，提取在提取混合物的沸点附近进行，再次考虑其它提取条件。在这样的温度下，由于质量转移阻力较低，溶剂向藻类细胞的汽相渗透较快。如果允许提取温度显著超过溶剂的沸点，则溶剂-水系统可形成共沸物。因此，将系统维持在或接近溶剂的沸点将产生足够蒸汽以增强提取，同时降低成本。此外，油的溶解度在较高温度增加，这可进一步增加接近溶剂沸点的温度下的提取效力。图6示出在甲醇水溶液-石油醚提取方案中的总脂质回收率。虽然在其沸点温度附近进行甲醇提取略微降低中性脂质回收率，如图5B中所观察到的，但是其增强总脂质回收率。

[0173] 在其它实施方案中，提取在环境光照条件下进行。在其它实施方案中，提取在不透明的容器，诸如但不限于钢管或罩中进行，以便保护光敏性藻类组分免于降解。类胡萝卜素为光敏性藻类组分。

[0174] 在其它示例性实施方案中，提取在正常大气条件下进行。在其它实施方案中，提取在氮气气氛下进行以便保护藻类组分易于氧化。在其它实施方案中，提取在惰性气体气氛下进行以便保护易于氧化的藻类组分。可易于氧化的藻类组分包括类胡萝卜素、叶绿素和脂质。

[0175] 在示例性实施方案中，用于提取的溶剂与固体的比率为3-5(基于生物质中固体的干重)。残留的藻类生物质富含碳水化合物(如，淀粉)且可用作原料来生产用于提取的溶剂。

[0176] 图7示出溶剂与固体的比率对总脂质回收率的影响。随着溶剂与固体的比率增加，总脂质回收率有相应的和大幅的增加。据信，这是因为与其它常用的油提取溶剂诸如己烷相比，脂质在甲醇中的溶解度较低。

[0177] 组分的溶解度受提取工艺中使用的溶剂的极性影响。所需产物的溶解度性质可用于确定湿生物质与溶剂的适当的比率以选择性提取所需产物。在本发明的双溶剂提取系统中，基于两亲性溶剂和脂质在疏水性溶剂中的溶解度计算疏水性溶剂的量。

[0178] 约6.5至6.7的极性指数提取蛋白质和其它醇溶性物质诸如糖和盐。已发现，在从此类提取混合物中去除醇和蛋白质之后，剩余的材料为优良的发酵培养基。用于提取极性脂质和中性脂质的混合物的极性指数分别计算为约5.6至5.9和5.3至5.5。提取所需组分的关键为通过改变疏水性溶剂和两亲性溶剂的量来控制提取混合物的极性，总是考虑到湿藻类生物质中存在的水。通过使用溶剂的已知极性指数，可以调节溶剂的量以实现所需提取混合物的极性。

[0179] 例如，40%w/w湿生物质对于每100g湿生物质具有40g生物质和60g水。如果将100g乙醇加入至该混合物，则乙醇与湿生物质的比率为1份湿生物质比1份乙醇且混合物中乙醇的浓度为100/(100+60)，等于液相中的约62%w/w乙醇。乙醇水混合物中62%w/w乙醇对应6.6的极性指数，按重量计算且平均各组分的极性。具有极性指数5.2的乙醇和具有极性指数9的水，在含有62%乙醇和38%水的混合物中，导致极性指数为(0.62*5.2+.38*9)，即约6.6。用于提取极性脂质和中性脂质的混合物的极性指数分别计算为约5.8和5.4。

[0180] 例如，40%w/w湿生物质对于每100g湿生物质具有40g生物质和60g水。如果将100g乙醇加入至该混合物，则乙醇与湿生物质的比率为1份湿生物质比1份乙醇且混合物中乙醇的浓度为100/(100+60)，等于液相中的约62%w/w乙醇。乙醇水混合物中62%w/w乙醇对应6.6的极性指数，按重量计算且平均各组分的极性。具有极性指数5.2的乙醇和具有极性指数9的水，在含有62%乙醇和38%水的混合物中，导致极性指数为(0.62*5.2+.38*9)，即约6.6。用于提取极性脂质和中性脂质的混合物的极性指数分别计算为约5.8和5.4。如果将乙腈用作疏水性溶剂，那么乙腈的量将为乙醇的量的约2%至4%，因为将存在乙醇/乙腈/水共沸物中水的量的几乎两倍体积的界面层体积，其为约2%。

[0181] 在又一个实例中，40%w/w湿生物质对于每100g湿生物质具有40g生物质和60g水。如果将100g乙醇加入至该混合物，则乙醇与湿生物质的比率为1份湿生物质比1份乙醇且混合物中乙醇的浓度为100/(100+60)，等于液相中的约62%w/w乙醇。乙醇水混合物中62%w/w乙醇对应6.6的极性指数，按重量计算且平均各组分的极性。具有极性指数5.2的乙醇和具有极性指数9的水，在含有62%乙醇和38%水的混合物中，导致极性指数为(0.62*5.2+.38*9)，即约6.6。用于提取极性脂质和中性脂质的混合物的极性指数分别计算为约5.8和5.4。如果己烷用作疏水性溶剂，那么己烷的量将为乙醇的量的约6%至12%，因为将存在为乙醇/己烷/水共沸物中水的量的几乎两的界面层体积，其为约6%。这是因为界面层的尺寸与系统中使用的两种溶剂的混溶性相关，且进一步受提取混合物中存在的蛋白质和各种脂质的去污剂样作用的影响。界面层的尺寸还与混合物的温度相关。随着温度升高，两种溶剂变得更加混溶，从而增加界面层的尺寸。

