神经网络修复系统及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种神经网络修复系统及其制备方法。该神经网络修复系统包括缓释膜、吸附于所述缓释膜上的光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系及分散于所述缓释膜中的带正电的导电聚合物，其中，所述缓释膜为聚丙烯酸和聚乙烯醇交联形成的水凝胶膜。将该神经网络修复系统用于治疗受损神经网络时，光敏星型胶质细胞能够在光照刺激下特异性增加ATP释放，带负电的ATP被带正电的导电聚合物吸引而沉积在缓释膜的表面上，通过扩散作用实现ATP的缓释，克服了常规药物治疗的一过性释放的缺陷，能够较好地促进干细胞的增殖和神经元的定向分化，有效地修复受损神经网络。

权利要求

1.一种神经网络修复系统，其特征在于，包括缓释膜、吸附于所述缓释膜上的光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系及分散于所述缓释膜中的带正电的导电聚合物，其中，所述缓释膜为聚丙烯酸和聚乙烯醇交联形成的水凝胶膜；

所述光敏星型胶质细胞为携带有光敏基因的动物海马星型胶质细胞或携带有光敏基因的纹状体星型胶质细胞，光敏基因为ChR2。

2.根据权利要求1所述的神经网络修复系统，其特征在于，还包括分散于所述缓释膜上的生物活性物质和三磷酸腺苷。

3.根据权利要求1所述的神经网络修复系统，其特征在于，还包括神经假体，所述缓释膜设置于所述神经假体的表面上。

4.根据权利要求3所述的神经网络修复系统，其特征在于，所述神经假体为植入式神经电极、植入式神经支架或植入式神经导管。

5.根据权利要求1所述的神经网络修复系统，其特征在于，所述光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系中，光敏星型胶质细胞和干细胞的数量比为1:1。

6.一种神经网络修复系统的制备方法，包括如下步骤：

构建光敏星型胶质细胞；

构建光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系；

制备缓释膜，所述缓释膜为聚丙烯酸和聚乙烯醇交联形成的水凝胶薄膜；

将导电聚合物分散于所述缓释膜中；及

将所述光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系接种于所述缓释膜上，使所述光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系吸附于所述缓释膜上，得到所述神经网络修复系统；

所述构建光敏星型胶质细胞的步骤为：将携带有光敏基因的病毒感染星型胶质细胞，得到光敏星型胶质细胞；星型胶质细胞为动物海马星型胶质细胞或纹状体星型胶质细胞，光敏基因为ChR2；

所述将导电聚合物分散于所述缓释膜中的步骤为：将所述缓释膜放入含有导电聚合物单体的电沉积溶液中充分溶胀后，在恒定电压作用下，导电聚合物单体聚合成导电聚合物，并分散于所述缓释膜中；导电聚合物单体为吡咯、3,4-乙撑二氧噻吩、噻吩及苯乙烯磺酸钠中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的神经网络修复系统的制备方法，其特征在于，所述携带有光敏基因的病毒的制备方法具体为：用脂质体转染含有光敏基因、绿色荧光标记基因及用于特定性标记胶质细胞的启动子GFAP的融合质粒和病毒包装相关的混合质粒pCMVΔR8.74和pMD2.G.至293FT细胞，然后将所述293FT细胞传代培养后，破碎细胞膜、过柱，取上清液，得到含有携带光敏基因的病毒的细胞液。

8.根据权利要求6所述的神经网络修复系统的制备方法，其特征在于，所述构建光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系的步骤为：将所述光敏星型胶质细胞和干细胞共同接种于细胞培养液中，于37℃下孵育24小时。

9.根据权利要求6所述的神经网络修复系统的制备方法，其特征在于，所述制备缓释膜的步骤为：将丙烯酸溶于聚乙烯醇的水溶液中，丙烯酸现场聚合生成聚丙烯酸，聚丙烯酸和聚乙烯醇交联形成水凝胶薄膜。

10.根据权利要求6所述的神经网络修复系统的制备方法，其特征在于，所述构建光敏星型胶质细胞后，构建光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系之前，还包括检测所述光敏星型胶质细胞兴奋性和检测所述光敏星型胶质细胞的细胞膜完整性的步骤。

11.根据权利要求10所述的神经网络修复系统的制备方法，其特征在于，所述检测所述光敏星型胶质细胞兴奋性步骤为采用激光刺激系统对所述光敏星型胶质细胞进行点刺激，并测定所述光敏星型胶质细胞由光所诱发的内向光电流；所述检测所述光敏星型胶质细胞的细胞膜完整性的步骤为采用ATP浓度的荧光素酶检测试剂盒检测光刺激光敏胶质细胞释放的ATP浓度，同时检测细胞外液中乳酸脱氢酶的活力度。

