本发明公开了一种基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法，属于分子育种技术领域。本发明采用分子辅助选择的方法鉴定鸡显性白羽位点的基因型，可以快速判定出该位点的基因型，生产基因型为ii的青胫隐性白羽鸡品系，能避免测交选育的繁琐，缩短世代间隔，加快育种进程，从而降低培育成本。采用本发明方法培育的青胫隐性白羽鸡品系其肉质细嫩，肉味鲜美，生产性能高，既可以作为商品鸡直接投入生产，还可以与青胫黄麻羽鸡进行配套应用。
1.一种基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)利用青胫隐性白羽鸡作为父本，白来航鸡作为母本进行杂交，生产出F1代；
(2)F1代自交得到F2代，选留F2代青胫白羽公母鸡；
(3)利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法测定F2代青胫白羽公母鸡的基因型，选留显性白羽位点为ii基因型的个体，淘汰显性白羽位点为II和Ii基因型的个体，得到显性白羽位点为ii基因型的青胫白羽公母鸡；
(4)取显性白羽位点为ii基因型的青胫白羽公母鸡自交，利用步骤(3)的方法测定自交后代的基因型，重复上述步骤至稳定遗传，得到显性白羽位点为ii基因型的青胫隐性白羽鸡品系；
所述步骤(3)中利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法，包括以下步骤：以包含PMEL17基因的待测鸡全基因组DNA为模板，以引物对P为引物PCR扩增PMEL17基因第十外显子，得到扩增片段；对扩增片段进行PvuⅡ酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡显性白羽位点的基因型；
上游引物P-F：5’-AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3’，下游引物P-R：5’-GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’。
2.根据权利要求1所述的基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法，其特征在于：所述步骤(1)中青胫隐性白羽鸡为青胫黄麻羽地方鸡突变后的青胫白羽鸡。
3.根据权利要求1所述的基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法，其特征在于：所述的PCR扩增反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 6.25μL，ddH2O4.25μL，P-F0.5μL，P-R 0.5μL，DNA模板1.0μL。
4.根据权利要求1所述的基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法，其特征在于：所述的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
5.根据权利要求1所述的基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法，其特征在于：所述的PvuⅡ酶切反应体系为：扩增片段10μL，Buffer 1.5μL，PvuⅡ0.3μL，ddH2O 3.2μL；PvuⅡ酶切反应条件为：37℃，酶切过夜。
6.根据权利要求1所述的基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法，其特征在于：所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为2％；琼脂糖凝胶电泳的电压为120V，电泳时间为
7.根据权利要求1所述的基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法，其特征在于：所述的鉴定鸡显性白羽位点基因型的方法为：II基因型表现为160bp条带；Ii基因型表现为124bp和160bp条带；ii基因型表现为124bp。
8.根据权利要求1所述的基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法，其特征在于：将步骤(4)得到的显性白羽位点为ii基因型的青胫隐性白羽鸡品系与青胫黄麻羽鸡品种杂交配套，生产出有色羽肉鸡。
9.根据权利要求8所述的基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法，其特征在于：所述的青胫黄麻羽鸡品种为固始鸡、边鸡、淮北麻鸡、淮南麻黄鸡、五华鸡、崇仁麻鸡、琅琊鸡、卢氏鸡、桃源鸡、瑶鸡或茶花鸡。