[0182] 在又一个实例中，如果提取溶剂为异丙醇和乙醇的1:1混合物，那么该溶剂的极性为((3.9+5.4)/2)，即为约4.65。计算溶剂与湿生物质的比率以匹配该极性。为了得到6.6极性指数，我们将需要制备通过求解以下代数方程式而计算的55%w/w的IPA-水混合物：

[0183]

[0184] 因此，对于40%w/w湿生物质，湿生物质与IPA的比率为(1-0.55)/0.6～0.75。

[0185] 对于40%w/w湿生物质，这将会对应于100份湿生物质与75份溶剂混合物的比率。40%w/w湿生物质对于每100g湿生物质具有40g生物质和60g水。如果将75g溶剂混合物加入该混合物中，那么混合物中溶剂的浓度为(75/(75+60))，即溶剂混合物-水溶液中约
55%w/w的溶剂混合物。在各个提取阶段和对于每种产物，这些计算可用于获得溶剂生物质的比率。溶剂组的一些非限制性实例呈现在表3A和3B中。

[0186] 表3A

[0187]

[0188] 表3B

[0189]

[0190] 所有实施例中所述的提取混合物由大致上固相和大致上液相组成。这些相然后在提取后分离。然后可以从液相中去除液体溶剂，获得提取产物。在一些实施方案中，蒸发溶剂。在此类实施方式中，可使用液-液提取技术以减少需要被蒸发的溶剂的量。如果条件允许，则使用的任何溶剂可被再循环。

[0191] 据推理，提取之前处理藻类生物质将增强脂质提取的生产率和效率。在该方向上进行了实验，比较向藻类生物质加入碱或另一种有机溶剂以改变表面性质并增强提取的作用。尝试了多种处理，包括甲醇水溶液、氢氧化钠水溶液和DMSO水溶液。如图8显示，加入5%DMSO将脂质回收率增加3倍。可利用这些提取步骤以显著缩少甲醇提取步骤。然而，由于高成本、粘度和回收与再循环DMSO的能力，上述实验中使用的溶液在更大规模下使用可能并不理想。

[0192] 图9示出八步甲醇提取对累积总脂质产率和提取的中性脂质的纯度的影响的图。在该实施方案中，用350mL纯甲醇萃取112克湿生物质(25.6%干重)并在每个步骤中以
160W辐射功率加热保持10分钟。这导致约75℃的提取温度，其接近提取混合物的沸点。使用该工艺确定，已提取了大多数极性脂质后从藻类油中获得高纯度的中性脂质是可能的。
图9示出在极性脂质均已被提取后分离高纯度的中性脂质是可能的。在此情况下甲醇提取步骤5至8中实现5%产率的总生物质和超过90%的中性脂质纯度。此外，由于提取混合物的沸点，生物质中的大部分水在第一提取步骤中与碳水化合物、蛋白质和金属一起被完全提取。

[0193] 图10示出，通过使用乙醇从湿生物质中提取脂质和蛋白质可更有效地进行脂质的回收。通过使用乙醇，在约4个步骤中可实现80%的总脂质回收率，而不是通过使用甲醇通常需要的9个步骤。该回收率的增加可归因于脂质在乙醇中比在甲醇中具有更大的溶解度。此外，乙醇水溶液的沸点高于甲醇水溶液，进一步促进脂质的回收。这是因为较高的温度使得油粘度降低，从而改善扩散性。该工艺的另一个独特优点是使用油级分中残留的乙醇进行酯交换以及降低对生物质干燥操作的热负荷。

[0194] 此外，图10显示初始级分为含有蛋白质和其它高极性分子的非富含脂质级分，接着为富含极性脂质的级分，最后为中性脂质级分。因此，使用适当设计地提取装置，在单个提取和分级分离工艺可回收所有三种产物。

[0195] 本发明的另一个实施方案利用微波来辅助提取。基于本申请公开的先前收集的数据，示出甲醇为从藻类中提取所有脂质的最佳单种溶剂。因此，进行如本申请的实施例1所述的单溶剂多步提取以便收集关于单溶剂微波提取系统的效力的数据。

[0196] 图11为比较常规提取和微波辅助提取的提取时间和总脂质回收率的对数图。基于曲线的斜率，计算出微波系统减少提取时间约五倍或更多。而常规方法具有较高的净脂质回收率，这是由于极性脂质的较高回收率。基于这些结果，已经对使用溶剂、带有或不带有微波辅助下提取干藻类生物质的条件进行了优化。本发明的一些实施方案使用传统的微波装置，其发射激发水分子的波长。本发明的其它实施方案利用能够激发不同溶剂的定制的微波装置。本发明的其它实施方案利用能够激发存在于藻类生物质中的脂质的定制的微波装置。在一些实施方案中，存在于藻类生物质中的脂质使用微波激发，从而增强脂质组分从藻类生物质的分离和提取。

[0197] 水分含量是生物质的将影响油提取效率的另一个参数。在本发明的一些实施方案中，提取且分级分离干藻类团块。在其它实施方案中，藻类团块为湿的。使用藻类生物质含量为10%、25%和33%的生物质样品以研究水分对提取性能的影响。

[0198] 图12A示出从藻类生物质中逐步提取产物的示例性工艺400。图12A中的所有单位均为磅。图12A示出工艺400的质量平衡，而用于进行该工艺的设备和/或系统的详情在本文別处描述。含有5磅藻类的生物质具有约0.63磅极性脂质，1.87磅中性脂质，1磅蛋白质和1.5磅碳水化合物。在脱水步骤405中处理生物质和1000磅水，其从混合物中分离950磅水且将45磅水中的5磅藻类传递至第一提取步骤410。本文公开的任何脱水技术可用于脱水步骤405。在第一提取步骤410中，将238磅乙醇和12磅水与来自前一步骤的藻类和水合并。第一提取步骤410具有约80.9%w/w乙醇的液相。将231磅乙醇、53磅水和0.5磅藻蛋白质的第一液相进行回收，从其中通过如，蒸发去除水和乙醇，留下富含蛋白质的产物415。由蒸发回收的溶剂可再循环至第一提取步骤410。