说明书

神经网络修复系统及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及干细胞调控技术领域，特别是涉及一种神经网络修复系统及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 干细胞替代疗法在受损神经网络修复中已得到越来越多人的关注。因此，促进干细胞在生物体内的增殖和定向分化一直是干细胞研究领域的重中之重。三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate,ATP）是一种核苷酸，作为细胞内能量传递的“分子通货”，储存和传递化学能。ATP作为一种重要的神经胶质分子，参与对中枢神经系统其他细胞如神经元、神经干细胞等的调控作用。已有大量报道证实，ATP参与调节干细胞（如神经干细胞）的增殖、迁移和分化功能，进而促进受损神经网络的修复作用。

[0003] 然而，ATP在胞外能被腺苷酶迅速降解为腺苷（adenosine），而腺苷可以刺激中枢神经系统中的小胶质细胞（microglia）的增殖从而影响ATP在调控干细胞发挥神经网络修复中的作用。生物体在正常生理条件下自身释放的ATP难以满足ATP调控干细胞从而发挥受损神经网络修复的作用的需求。因此，刺激细胞释放更多的ATP以补充被腺苷酶迅速降解的ATP对受损神经网络的修复有促进作用。

[0004] 迄今为止，促进细胞释放ATP以实现对受损神经网络修复的方法主要通过电刺激或药物来实现。用电刺激或药物的方法在生物体内缺乏细胞特异性及时间可控性，因为无论是电刺激还是药物作用往往都是一过性释放，疗效较差。

发明内容

[0005] 基于此，有必要提供一种能够缓释ATP的神经网络修复系统。

[0006] 进一步，提供一种神经网络修复系统的制备方法。

[0007] 进一步，还提供上述神经网络修复系统的应用。

[0008] 一种神经网络修复系统，包括缓释膜、吸附于所述缓释膜上的光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系及分散于所述缓释膜中的带正电的导电聚合物，其中，所述缓释膜为聚丙烯酸和聚乙烯醇交联形成的水凝胶膜。

[0009] 在其中一个实施例中，还包括分散于所述缓释膜上的生物活性物质和三磷酸腺苷。

[0010] 在其中一个实施例中，还包括神经假体，所述缓释膜设置于所述神经假体的表面上。

[0011] 在其中一个实施例中，所述神经假体为植入式神经电极、植入式神经支架或植入式神经导管。

[0012] 在其中一个实施例中，所述光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系中，光敏星型胶质细胞和干细胞的数量比为1:1。

[0013] 在其中一个实施例中，所述光敏星型胶质细胞为携带有光敏基因的动物海马星型胶质细胞或携带有光敏基因的纹状体星型胶质细胞。

[0014] 一种神经网络修复系统的制备方法，包括如下步骤：

[0015] 构建光敏星型胶质细胞；

[0016] 构建光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系；

[0017] 制备缓释膜，所述缓释膜为聚丙烯酸和聚乙烯醇交联形成的水凝胶薄膜；

[0018] 将导电聚合物分散于所述缓释膜中；及

[0019] 将所述光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系接种于所述缓释膜上，使所述光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系吸附于所述缓释膜上，得到所述神经网络修复系统。

[0020] 在其中一个实施例中，所述构建光敏星型胶质细胞的步骤为：将携带有光敏基因的病毒感染星型胶质细胞，得到光敏星型胶质细胞。

[0021] 在其中一个实施例中，所述携带有光敏基因的病毒的制备方法具体为：用脂质体转染含有光敏基因、绿色荧光标记基因及用于特定性标记胶质细胞的启动子GFAP的融合质粒和病毒包装相关的混合质粒pCMVΔR8.74和pMD2.G.至293FT细胞，然后将所述293FT细胞传代培养后，破碎细胞膜、过柱，取上清液，得到含有携带光敏基因的病毒的细胞液。

[0022] 在其中一个实施例中，所述构建光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系的步骤为：将所述光敏星型胶质细胞和干细胞共同接种于细胞培养液中，于37℃下孵育24小时。

[0023] 在其中一个实施例中，所述制备缓释膜的步骤为：将丙烯酸溶于聚乙烯醇的水溶液中，丙烯酸现场聚合生成聚丙烯酸，聚丙烯酸和聚乙烯醇交联形成水凝胶薄膜。

[0024] 在其中一个实施例中，所述将导电聚合物分散于所述缓释膜中的步骤为：将所述缓释膜放入含有导电聚合物单体的电沉积溶液中充分溶胀后，在恒定电压作用下，导电聚合物单体聚合成导电聚合物，并分散于所述缓释膜中。

[0025] 在其中一个实施例中，所述构建光敏星型胶质细胞后，构建光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系之前，还包括检测所述光敏星型胶质细胞兴奋性和检测所述光敏星型胶质细胞的细胞膜完整性的步骤。