一种基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法
技术领域
[0001] 本发明具体涉及一种基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法，属于分子育种技术领域。
背景技术
[0002] 随着生活水平的提高，人们的消费观念从过去的数量型转变为质量型。人们对鸡肉肉质的要求也越来越高。我国的地方鸡具有肉质好的特点，但是其生长速度较慢，饲料转化率低。而国外的快大型肉鸡虽生长速度快、饲料转化率高，其肉质较差。为解决这一问题，将国外快大型肉鸡与国内地方优质肉鸡进行杂交，既能够改善国外快大型肉鸡的肉质也能加快地方优质肉鸡的生长速度和生产性能。但是，由于我国人民长期的饮食习惯的影响，中国消费者偏爱黄麻羽、黑羽等有色羽的鸡，尤其是南方城市不接受快速生长的白羽鸡。为了使杂交后鸡的表型符合中国消费者的需求，就需要纯合的隐性白羽鸡，隐性白羽鸡生产性能高，且与我国有色羽杂交后能保持有色羽的羽色，对于我国优质鸡的育种上具有重大的意义。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法。
[0004] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0005] 一种基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法，包括以下步骤：
[0006] （1）利用青胫隐性白羽鸡作为父本，白来航鸡作为母本进行杂交，生产出F1代；
[0007] （2）F1代自交得到F2代，选留F2代青胫白羽公母鸡；
[0008] （3）利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法测定F2代青胫白羽公母鸡的基因型，选留显性白羽位点为ii基因型的个体，淘汰显性白羽位点为II和Ii基因型的个体，得到显性白羽位点为ii基因型的青胫白羽公母鸡；
[0009] （4）取显性白羽位点为ii基因型的青胫白羽公母鸡自交，利用步骤（3）的方法测定自交后代的基因型，重复上述步骤至稳定遗传，得到显性白羽位点为ii基因型的青胫隐性白羽鸡品系。
[0010] 所述步骤（1）中青胫隐性白羽鸡为青胫黄麻羽地方鸡突变后的青胫白羽鸡，经人工引入PvuII的RFLP-PCR方法测定显性白羽位点为ii基因型。
[0011] 所述步骤（3）中利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法，包括以下步骤：以包含PMEL17基因的待测鸡全基因组DNA为模板，以引物对P为引物PCR扩增PMEL17基因第十外显子，得到扩增片段；对扩增片段进行PvuⅡ酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡显性白羽位点的基因型；
[0012] 所述的引物对P为：
[0013] 上游引物P-F：5’-AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3’（如SEQ ID No.1所示），[0014] 下游引物P-R：5’-GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’（如SEQ ID No.2所示）。
[0015] 所述的鸡全基因组DNA采用苯酚-氯仿粗提法或蛋白酶K法提取。
[0016] 所述的PCR扩增反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 6.25μL，ddH2O 4.25μL，P-F 0.5μL，P-R 0.5μL，DNA模板1.0μL。
[0017] 所述的2×Taq PCR MasterMix含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、氯化镁和PCR反应缓冲液，为市售商品，可购自上海生工、大连宝生物、北京百泰克、北京康为等公司。
[0018] 所述的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
[0019] 所述的PvuⅡ酶切反应体系为：扩增片段10μL，Buffer 1.5μL，PvuⅡ 0.3μL，ddH2O 3.2μL。
[0020] 所述的PvuⅡ酶切反应条件为：37℃，酶切过夜。
[0021] 所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为2%。
[0022] 所述的琼脂糖凝胶电泳的电压为120V，电泳时间为60min。
[0023] 所述的鉴定鸡显性白羽位点基因型的方法为：II基因型表现为160bp条带；Ii基因型表现为124bp和160bp条带；ii基因型表现为124bp。