[0199] 将来自第一提取步骤410的第一固相传递至第二提取步骤420；该第一固相包括4.5磅藻类、2.6磅水和10.9磅乙醇。将86磅乙醇和4磅水加入至来自前一步骤的第一固相。第二提取步骤420具有约93.6%w/w乙醇的液相。将85.9磅乙醇、5.9磅水和0.6磅极性脂质的第二液相进行回收，由此通过如，蒸发去除水和乙醇，留下富含极性脂质的产物
425。由蒸发回收的溶剂可循环至第二提取步骤420。

[0200] 将来自第二提取步骤420的第二固相传至第三提取步骤430，该第一固相包括3.9磅藻类、0.7磅水和11磅乙醇。将70.5磅乙醇和3.5磅水加入至来自前一步骤的第二固相。第三提取步骤430具有约95.4%w/w乙醇的液相。回收78.9磅乙醇、3.9磅水和1.6磅中性脂质的第三液相，从其中通过如，蒸发去除水和乙醇，留下富含中性脂质的产物435。由蒸发回收的溶剂可再循环至第二提取步骤430，保留2.3磅藻类、0.3磅水和6.6磅乙醇的固相。

[0201] 如图12A所示，用每个连续的乙醇提取步骤所得的脂质特征受起始藻类中水分含量的影响很大。工艺400的模式在具有不同的初始含水量的三种不同的生物质收集物上运行。随着初始含水量降低，最大脂质回收步骤从第三提取步骤改变成第四步骤(未示出)。然而，从这三个生物质样品的总脂质回收率是相当类似的，均高于藻类生物质的总脂质含量的95%。

[0202] 当使用具有较高含水量的藻类生物质时，乙醇水溶液混合物中的乙醇浓度低得多，因此粗提物中的中性脂质百分比也较低。已经报道，将具有90%水的藻类糊脱水为非常能量密集型工艺。本文所述的方法出乎意料地可用于成功地提取和分级分离主要含水的藻类团块。由于总脂质回收率不被通过从含90%水的藻类糊(10%藻类固体)开始而显著受影响，不同于常规的提取方法，本文公开的方法不需要使用能量密集型的干燥步骤。

[0203] 图12B示出工艺400中一个提取步骤的示例性实施方式500。向提取容器510提供藻类生物质和溶剂混合物505。在提取藻类(如本文别处描述)之后，将混合物提供至粗过滤系统515，诸如烧结的金属管滤器，其将混合物分离成液相和固相。将固相传递至下游提取步骤。将液相传递至溶剂去除系统520，如蒸发器，来降低液相中溶剂(如，乙醇)含量。任选地，将去除溶剂后剩余的液相传递至离心机525。将溶剂去除系统中剩余的任何固体再循环或丢弃。离心机525有助于从液相中任何剩余的水和/或固体分离所需藻类产物(如，蛋白质或脂质)。

[0204] 图14示出工艺600的一个实例，通过该工艺可加工藻类团块以形成或回收一种或多种藻类产物。在该实例中，使用本文公开的方法在前端工艺605中以逐步的方式萃取藻类生物质。提取和分离步骤之后为酯化工艺610、水解工艺615、加氢处理工艺620和/或蒸馏工艺625以进一步分离组分和产物。组分和产物包括藻类脂质、藻类蛋白质、甘油、类胡萝卜素、营养制品(如，长链不饱和油和/或酯)、燃料酯(一般地，所述酯的链长为C20或更短)、燃料、燃料添加剂、石脑油和/或液体石油替代品。在优选的实施方案中，燃料酯为C16链长。在其它实施方案中，燃料酯为C18链长。在其它实施方案中，燃料酯为链长为C20或更短的混合物。

[0205] 酯化工艺610、水解工艺615、加氢处理工艺620和蒸馏工艺625为任选的且可以多种顺序使用。虚线箭头和带点箭头指示在加工脂质分级时可何时进行水解、加氢处理和/或蒸馏工艺的选项中的一些但并非全部。例如，在本发明的一些实施方案中，在进行提取和/或分离之后，可对中性脂质级分直接进行加氢处理以便制备燃料产品和/或添加剂。可选地，在其它实施方案中，可将中性脂质级分传递至酯化工艺610。

[0206] 酯化工艺610可包括本领域已知的技术，诸如酸/碱催化，并可包括酯交换。尽管对于生产某些产物不排除碱催化，但是酸催化为优选的，因为这些技术避免了在碱催化期间形成的皂，皂可使下游加工复杂化。也可使用酶促酯化技术。酯化可加工大致上纯的脂质材料(如本文所用，大于75%脂质)。在酯化后，可去除甘油副产物。然后酯化脂质可经受分子和/或非分子蒸馏(工艺625)以便分离不同链长的酯化脂质以及存在于脂质级分中的类胡萝卜素。然后可将酯化脂质传递至加氢处理工艺620以产生喷气燃料、生物柴油和其它燃料产品。可使用本领域已知的任何加氢处理工艺；此类工艺向氢添加脂质分子且去除氧分子。加氢处理的示例性条件包括使甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸酯与氢在600psi范围的高压和600°F范围的温度下反应。常用的催化剂为NiMo或CoMo。

[0207] 加氢处理燃料酯而不是粗制脂质具有若干优点。首先，酯化工艺610降低藻类油中存在的某些磷和金属化合物的水平。这些材料为通常用于加氢处理工艺的催化剂的毒物。因此，加氢处理之前的酯化延长了加氢处理催化剂的寿命。此外，酯化降低被加氢处理的化合物的分子量，由此改善加氢处理工艺620的性能。此外，有利的是将来自蒸馏工艺625的待加氢处理的燃料酯保留为蒸汽形式，因为这样做减少了氢化处理所需的能量。