[0026] 在其中一个实施例中，所述检测所述光敏星型胶质细胞兴奋性步骤为采用激光刺激系统对所述光敏星型胶质细胞进行点刺激，并测定所述光敏星型胶质细胞由光所诱发的内向光电流；所述检测所述光敏星型胶质细胞的细胞膜完整性的步骤为采用ATP浓度的荧光素酶检测试剂盒检测光刺激光敏胶质细胞释放的ATP浓度，同时检测细胞外液中乳酸脱氢酶的活力度。

[0027] 一种上述神经网络修复系统在治疗帕金森症、癫痫、运动神经障碍、中风或抑郁症中的应用。

[0028] 上述神经网络修复系统的光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系吸附于缓释膜中，光敏星型胶质细胞能够在光照刺激下特异性增加ATP释放，带负电的ATP被带正电的导电聚合物吸引而沉积在所述缓释膜的表面上，通过扩散作用实现ATP的缓释，克服了常规药物治疗的一过性释放的缺陷，能够较好地促进干细胞的增殖和神经元的定向分化，有效地修复受损神经网络。

附图说明

[0029] 图1为一实施方式的神经网络修复系统的制备方法的流程图；

[0030] 图2为含有光敏基因、绿色荧光标记基因及用于特定性标记胶质细胞的启动子GFAP的融合质粒的结构示意图；

[0031] 图3为实施例1的光敏星型胶质细胞和未转染的星型胶质细胞的显微镜图；

[0032] 图4（a）为通过电压钳方式记录到的光诱发的实施例1的光敏星型胶质细胞的内向光电流；

[0033] 图4（b）为图4（a）所示的光电流的统计学结果；

[0034] 图4（c）为光刺激实施例1的光敏星型胶质细胞1小时后，所述诱发的内向光电流；

[0035] 图5（a）～图5（c）为实施例1的光敏星型胶质细胞的释放ATP检测图；

[0036] 图6为光刺激后，实施例1的光敏星型胶质的细胞外液中的LDH的活力度检测图；

[0037] 图7为测试光敏星型胶质细胞对干细胞功能的影响的检测方法的示意图；

[0038] 图8（a）～图8（b）为实施例1的光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系的mRNA表达分析的检测图；

[0039] 图8（c）～图8（d）为实施例1的光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系中EdU掺入DNA示意图；

[0040] 图9（a）～图9（b）为采用大鼠大脑中动脉线拴脑卒中模型，缺陷48小时后，用实施例1的神经网络修复系统治疗后进行Tuj1免疫组染色实验的实验结果图。

具体实施方式

[0041] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

[0042] 一实施方式的神经网络修复系统，包括缓释膜、吸附于缓释膜上的光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系及分散于缓释膜中的带正电的导电聚合物。

[0043] 缓释膜为聚丙烯酸和聚乙烯醇交联形成的水凝胶膜。

[0044] 这种水凝胶膜具有较好的生物相容性、较高的离子导通能力、较强的机械强度、较高的稳定性以及较为合适的溶胀率。因此，这种水凝胶膜对人体的安全性较高，并且能够较好吸附生物活性物质和ATP。

[0045] 优选地，丙烯酸和聚乙烯醇重复链段的摩尔比为1:1。

[0046] 光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系包含光敏星型胶质细胞和干细胞。

[0047] 星型胶质细胞是中枢神经系统中一类重要的细胞类型，能够调控神经干细胞的活动。改变星型胶质细胞的兴奋性，可以引起其释放神经胶质分子或神经营养因子，这些神经胶质分子或神经营养因子进而影响干细胞的功能。星型胶质细胞在兴奋或静息状态下能够将ATP释放到细胞外基质中。

[0048] 光敏星型胶质细胞是指携带光敏基因的星型胶质细胞。优选为携带光敏基因的动物海马星型胶质细胞或携带了光敏基因的纹状体星型胶质细胞。

[0049] 光敏基因是指可以编码光敏感型阳离子通道蛋白的基因，如从绿藻中克隆出来的channelrhodopsin-2基因，简称为ChR2。

[0050] 进行光刺激能够可以在特定细胞亚群水平上控制光敏星型胶质细胞的活性，使得光敏星型胶质细胞释放ATP具有细胞特异性和时间上毫秒水平上的精确性。

[0051] 干细胞优选为神经干细胞或间充质干细胞。

[0052] 优选地，光敏星型胶质细胞和干细胞的数量比为1:1，以保证光敏星型胶质细胞释放的ATP能够很好地调控干细胞的活动，进而促进神经元分化。

[0053] 光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系接种于缓释膜上，使光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系吸附于缓释膜上。光敏星型胶质细胞在光照刺激下缓释ATP，ATP促进干细胞往神经元方向分化，有利于修复受损神经网络。