[0024] 优选的，将步骤（4）得到的显性白羽位点为ii基因型的青胫隐性白羽鸡品系与青胫黄麻羽鸡品种杂交配套，生产出有色羽肉鸡。
[0025] 所述的青胫黄麻羽鸡品种为固始鸡、边鸡、淮北麻鸡、淮南麻黄鸡、五华鸡、崇仁麻鸡、琅琊鸡、卢氏鸡、桃源鸡、瑶鸡、茶花鸡等。
[0026] 本发明的有益效果：
[0027] 本发明采用分子辅助选择的方法鉴定鸡显性白羽位点的基因型，可以快速判定出该位点的基因型，生产基因型为ii的青胫隐性白羽鸡品系，能避免测交选育的繁琐，缩短世代间隔，加快育种进程，从而降低培育成本。
[0028] 本发明针对显性白羽野生纯合子个体在PMEL17基因第10外显子存在的一个9bp插入这一特征，设计上游引物引入PvuⅡ酶切位点，是否存在插入序列与是否存在酶切位点之间是相互对应的关系。其中，引物对P是针对不含9bp插入的PMEL17基因的核苷酸序列进行设计的，引入PvuⅡ酶切位点后，PCR扩增产物能够被PvuⅡ切为124bp和27bp（27bp太短电泳时不显示）的片段（如SEQ ID No.3所示）；含9bp插入的基因序列在扩增后不存在PvuⅡ这一酶切位点，因此其PCR产物酶切后片段为160bp（如SEQ ID No.4所示）。
[0029] 采用本发明方法培育的青胫隐性白羽鸡品系其肉质细嫩，肉味鲜美，生产性能高，既可以作为商品鸡直接投入生产，还可以与青胫黄麻羽鸡进行配套应用。
附图说明
[0030] 图1为本发明实施例1中各样本在鸡显性白羽位点的酶切电泳图，
[0031] 注：编号说明如下：5，8，9为II基因型，3，6，7为Ii基因型；1，2，4为ii基因型，M为marker。
具体实施方式
[0032] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0033] 实施例1
[0034] 本实施例中基于分子辅助选择的青胫隐性白羽鸡品系的培育方法，包括以下步骤：
[0035] （1）利用固始鸡群体中青胫隐性白羽鸡作父本，白来航鸡作母本进行杂交，生产出F1代；
[0036] （2）F1代自交得到F2代，选留F2代青胫白羽公母鸡；
[0037] （3）利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法测定F2代青胫白羽公母鸡的基因型，具体包括以下步骤：
[0038] ①样品的采集
[0039] 对F2代选留的青胫白羽鸡翅静脉采血，加1/3抗凝剂，用蛋白酶K法提取血液DNA，将DNA样品保存于4℃冰箱保存备用；
[0040] ②引物设计
[0041] 以PMEL17基因序列（GenBank Accession No.AY636129）为模板设计引物对P，如下所示：
[0042] 上游引物P-F：5’-AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3’，
[0043] 下游引物P-R：5’-GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’；
[0044] ③PCR扩增
[0045] 以引物对P为引物，建立12.5μL扩增体系：2×Taq PCR MasterMix（购自北京百泰克公司）6.25μL，ddH2O 4.25μL，P-F 0.5μL，P-R 0.5μL，DNA模板1.0μL；
[0046] 反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
[0047] ④PCR扩增产物的酶切
[0048] 15μL的PvuⅡ酶切体系：扩增片段10μL，Buffer 1.5μL，PvuⅡ 0.3μL，ddH2O3.2μL；酶切反应条件：37℃，酶切过夜；
[0049] ⑤PCR扩增产物酶切后的检测与结果判定
[0050] 取8μL PCR扩增后的酶切产物，2%的琼脂糖凝胶电泳（电泳电压：120V；电泳时间：60min）点样，电泳结束后采用凝胶成像系统检测，电泳图谱参见图1；
[0051] 根据电泳图谱中出现的条带大小进行判定：当出现160bp的片段，则为显性白羽纯合子（II基因型，表型为白羽）；当出现124bp的片段，则为野生型纯合子（ii基因型，表型为有色羽或隐性白羽）；当出现160bp、124bp的片段，则为显性白羽杂合子（Ii基因型，表型为白羽）；
[0052] （4）根据基因型判定结果，选留显性白羽位点为ii基因型的个体，淘汰显性白羽位点为II和Ii基因型的个体，得到显性白羽位点为ii基因型的公母鸡；
[0053] （5）取显性白羽位点为ii基因型的青胫白羽公母鸡自交，利用步骤（3）的方法测定自交后代的基因型，重复上述步骤至稳定遗传，得到显性白羽位点为ii基因型的青胫隐性白羽鸡品系；
[0054] （6）将步骤（5）得到的显性白羽位点为ii基因型的青胫隐性白羽鸡品系作为父本与青胫黄麻羽鸡品种杂交配套，生产出有色羽肉鸡。