[0208] 在本发明的一些实施方案中，直接加氢处理中性藻类脂质以便将脂质转换成燃料产品和添加剂。而在其它实施方式中，将中性脂质酯化并经由蒸馏工艺625分离成类胡萝卜素、长链不饱和酯、二十碳五烯酸(EPA)酯、和/或燃料酯。蒸馏工艺625可包括分子蒸馏以及本领域已知的任何蒸馏技术。例如，可使用简易的蒸馏柱来分级分离馏出物以分离较低链脂肪酸用于精制。长链不饱和脂肪酸作为高沸点残余物保留在该柱中。在一些实施方案中，然后可将剩余蒸汽送去加氢处理工艺。本发明的两个优点为，其获得纯供料以及蒸汽产物，这有利于能量密集型加氢处理反应，如上所述。

[0209] 在本发明的一些实施方案中，将极性脂质(以及，任选地中性脂质)在传递至酯化反应工艺之前在水解工艺615中水解。这样做释放了藻类脂质的脂肪酸且能够使更大量的藻类脂质形成为有用的产物。

[0210] 图15示出从中性脂质中产生营养品产物的工艺700的流程图。在工艺700的一个实施方式中，将中性脂质进料至吸附工艺705中，其将类胡萝卜素从富含EPA的油中分离。中性脂质可来自通过本文所述的任何选择性提取技术产生的藻类源。然而，中性脂质可来自其它来源，诸如植物来源。

[0211] 吸附工艺705包括使中性脂质与吸附剂接触以吸附类胡萝卜素，诸如β-胡萝卜素和叶黄素。在一个实施方式中，吸附剂为Diaion HP20SS(商购自ITOCHU Chemicals America,Inc.)。中性脂质可以分批型工艺接触吸附剂，其中将中性脂质和吸附剂被保持在容器中持续所选的时间量。在接触时间之后，将吸附剂和液体使用本领域已知的技术进行分离。在其它实施方式中，将吸附剂保持在吸附剂床中且中性脂质通过所述吸附剂床。当通过吸附剂床时，中性脂质的类胡萝卜素含量被减少，从而产生富含EPA的油。

[0212] 类胡萝卜素可通过用适当的溶剂处理吸附剂来从吸附剂材料中回收，所述吸附剂包括但不限于醇类诸如乙醇、异丙醇、丁醇；酯，诸如乙酸乙酯或乙酸丁酯；烷烃诸如己烷和戊烷。

[0213] 图16示出从中性脂质805产生燃料产品830的工艺800的流程图。中性脂质可来自通过本文所述的任何选择性提取技术产生的藻类源。然而，中性脂质可来自其它来源，诸如植物来源。将中性脂质在去胶工艺810中进行处理，其中酸洗所述脂质以降低中性脂质中金属和磷脂的含量。在一些实施方式中，将相对稀磷酸溶液加入至中性脂质中，加热且搅动该混合物。然后从剩余的油分离沉淀的磷脂和金属，例如通过离心。

[0214] 然后将经处理的油传递至漂白工艺815以去除叶绿素和其它色素化合物。在一些实施方式中，漂白工艺815包括将油与粘土和/或其它吸附性材料诸如漂白粘土(即膨润土或漂白土(fuller’searth))接触，这降低了叶绿素和其它色素化合物在油中的水平。然后将经处理的油传递至加氢处理工艺820，其使油组分氢化且除氧以形成燃料产品，例如，喷气燃料混合物、柴油燃料添加剂和丙烷。此外，加氢处理工艺820也导致一些裂化并产生了更小的链化合物，诸如LPG和石脑油。本文所述的任何加氢处理工艺可用于加氢处理工艺820。

[0215] 加氢处理工艺820中形成的化合物的混合物传递至蒸馏工艺825以将其分成各种燃料产品830。蒸馏工艺825可包括本文所述的或本领域已知的用于分离燃料化合物的任何分子和非分子蒸馏技术。

[0216] 在本发明的一些实施方案中，可从藻类生物质中选择性地提取蛋白质。使用公开的方法提取蛋白质提供了许多优点。特别地，藻类细胞无需在提取所需蛋白质之前被裂解。这简化了提取并降低了提取的成本。本发明的方法利用不同类别蛋白质的溶解度特征以将它们从藻类培养物、生物质、糊或块中选择性地提取和分级分离。

[0217] 例如，藻类生物质可经受加热和混合以提取水和称为白蛋白和球蛋白的盐溶性蛋白质。然后此混合物可经受pH的改变以回收称为谷蛋白的碱溶性蛋白质。然后该步骤随后可以是基于溶剂地分离称为醇溶谷蛋白的醇溶性蛋白质。剩余的生物质将富含碳水化合物和脂质。

[0218] 蛋白质可从盐水和淡水藻类细胞中提取，如图17和18所示。盐水藻类培养物或生物质中存在的盐影响不同类别蛋白质的提取，但是本文公开的方法使得能够从淡水或盐水藻类中选择性地提取蛋白质。

[0219] 在一些实施方案中，从淡水藻类细胞中提取蛋白质通过示于图17的新型工艺来实现。加热且混合淡水藻类细胞或淡水藻类生物质。混合可通过本领域已知的多种方法(诸如但不限于搅拌、搅动和摇动)实现。该工艺产生第一加热提取混合物或浆料，其由第一大致上液相和第一大致上固相组成。然后将固相和液相分离。分离可通过本领域已知的多种方法实现，包括但不限于离心、滗析、浮选、沉降和过滤。第一大致上液相富含白蛋白。