[0054] 带正电的导电聚合物为聚吡咯、聚3,4-乙撑二氧噻吩、聚噻吩及聚苯乙烯磺酸钠中的至少一种。

[0055] 带正电的导电聚合物均匀分散于缓释膜中，并与聚丙烯酸和聚乙烯醇组成网际互穿高分子聚合物。

[0056] 由于ATP带有负电，因此光敏星型胶质细胞特异性释放的ATP可以与带正电的导电聚合物共沉积在缓释膜上，然后通过扩散进行缓释，实现ATP的缓释，从而提高ATP对周围干细胞功能的调控。

[0057] 使用上述神经网络修复系统修复受损神经网络时，将该神经网络修复系统植入病灶区，48小时后，在移植区垂直插入直径为200微米的光纤，进行470纳米的蓝光刺激或593纳米的黄光刺激，持续30min，同时在光刺激的区域和光纤成18度角，中间间隔1.8mm，植入Y型微透析管，该微透析管一端通过塑料导管连接至微量注射器，灌注人工脑脊液（mmol/L:NaCl124、KCl3、CaCl22.4、MgSO41.3、葡萄糖10和羟乙基哌嗪乙硫磺酸10；pH=7.3，灌流速度2L/min），另一端通过同样的塑料导管将析出液收集到置于冰浴中的1.5mL的安培管里。

[0058] 使用上述神经网络修复系统治疗受损神经网络，在光照刺激下，光敏型胶质细胞特异性释放ATP，所释放的ATP沉积于缓释膜表面上，通过扩散缓慢释放，从而实现ATP的缓释，提高ATP对周围干细胞的调控，提高对受损神经网络的修复作用。这种神经网络修复系统能够在细胞亚群水平上控制细胞活性，促使光敏星型胶质细胞释放较多的ATP，光敏星型胶质细胞释放ATP具有空间上的细胞特异性和时间上毫秒水平上的精确性，并且，光敏星型胶质细胞释放的ATP能够通过缓释膜进行缓释，克服了常规药物治疗的一过性释放的缺陷，能够较好地促进干细胞的增殖和神经元的定向分化，有效地修复受损神经网络。

[0059] 优选地，上述神经网络修复系统还包括分散于缓释膜上生物活性物质和三磷酸腺苷（ATP）。

[0060] 生物活性物质为神经营养物质、神经生长因子、血管生长因子、多肽及蛋白质分子中的至少一种。

[0061] 生物活性物质可以促进血管和神经生长，进一步有利于对受损神经网络的修复。

[0062] 分散于缓释膜上的ATP作为光敏胶质细胞释放的ATP的补充，以通过缓释膜的缓控释放更多的ATP，以使ATP更多地参与调节神经干细胞的增殖、迁移和分化，进而促进对受损神经网络的修复作用。

[0063] 优选地，上述神经网络修复系统还包括神经假体。缓释膜设置于神经假体的表面上。

[0064] 神经假体为植入式神经电极、植入式神经支架或植入式神经导管。

[0065] 上述神经网络修复系统包括神经假体，使得该神经网络修复系统的ATP缓释对干细胞的调控结合植入式神经电刺激疗法的作用，更好地受损调控神经网络。

[0066] 并且，由于上述缓释膜具有较好的生物相容性高和稳定性高的特性，将其设置于神经假体表面上，用于修饰神经假体的界面，可以在神经假体的界面上形成生物相容高且长期稳定的高分子聚合物层，不仅可以提高神经假体的生物相容性，并且长时间使用后，该神经假体的性能仍能得到较好的保持，可以满足长期植入人体的需求。因此，上述神经网络修复系统能够较好地综合ATP的缓释和植入式神经电刺激疗法的协调作用，提高疗效。

[0067] 基于上述神经网络修复系统的优点，能够广泛应用于治疗帕金森症、癫痫、运动神经障碍、中风、抑郁症等疾病中。

[0068] 请参阅图1，一实施方式的神经网络修复系统的制备方法，包括如下步骤S110～步骤S150。

[0069] 步骤S110：构建光敏星型胶质细胞。

[0070] 光敏星型胶质细胞由星型胶质细胞、光敏基因及携带光敏基因的病毒载体共同构建而成。

[0071] 星型胶质细胞优选为动物海马星型胶质细胞或纹状体星型胶质细胞。

[0072] 光敏基因优选为ChR2。病毒载体可以慢病毒或腺病毒。

[0073] 用脂质体转染含有光敏基因、绿色荧光标记基因及用于特定性标记胶质细胞的启动子GFAP的融合质粒及与慢病毒包装相关的混合质粒pCMVΔR8.74和pMD2.G.至293FT细胞，每200,000个293FT细胞用6L脂质体。

[0074] 其中，含有光敏基因、绿色荧光标记基因及用于特定性标记胶质细胞的启动子GFAP的融合质粒的结构如图2所示。

[0075] 将该转染后的293FT细胞传代至25代后即需要更换新的一批细胞株。转染24小时后，将培养293FT细胞的培养液换成无血清含有5mM丙酮酸钠的DMEM培养液后继续孵育16小时。

[0076] 然后，用超速离心机对上述293FT细胞进行破膜得到细胞悬液，将该细胞悬液通过20%的蔗糖滤柱，收集上清，得到含有携带光敏基因的病毒的细胞液。该病毒滴度能达8
3×10TU/mL以上，用灭菌的磷酸盐缓冲液重悬含有携带光敏基因的病毒的细胞液得到重悬液，其中含有携带光敏基因的病毒的细胞液与磷酸盐缓冲液的体积比为1:1000。

[0077] 将上述重悬液加入无血清DMEM培养液中，用于感染星型胶质细胞。其中，重悬液和无血清DMEM培养液的体积比为1:400。

[0078] 为了检测是否感染成功，感染6小时后，将感染后的细胞液接种于新鲜含有10%胎牛血清的DMEM，于37℃继续培养48小时～72小时；放到显微镜下观察，如果80%左右的细胞表达绿色荧光的标记蛋白，可初步证实转染成功。

[0079] 优选地，为了确保能够发挥光敏星型胶质细胞在空间上具有细胞特异性和在时间上具有毫米水平上准确性地释放ATP，在后续步骤之前，还包括检测光敏星型胶质细胞兴奋性和检测光敏星型胶质细胞的细胞膜完整性的步骤。

[0080] 检测光敏星型胶质细胞兴奋性的方法是以膜片钳技术结合光刺激的方式对光敏星型胶质细胞中光敏通道蛋白的功能性表达进行验证。采用一套激光刺激系统对上述光敏星型胶质细胞进行点刺激的模式，这种系统在此刺激模式下，每个点的扫描速度达10ms，光强到1.1mW左右；光刺激的相关参数为：10Hz，50ms；以电压钳的形式记录相关由光所诱发的内向光电流，以确认光敏型胶质细胞被光特异性地改变了兴奋性。

[0081] 检测光敏星型胶质细胞的细胞膜完整性的方法是以10Hz、50ms的刺激模式对上述光敏星型胶质细胞进行随机模式的光刺激，刺激时长分别为30min、60min和120min；收集每个时间节点的细胞培养液200L左右并置于-80℃储存。采用市售ATP浓度的荧光素酶检测试剂盒，检测光刺激光敏胶质细胞释放的ATP浓度，同时检测细胞外液中乳酸脱氢酶（LDH）的活力度，以确认细胞膜的完整性。

[0082] 步骤S120：构建光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系。

[0083] 干细胞优选为神经干细胞或间充质干细胞。。

[0084] 将步骤S110构建得到的光敏星型胶质细胞和干细胞共同接种于细胞培养液中，于37℃下孵育24小时。

[0085] 优选地，将光敏星型胶质细胞和干细胞共同接种于6-孔板内，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液、于37℃下孵育24小时。

[0086] 优选地，光敏星型胶质细胞和干细胞的接种密度为3×105细胞/孔，其中，光敏星型胶质细胞和干细胞的个数比为1:1。

[0087] 步骤S130：制备缓释膜，缓释膜为聚丙烯酸和聚乙烯醇交联形成的水凝胶薄膜。

[0088] 将丙烯酸溶于聚乙烯醇的水溶液中，丙烯酸现场聚合生成聚丙烯酸，聚丙烯酸和聚乙烯醇交联形成水凝胶薄膜。

[0089] 优选地，当所制备的神经网络修复系统还包括神经假体时，还包括将该水凝胶薄膜涂覆于神经假体表面上，并充分干燥，形成均一的薄膜。

[0090] 步骤S140：将导电聚合物分散于缓释膜中。

[0091] 配制含有导电聚合物单体的电沉积溶液。优选地，导电聚合物单体为吡咯、3,4-乙撑二氧噻吩、噻吩及苯乙烯磺酸钠中的至少一种。

[0092] 优选地，吡咯的含量为0.01摩尔/升、3,4-乙撑二氧噻吩的含量为0.01摩尔/升、噻吩的含量为0.01摩尔/升、苯乙烯磺酸钠的含量为0.1摩尔/升。

[0093] 将缓释膜浸泡于含有导电聚合物单体的电沉积溶液中，使缓释膜充分溶胀，导电聚合物单体在该溶胀后的缓释膜中均匀分布。在恒定电压的作用下，导电聚合物单体聚合生成导电聚合物，并与聚丙烯酸和聚乙烯醇组成网际互穿高分子聚合物。