[0220] 然后将第一大致上固相与盐水混合且加热以产生第二加热提取混合物或浆料，其由第二大致上液相和第二大致上固相组成。该盐水可为天然海水或者可为盐的水溶液。此类溶液的实例通常将包含约35g/L，其主要由NaCl组成。然后将固相和液相分离。第二大致上液相富含球蛋白。

[0221] 然后将第二大致上固相与水混合且加热以产生第三加热提取混合物或浆料，其由第三大致上液相和第三大致上固相组成。然后将该第三提取混合物或浆料的pH升至9或更大，使第三大致上液相富含谷蛋白。然后将固相和液相分离，第三大致上液相富含谷蛋白。

[0222] 然后将第三组大致上固相与溶剂组混合且加热以产生第四加热提取混合物或浆料，其由第四大致上液相和第四大致上固相组成。在一个优选的实施方案中，溶剂组包含乙醇。在其它非限制性实施方案中，溶剂组包含以下溶剂中的一种或多种：甲醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈。然后将固相和液相分离。该第四大致上液相富含醇溶谷蛋白。剩余的第四大致上固相可富含脂质，这取决于起始藻类生物质的组成。

[0223] 在一些实施方案中，从盐水藻类细胞中提取蛋白质通过示于图18的新型工艺来实现。加热且混合盐水藻类细胞或盐水藻类生物质。混合可通过本领域已知的多种方法(诸如但不限于搅拌、搅动和摇动)实现。该工艺产生第一加热提取混合物或浆料，其由第一大致上液相和第一大致上固相组成。然后将固相和液相分离。分离可通过本领域已知的多种方法实现，包括但不限于离心、滗析、浮选、沉降和过滤。第一大致上液相富含球蛋白。

[0224] 然后将第一大致上固相与水混合且加热以产生第二加热提取混合物或浆料，其由第二大致上液相和第二大致上固相组成。然后将固相和液相分离。第二大致上液相富含白蛋白。

[0225] 然后将第二大致上固相与水混合且加热以产生第三加热提取混合物或浆料，其由第三大致上液相和第三大致上固相组成。然后将该第三提取混合物或浆料的pH升至pH9或更大，使第三大致上液相富含谷蛋白。然后将固相和液相分离，第三大致上液相富含谷蛋白。

[0226] 然后将第三组大致上固相与溶剂组混合且加热以产生第四加热提取混合物或浆料，其由第四大致上液相和第四大致上固相组成。在一个优选的实施方案中，溶剂组包含乙醇。在其它非限制性实施方案中，溶剂组包含以下溶剂中的一种或多种：甲醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈。然后将固相和液相分离。该第四大致上液相富含醇溶谷蛋白。剩余的第四大致上固相可富含脂质，这取决于起始藻类生物质的组成。

[0227] 所公开的方法还提供针对不同类型蛋白质的选择性提取，如图17-20所示。上述提取工艺的任何步骤可与其余的步骤分开进行以便选择性地提取单种蛋白质产物。其两个实例中出现在图17和18中，如围绕提取步骤1a的虚线框显示。

[0228] 在非限制性实例中，可从淡水藻类生物质中选择性提取球蛋白，通过将所述藻类生物质与水混合且加热来产生加热的提取混合物或浆料，该提取混合物或浆料由大致上液相和大致上固相组成。然后可将固相和液相分离。液相富含球蛋白。参见图17，提取步骤1a。

[0229] 在又一非限制性实例中，可从盐水藻类生物质中选择性提取白蛋白，通过将所述藻类生物质与水混合且加热来产生加热的提取混合物或浆料，该提取混合物或浆料由大致上液相和大致上固相组成。然后可将固相和液相分离。液相富含球蛋白。参见图18，提取步骤1a。

[0230] 在又一非限制性实例中，可从淡水或盐水藻类生物质中选择性提取醇溶谷蛋白，如图19所示。选择性提取通过使藻类生物质与溶剂组混合且加热以产生加热的提取混合物或浆料，其由大致上液相和大致上固相组成。然后可将固相和液相分离。液相富含醇溶谷蛋白。

[0231] 在又一非限制性实例中，可从淡水或盐水藻类生物质中选择性提取蛋白片段，如图20所示。选择性地提取通过使藻类生物质与溶剂组混合以产生提取混合物或浆料以及影响混合物中的pH改变而实现。混合物由大致上液相和大致上固相组成。然后可将固相和液相分离。液相富含蛋白质。

[0232] 图22为通过单溶剂(两亲性)系统提取蛋白质的示例性提取系统的示意图。所述示例性系统包括其可被直接泵送至或者可存储在贮存罐中的藻类培养物(2201)、离心机(2202)、提取器(2203)、固体分离滤器(2204)、加热器(2205)，溶剂回收系统(2206)和冷却器(2207)。泵(2213)有助于将每个步骤的产物移至下一步骤。

[0233] 图23示出根据一个示例性实施方案从湿类生物质中提取蛋白质和极性脂质的示例性系统。所述示例性系统包括其可被直接泵送至或者可存储在贮存罐(2301)中的藻类培养物、离心机(2302)，提取器(2303)、滗析器(2304)、加热器(2305)、溶剂回收系统(2306)、冷却器(2307)，贮存罐(2308)，固体分离器(2309)、第二加热器(2310)、第二溶剂回收系统(2311)和第二冷却器(2312)。泵(2313)有助于将每个步骤的产物移至下一步骤。

[0234] 将可被直接泵送至或者可存储在贮存罐(2301)中的藻类培养物离心(2302)以获得泵送至提取器(2303)的浓缩糊。离心单元(2302)可被固体分离器(诸如膜系统或溶气浮选单元或絮凝沉降单元等)替换。将两亲性和疏水性溶剂的混合物加入至提取器中。提取器混合且加热所述溶液达固定时间且低于溶剂混合物的沸点。加热可通过各种方法(诸如用微波、水、蒸汽、热油或电力进行加热)实现。提取可在大气压下或在加压条件下进行以提高提取效率。