[0094] 当前一个步骤还将水凝胶膜涂覆于神经假体表面上时，将涂覆了水凝胶膜的神经假体浸泡于含有导电聚合物单体中。

[0095] 优选地，电沉积液还含有生物活性物质和ATP。

[0096] 生物活性物质优选为神经营养物质、神经生长因子、血管生长因子、多肽及蛋白质分子中的至少一种。

[0097] 当生物活性物质只有一种时，生物活性物质的含量为10毫克/L。当生物活性物质为两种或两种以上时，各种物质的含量分别为10毫克/L。

[0098] ATP的含量优选为70纳摩尔/L，该浓度下ATP饱和。

[0099] 在恒定电压作用下，生物活性物质和ATP均匀分散于缓释膜表面。

[0100] 步骤S150：将光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系接种于缓释膜上，使光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系吸附于缓释膜上，得到神经网络修复系统。

[0101] 将光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系悬浮于细胞培养液中，接种于缓释膜5
上。优选地，光敏星型胶质细胞和干细胞的总细胞个数为4×10个，光敏星型胶质细胞和干细胞的数量比为1:1。细胞培养液优选为DMEM。

[0102] 优选地，将总细胞个数为4×105个为光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系悬浮于5微升DMEM中再接种于缓释膜上，使光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系吸附于缓释膜上。

[0103] 上述神经网络修复系统的制备方法通过将光敏基因引入星型胶质细胞中，以便能够精确地特异性调控光敏星型胶质细胞释放ATP，并且将光敏星型胶质细胞与干细胞共培养体系引入缓释膜中，制备得到能够缓释ATP从而能够较好地修复受损神经网络的神经网络修复系统。

[0104] 以下通过具体实施例进一步阐述。

[0105] 实施例1

[0106] 制备神经网络修复系统

[0107] （1）构建光敏星型胶质细胞

[0108] 将人源化GFAP-ChR2密码子(由Stanford大学Karl Deisseroth教授的实验室获得)通过HindIII/BamHI酶切位点融入到开放型框架质粒pCS2-eYFP(Clotech公司购得)的N末端。构建成功后的质粒通过Qiagen公司的maxiprep试剂盒纯化扩增，得到含有光敏基因、绿色荧光标记基因及用于特定性标记胶质细胞的启动子GFAP的融合质粒。PCR扩增的正向引物序列为SEQ ID No.1所示的序列，反向引物序列为SEQ ID No.2所示的序列，GFAP的来源是人。

[0109] 用脂质体转染0.5μg含有光敏基因、绿色荧光标记基因及用于特定性标记胶质细胞的启动子GFAP的融合质粒及1.5μg与慢病毒包装相关的混合质粒pCMVΔR8.74和pMD2.G.（均购自addgene公司）至293FT细胞，每200,000个细胞用6L脂质体。其中，脂质体为Invitrogen公司产品，293FT细胞为ATCC公司产品。转染24小时后，将培养293FT细胞的培养液接种至无血清含有5mM丙酮酸钠的DMEM培养液后继续孵育16小时。

[0110] 进一步，利用超速离心机在50,000g速度下对上述293FT细胞破膜得到细胞悬液，将该细胞悬液通过20%的蔗糖滤柱，收集上清，得到含有携带光敏基因的病毒的细胞液。采8
用稀释计数法测试病毒滴度，为3×10TU/mL以上。用灭菌的磷酸盐缓冲液重悬含有携带光敏基因的病毒的细胞液得到重悬液，其中含有携带光敏基因的病毒的细胞液与磷酸盐缓冲液的体积比为1:1000。将上述重悬液加入无血清DMEM培养液中，用于感染动物海马星型胶质细胞，感染6小时，得到光敏星型胶质细胞。其中，重悬液和无血清DMEM培养液的体积比为1:400。

[0111] 将该光敏星型胶质细胞接种于新鲜的含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM，于37℃继续培养48小时；放到显微镜下观察，80%左右的细胞表达绿色荧光的标记蛋白，如图
3所示，其中（a）为光敏星型胶质细胞的显微镜图，（b）为普通星型胶质细胞的显微镜图。对比图3的（a）和（b），可初步证实转染成功，制备得到光敏星型胶质细胞。

[0112] （2）光敏星型胶质细胞兴奋性和细胞膜完整性检测

[0113] 采用一套激光刺激系统（华中科技大学武汉光电国家实验室（筹）生物医学光子学功能实验室研制）对上述光敏星型胶质细胞进行点刺激的模式，这种系统在此刺激模式下，每个点的扫描速度达10ms，光强到1.1mW左右；光刺激的相关参数为：10Hz和50ms；以电压钳的形式记录相关由光所诱发的内向光电流。

[0114] 检测结果如图4（a）～图4（c）所述。由图4（a）～图4（c）可看出，电压钳成功记录到光敏星型胶质细胞中由光诱发的内向电流，且一一对应性良好，证明光敏星型胶质细胞被光特异性地改变了兴奋性。

[0115] 以10Hz、50ms的刺激模式对上述光敏星型胶质细胞进行随机模式的光刺激，刺激时间分别为30min、60min和120min；收集每个时间节点的细胞培养液200L左右并置于-80℃储存。采用市售ATP浓度的荧光素酶检测试剂盒，检测光刺激光敏星型胶质细胞释放的ATP浓度，同时检测细胞外液中乳酸脱氢酶（LDH）的活力度，并以经过光刺激和不经过光刺激的普通星型胶质细胞及不经过光刺激的光敏星型胶质细胞作为对比。

[0116] 光敏星型胶质细胞释放的ATP浓度检测结果如图5（a）～图5（c）所示，其中，图5（a）为光刺激时间为30分钟的ATP浓度图，图5（b）光刺激时间为60分钟的ATP浓度图，图5（c）光刺激时间为120分钟的ATP浓度图。其中，ChR2+Light表示本实施例1构建的光敏星型胶质细胞受光刺激的情况，ChR2表示本实施例1构建的光敏星型胶质细胞不受光刺激的情况，N-ACM表示普通星型胶质细胞不受光刺激的情况，Light表示普通星型胶质细胞受光刺激的情况。

[0117] 由图5（a）～图5（c）可看出，120分钟刺激时间内，光能诱发光敏星型胶质细胞释放ATP，但是60分钟时达到最高值，进一步的刺激并未引起更高地提高。因此，刺激时间优选为60分钟。

[0118] 光刺激后，细胞外液中乳酸脱氢酶（LDH）的活力度的检测结果如图6所示。其中，ChR2+Light表示本实施例1构建的光敏星型胶质细胞受光刺激的情况，ChR2表示本实施例1构建的光敏星型胶质细胞不受光刺激的情况，N-ACM表示普通星型胶质细胞不受光刺激的情况，Light表示普通星型胶质细胞受光刺激的情况。由图6可看出，细胞培养液中检测到的LDH的活力度并无显著差异，表明ATP的释放并非由于细胞膜破裂引起。

[0119] 由ATP释放的情况和细胞细胞外液中LDH的活力度检测情况可表明，经过光刺激后，光敏星型胶质细胞能够保持细胞膜的完整性。

[0120] （3）构建光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系

[0121] 将光敏星型胶质细胞和间充质干细胞共同接种于6-孔板内，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液、于37℃下孵育24小时，得到光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体5
系。其中，接种密度为3×10细胞/孔，光敏星型胶质细胞和干细胞的个数比为1:1。孵育
5
24小时后，总细胞个数约为4×10个。

[0122] （4）测试光敏星型胶质细胞对干细胞功能的影响

[0123] 制备方法如图7所示。

[0124] A、对上述光敏星型胶质细胞进行470nm的蓝光刺激（10Hz、50ms），每次连续刺激60分钟，收集光刺激后的培养液（光刺激星型光敏胶质细胞产生的条件培养基），离心去杂质后，冻于-20℃冰箱内待用。

[0125] B、将干细胞接种于另一个6孔板内，待干细胞长到3×105细胞/孔时，将上述收集到的条件培养基和常规神经元诱导培养基（主要配方为：neurobasal medium(Gibco公司)、体积分数为1%B27(Sigma公司)、50ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）、25ng/mL碱性成纤维生长因子（bFGF）及500ng/mL音猬因子（sonic hedgehog）(PeproTech Inc)）按1:1的比例混合，在37℃下孵育干细胞，连续孵育20天，每隔2天换一次液，在第21天用RT-PCR法进行mRNA表达分析测试，测试结果如图8（a）～图8（b）所示。

[0126] C、将上述收集到的条件培养基和生长到3×105细胞/孔的干细胞接入新鲜的条件培养基或DMEM培养基中，在37℃下孵育24小时后，进行EdU掺入DNA试验。试验结果如图8（c）～图8（d）所示。

[0127] 图8（a）～图8（d）中，CTRL指空白对照组，即将上述的光敏星型胶质细胞换为普通星型胶质细胞，eYFP指增强型黄色荧光蛋白，Pax6和Tuj1是神经元标记物，Gapdh是一个内参，用来表示做定量PCR的时候，各个样本的上样量是一致的。

[0128] 由图8（a）～图8（b）可看出，ChR2组中，神经元标记物Tuj1和Pax6的信使RNA水平增高，也就是证明干细胞往神经元方向的分化增多。

[0129] 由图8（a）～图8（d）可看出，光特异性刺激光敏星型胶质细胞后产生的条件培养基孵育间充质干细胞，有效提高干细胞的神经元方向分化（神经元标记物Tuj1和Pax6表达显著增高）和干细胞的增殖（标记细胞增殖时DNA含量增多的EdU表达增多）。