[0235] 然后将提取物泵入滗析器来分离较轻相和较重相。该步骤还可使用膜过滤或通过离心进行。较轻相包含疏水性溶剂和极性脂质。较重相由两亲性溶剂、水和藻类组成。将疏水层泵送通过加热器(2305)且泵入至溶剂回收系统(2306)中。将蒸汽通过冷却器(2307)且回收用于再循环。残余物为主要包含极性脂质的浓缩物。将较重相收集在贮存罐(2308)中且泵送通过固液分离器(2309)。所述固体包含提取的藻类生物质，所述提取的藻类生物质可进一步被提取或干燥。将液体部分通过第二加热器(2310)且进入第二溶剂回收系统(2311)。将来自该系统的蒸汽通过第二冷却器(2312)来回收且再循环该两亲性溶剂。水和蛋白质形成溶剂回收单元中的残余物。

[0236] 图24为用双溶剂(两亲性/疏水性)系统提取中性脂质和蛋白质的示例性提取方案的示意图。所述示例性系统包括其可被直接泵送至或者可存储在贮存罐中的藻类培养物(2401)、离心机(2402)，提取器(2403)、滗析器(2404)、加热器(2405)、溶剂回收系统(2406)、冷却器(2407)，贮存罐(2408)，固液分离器(2409)、第二加热器(2410)、第二溶剂回收系统(2411)和第二冷却器(2412)。泵(2413)有助于将每个步骤的产物运输至下个步骤。

[0237] 图25为根据一个示例性实施方案从湿藻类生物质中提取蛋白质、极性脂质和中性脂质的示例性系统的示意图。该示例性系统包括藻类培养物(2501)，其可被直接泵送至或者可存储在贮存罐、离心机(2502)，提取器(2503)、滗析器(2504)、加热器(2505)、溶剂回收系统(2506)、冷却器(2507)，贮存罐(2508)，固液分离器(2509)、第二加热器(2510)、第二溶剂回收系统(2511)和第二冷却器(2512)中。

[0238] 将藻类培养物(2501)离心(2502)以获得浓缩糊，其被泵送至提取器(2503)。离心单元(2502)可被固体分离器(诸如膜系统或溶气浮选单元或絮凝沉降单元等)替换。将两亲性和疏水性溶剂的混合物加入至提取器中。提取器混合且加热所述溶液达固定时间且低于溶剂混合物的沸点。加热可通过各种方法(诸如用微波、水、蒸汽或热油或电力进行加热)实现。提取可在大气压下或在加压条件下进行以提高提取效率。然后将提取物泵入滗析器来分离较轻相和较重相。该步骤还可使用膜过滤或通过离心进行。

[0239] 较轻相由疏水性溶剂和极性脂质组成。较重相由两亲性溶剂、水和藻类组成。将疏水层泵送通过加热器(2505)且泵入至溶剂回收系统(2506)。将蒸汽通过冷却器(2507)且回收用于再循环。残余物为主要由极性脂质组成的浓缩物。将较重相收集在贮存罐(2508)中且泵送通过固液分离器(2509)。所述固体由提取的藻类生物质组成，所述提取的藻类生物质可被进一步提取或干燥。将液体部分通过第二加热器(2510)且进入第二溶剂回收系统(2511)。将来自该单元的蒸汽通过第二冷却器(2512)来回收和再循环两亲性溶剂。水和蛋白质形成溶剂回收单元中的残余物。将来自固液分离器(2509)的所提取的固体在第二提取器(2518)的系统中用一定比率的两亲性溶剂与水再次进一步提取。将两亲性和疏水性溶剂的第二混合物加入至第二提取器中。第二提取器混合且加热所述溶液达固定时间且低于第二溶剂混合物的沸点。然后将第二提取物泵入第二滗析器(2519)来分离较轻相和较重相。较轻相由疏水性溶剂和中性脂质组成。较重相由两亲性溶剂、水和藻类组成。将疏水层泵送通过加热器(2520)且泵入至溶剂回收系统(2521)。将蒸汽通过冷却器(2522)且回收用于循环。残余物为主要包括中性脂质的浓缩物。将较重相再循环至提取器(2518)或干燥。泵(2513)有助于将每个步骤的产物移至下一步骤。

[0240] 图26为显示乙醇提取概念的示意图。当乙醇的量随着系统中的水和疏水性溶剂的量成比例地改变时，可选择性提取不同组分。

[0241] 由于已被告知本发明的这些方面，本领域技术人员将能够通过单步提取工艺或多步提取工艺从淡水或盐水藻类生物质中选择性提取需要的极性脂质或蛋白质。鉴于本公开，本领域技术人员将能够互换上述公开的多步提取方案的顺序，条件是考虑到了藻类团块的蛋白质含量和目标蛋白质的溶解性质。所公开方法的其它实施方案可在各个提取步骤之间并入洗涤步骤。

[0242] 对于任何的公开的蛋白质提取方法，可将提取混合物/浆料维持在加热温度下保持一段时间。在一些实施方案中，将提取混合物在加热温度下保持约20分钟至约90分钟。在一些方面，将提取混合物在加热温度下保持约20分钟至约60分钟。在其它方面，将提取混合物在加热温度下保持约45分钟至约90分钟。

[0243] 在一些实施方案中，可将提取混合物/浆料加热至低于约50℃的温度。在一些方面，在低于约50℃的温度提取清蛋白、球蛋白和谷蛋白。在其它实施方案中，将提取混合物/浆料加热至接近提取混合物/浆料的沸点的温度。在一些方面，在接近提取混合物/浆料的沸点的温度提取醇溶谷蛋白。在其它实施方案中，在加热和混合步骤期间将压力升至大气压以上(高达且包括50psi)以增强提取。