[0130] （5）制备缓释膜

[0131] 将丙烯酸溶于聚乙烯醇的水溶液中，丙烯酸现场聚合生成聚丙烯酸，聚丙烯酸和聚乙烯醇交联形成水凝胶薄膜。其中，丙烯酸和聚乙烯醇重复链段的质量比为1:1。

[0132] （6）将导电聚合物分散于缓释膜

[0133] 将导电聚合物单体和生物活性物质溶于水中得到电沉积溶液。

[0134] 其中，导电聚合物单体为3,4-乙撑二氧噻吩和苯乙烯磺酸钠，3,4-乙撑二氧噻吩的含量为0.01摩尔/升，苯乙烯磺酸钠的含量为0.1摩尔/升。

[0135] 生物活性物质为浓度为10毫克/L的神经生长因子。

[0136] 将缓释膜浸泡于含有导电聚合单体的电沉积溶液中，使缓释膜充分溶胀，3,4-乙撑二氧噻吩和苯乙烯磺酸钠在该溶胀后的缓释膜中均匀分布。在恒定电压的作用下，3,4-乙撑二氧噻吩聚合生成聚3,4-乙撑二氧噻吩，苯乙烯磺酸钠聚合生成聚苯乙烯磺酸钠，聚3,4-乙撑二氧噻吩、聚苯乙烯磺酸钠与聚丙烯酸和聚乙烯醇组成网际互穿高分子聚合物。

[0137] （7）接种光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系

[0138] 将总细胞个数为4×105个为光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系悬浮于5微升DMEM中，然后接种于缓释膜中，使光敏星型胶质细胞和干细胞共培养吸附于缓释膜的表面，得到神经网络修复系统。其中，光敏星型胶质细胞和干细胞的数量比为1:1。

[0139] 利用大鼠大脑中动脉线拴模型制备脑卒中动物模型，缺血48小时后，将上述神经网络修复系统移植到缺血脑区，24小时后在细胞移植区垂直插入市售光纤（200m直径）进行470nm的蓝光刺激（10Hz，50ms），持续30min，同时在光刺激的区域和光纤成18度角，中间间隔1.8mm，植入Y型微透析管（2mm长半透膜,Bioanalytical Systems公司），该微透析管一端通过塑料导管连接至微量注射器，灌注人工脑脊液（mmol/L:NaCl124,KCl3,CaCl22.4,MgSO41.3,glucose10,and HEPES10,pH=7.3，灌流速度2L/min），另一端通过同样的塑料导管将析出液收集到置于冰浴中的1.5mL的安培管里。

[0140] 上述神经网络修复系统表示为MSC+As+ChR2，治疗14天后，进行Tuj1免疫组染色实验，并用未经任何治疗的脑卒中大鼠模型作为空白对照组，表示为CTRL；用间充质干细胞治疗脑卒中大鼠模型作为对照组，表示为MSC；用间充质干细胞和黄色荧光蛋白转染的星型胶质细胞共移植治疗脑卒中大鼠模型组作为对照组，表示为MSC+Astro-eYFP。

[0141] Tuj1免疫组染色实验的结果参见图9（a）～图9（b）。

[0142] 其中，图9（a）为经不同治疗组治疗的神经功能恢复情况。神经功能评分采用0-5分制打分：分数越高表示脑卒中的损伤越厉害。具体见下表所示：

[0143] 表1神经功能评分

[0144]

[0145] 图9（b）为脑缺血区神经元标记物阳性结果。

[0146] 由9（a）～图9（b）可看出，用上述神经网络修复系统进行治疗，光刺激后，该神经网络修复系统可以促进缺血脑区神经元样细胞数增加，同时提高神经功能的恢复。

[0147] 实施例2

[0148] 制备神经网络修复系统

[0149] （1）构建光敏星型胶质细胞

[0150] 方法同实施例1。

[0151] （2）光敏星型胶质细胞兴奋性和细胞膜完整性检测

[0152] 方法同实施例1。

[0153] （3）构建光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系

[0154] 方法同实施例1。

[0155] （4）制备缓释膜

[0156] 方法同实施例1。

[0157] （5）将缓释膜涂覆于神经电极表面，并干燥。

[0158] （6）将导电聚合物分散于缓释膜

[0159] 涂覆了水凝胶膜的神经电极在含有导电聚合物单体、神经营养物质、神经生长因子和ATP的电沉积溶液中充分溶胀，使得含有导电聚合物单体的溶液均匀分布在溶胀后的水凝胶膜中。其中，导电聚合物单体为吡咯和噻吩。吡咯的含量为0.01摩尔/升，噻吩的含量为0.01摩尔/升，神经营养物质和神经生长因子的含量分别为10毫克/L，ATP的含量为70纳摩尔/L。

[0160] （7）接种光敏星型胶质细胞和干细胞共培养体系

[0161] 方法同实施例1。使光敏星型胶质细胞和干细胞共培养吸附于缓释膜的表面，得到神经网络修复系统。其中，光敏星型胶质细胞和干细胞的数量比为1:1。

[0162] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。