[0244] 藻类生物质的贮存期限可通过去除间质水和胞外水而增加。这导致在一段时间内较少的微生物生长和生物质污染。这可通过在不加热的条件下将两亲性溶剂与藻类培养物或生物质混合来实现。通过该工艺未提取任何产物，但是水从生物质或培养物中去除并用溶剂替换。在一些实施方案中，溶剂替代藻类培养物或生物质中50-90%的水。在一些实施方案中，两亲性溶剂为乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇、丁酮、二甲醚和丙醛。2-丙醇、乙腈、叔丁醇、1-丙醇、水、重水(D2O)、乙二醇、甘油或其组合。在一些实施方案中，两亲性溶剂为用异丙醇变性的乙醇。在其它实施方案中，溶剂为异丙醇。在其它实施方案中，溶剂为水。在其它实施方案中，除去间质水和胞外水在冷却的条件下进行。材料中的含水量的减少导致贮存期限的提高。

[0245] 实施例1

[0246] 将绿色微藻类二形栅藻(Scendesmus dimorphus，SD)在室外板状光生物反应器中进行培养。收获不同脂质含量的SD样品。在通过离心去除大量水之后，将藻类样品以3-5cm藻类饼储存在-80℃直到使用。将预先计算量的湿藻类生物质(15克干藻类重量当量)和90mL乙醇溶剂加入至配有冷凝器、机械搅拌器和热电偶的三颈烧瓶中。在一个实验中，将混合物在微波辐射下回流10分钟。在第二实验中，将混合物用电加热回流1h。然后，将混合物冷却至室温且通过过滤分离成扩散物和滞留物。

[0247] 按照Bligh和Dyer的脂质提取方法使用氯仿-甲醇-水系统分析藻类样品的总脂质。该总脂质值被用作脂质回收率计算的参考。通过标准柱色谱法使用60-200目硅胶(Merck Corp.,Germany)将总脂质进一步分离成中性脂质和极性脂质。将每种脂级分转移至预先称重的小瓶中，首先使用旋转蒸发器(Büchi,Switzerland)在30℃蒸发，然后在高真空下干燥。将干燥的滞留物置于氮气下，然后进行称重。使用十七烷酸(C17:0)作为内标，将每个样品的脂肪酸特征在衍生化成脂肪酸甲酯之后通过GC-MS进行定量。

[0248] 结果(数据未显示)表明，微波辅助性提取对于第一提取步骤中极性脂质的去除是最好的，但对于中性脂质的分离稍微低效。电加热在提取效力方面更一致。微波辅助性提取和电加热辅助性提取之间的最终产率是相当的，但是，微波辅助性提取显著更快。

[0249] 实施例2

[0250] 从藻类生物质提取蛋白质

[0251] (1)酸浸出：将藻类生物质浸泡在pH4.5的水中保持1小时。然后以3000rpm离心样品3分钟，并去除上清液。将剩余固体用稀酸(pH4.5)洗涤3次并冷冻干燥。

[0252] (2)碱提取：将藻类生物质浸泡在pH11的水中保持1小时，然后加入PH-调节水。然后以3000rpm离心样品3分钟，并去除上清液。将上清液用酸(pH4.5)中和，然后离心。
将剩余固体用稀酸(pH4.5)洗涤3次并冷冻干燥。

[0253] 酸浸出和碱提取的结果示于下文表4。

[0254] 表4

[0255]

[0256] 蛋白质产率按基于重量计算，比较冻干的固体的重量与浸泡在pH-调节水之前的藻类生物质的重量。蛋白质纯度由美国油化学家协会(American Oil Chemists'Society)的公告方法(Ba-2a-38)，测量各种工艺的冻干的固体中的氮量来确定。因为蛋白质为增加藻类产物提取的价值的重要产物，所以该信息允许在本文公开的方法的系统中使用具有不同蛋白质水平的原料。

[0257] 实施例3

[0258] 从盐水藻类生物质提取蛋白质

[0259] 将最初由盐水中约1-10%w/w固体组成的盐水藻类培养物加热至50℃并在该温度下保持1小时。将所得浆料离心以从固相分离液相。确定该液体提取物富含球蛋白(在原藻类生物质中存在的总蛋白的约10%)。

[0260] 然后将固体悬浮在淡水中并加热至约50℃且保持约1小时。将所得浆料再次离心以从固相分离液体。确定该液相富含白蛋白(在原藻类生物质中存在的总蛋白的约10%)。

[0261] 然后将固体悬浮在乙醇中以产生70%w/w混合物。将该混合物加热至约75℃并在该温度下保持约1小时。将所得浆料离心以从固相分离液体。确定该液相富含白蛋白(在原生物质中存在的总蛋白的约30%)。

[0262] 然后将固体悬浮在碱性溶液(NaOH水溶液，pH9)中并加热至约50℃且在该温度下保持约1小时。将所得浆料离心以从固相分离液体。确定该液相测定为富含谷蛋白(在原生物质中存在的总蛋白的约50%)。

[0263] 实施例4

[0264] 用乙醇分步分级分离和提取藻类生物质

[0265] 收获1000磅微拟球藻属生物质(从株系202.0培养，由Arizona StateUniversity,Laboratory for Algae Research and Biotechnology获得，ATCC保藏号PTA-11048)并脱水直至藻类构成约35%w/w，然后最终冷冻。

[0266] 提取步骤在具有铰链盖的400加仑套锅中进行。将盖用条带栓系并用硅酮密封。该系统还含有具有双叶片轴的2马力防爆电机的混合器。将冷冻的藻类材料倒入至罐中并使用气动回转泵泵入等量的乙醇。将材料搅拌15分钟并用蒸汽加热夹套以获得每个提取步骤的所需温度。所需温度为接近混合物的沸点，是指在混合物沸点的3％内，但不沸腾。每个提取步骤的这一所需温度是不同的，因为混合物的沸点随着乙醇比例的改变而改变。一旦达到所需温度，将系统保持在所需温度下持续地搅拌60分钟以确保锅内容物被均匀加热。

[0267] 然后，使用气动的Viking叶片泵以约1加仑/分钟将锅的内容物泵出提取容器并泵入Sharples滗析器离心机。将滗析器离心机转子转速设定为约6000rpm。将固体收集在封闭的塑料桶中且由约50%w/w的固体比液体组成。将这些固体返回锅中，重复上述提取步骤。将来自滗析器的液体流收集至进料罐中，然后供应至膜过滤系统。所使用的膜为由2
Graver Technologies制备的0.375ftSS膜。操作条件为60℃±5℃且平均压力梯度为
40psi。用压缩空气约每隔15分钟反冲洗膜系统以保持通量。从膜系统收集的渗透物不含任何颗粒物质。收集滞留物并再循环至滗析器。

[0268] 该提取和分级分离是由于在每次提取的工艺中溶剂极性的改变。在示于图13的提取中，该工艺始于约1000磅含有约65%纯水的湿藻类生物质(35%w/w藻类固体)。将其与860磅变性乙醇(95%乙醇和5%甲醇)混合，产生含有约55%乙醇水溶液的混合物。使用如上所述的滗析器分离固体和液体。湿固体部分重525磅且为40%干质量。将总计525磅的95%变性乙醇加入至该固体，产生由约85%乙醇水溶液组成的混合物。使用如上所述的滗析器分离固体和液体。固体部分重354.5磅且为40%干质量。将另外700磅的变性乙醇加入至该固体，产生约95%乙醇水溶液的混合物。使用如上所述的滗析器分离固体和液体。所得固体为约40%干质量。基于水和乙醇的潜在热计算，该生物质干燥需要的能量少60%。

[0269] 在一些实验中(数据未示出)，尝试了其它类型的变性乙醇。提取中使用含有95%乙醇与5%异丙醇的变性乙醇，但发现不及95%乙醇与5%甲醇有效。使用100%乙醇为本发明的优选实施方案，但是由于成本限制通常不可获得。

[0270] 使用内部装配式分批蒸馏器将来自膜系统的渗透物流蒸发。真空蒸馏期间操作条件为约80℃。将渗透物中的所有乙醇蒸发。将这些提取步骤重复三次，产生四种产物混合池，如图13所示。这是因为每个提取步骤中，极性随着向混合物加入水而改变，允许每个步骤提取不同的组分。产物1含有藻类蛋白质，并因此系统中保留的过量水在操作条件下不会被蒸发。产物2含有极性脂质。产物3含有中性脂质。最后，产物4为残留的生物质，含有潜在副产物诸如类胡萝卜素。

[0271] 实施例5

[0272] 用乙醇脱水和提取藻类生物质

[0273] 收获后，藻类生物质通常含有约0.1至0.5%(w/w)的固体。这可使用藻类产业中已知的任何方法脱水，包括但不限于膜过滤、离心、加热、沉降或浮选。絮凝可有助于浮选或沉降。此类方法的典型结果为含有约10%w/w固体的藻类浆料。为了进一步脱水，可使用又一种脱水方法来去除一些剩余的自由水以得到固体的浓度更接近40%w/w。然而，脱水的成本在进行第一脱水之后呈指数增加。本文公开的系统和方法的优点是，允许仅经历过一轮脱水的藻类团块的提取和分级分离。

[0274] 此类工艺的一个实例可为，在第一轮提取中，按照实施例3所述的方案，将含有90%纯水的1000磅湿生物质与1000磅变性乙醇(95%EtOH与5%MeOH)混合，产生约50%乙醇水溶液的溶剂混合物。所得生物质(350磅)是40%干燥的。这些湿固体的溶剂组成为
50%乙醇水溶液。在另外的350磅变性乙醇下，混合物的组成将为约81%乙醇水溶液。所得生物质(235磅)是40%干重的。这些湿固体的溶剂组成为81%乙醇水溶液。在另外470磅变性乙醇下，混合物的组成将为约95%乙醇水溶液。在95%乙醇下，所得固体将是40%干燥的。基于水和乙醇的潜热，该生物质干燥需要的能量少60%。在此情况下，100磅藻类将使用1820磅乙醇进行提取。与其中起始材料为40%藻类固体的实施例3比较，用2085磅乙醇提取350磅干藻类当量。

[0275] 参考文献

[0276] 以下参考文献通过引用整体并入本文：

[0277] 美国专利7,148,366

[0278] Rhodes,Science Progress,92(1):39–90,2009.Generic review on using algae to produce biodieselChisti,Y.(2007).Biodiesel from microalgae.Biotechnol Adv 25,294-306.-Generic review on using algae to produce biodiesel

[0279] Amin,Energy Convers.Manage.,50:1834–1840,2009.Generic review on using algae to produce biofuel and gas

[0280] Catchpole et al.,J.of Supercritical Fluids,47:591–597,2009.SCF CO2 based extraction of specialty lipids

[0281] Bligh E G & Dyer W J.“A rapid method of total lipid extraction and purification.”Can.J.Biochem.Physiol.37:911-917,1959.

[0282] Chris tie,W. W.,Li pid An alysis ,3rd e d.,Oi lyPress,Bridgewater,UK,2003,416.

[0283] Approved Methods of the AACC,9th ed.,AmericanAssociation ofCerealChemists.St.Paul,MN,1995 AACC Method 58-19.

[0284] Snyder,L.R.“Classification of the Solvent Properties of Common Liquids”Journal of Chromatography,92(2):223-230(May 1974)