庆笙红球菌及其在制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用

摘要

本发明提供了一株新的菌株——庆笙红球菌（Rhodococcus qingshengii）ZJB-12028，以及该菌株在微生物不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备阿托伐他汀关键手性中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2013年9月4日，保藏编号CCTCC NO:M2013390。该菌株稳定性好，立体选择性严格，产物光学纯度高，用于制备(S)-CHBE具有反应条件温和、环境友好等优点，具有较高的工业化应用潜力。

权利要求

1.庆笙红球菌(Rhodococcus qingshengii)ZJB-12028，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2013年9月4日，保藏编号CCTCC NO:M 2013390。

2.如权利要求1所述的庆笙红球菌ZJB-12028在微生物不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述不对称还原在pH4.0～9.0、20～45℃下进行。

说明书

庆笙红球菌及其在制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应

用

（一）技术领域

[0001] 本发明涉及一株新的菌株——庆笙红球菌（Rhodococcus qingshengii）ZJB-12028，以及该菌株在微生物不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备阿托伐他汀关键手性中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。（二）背景技术

[0002] (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（Ethyl(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate,(S)-CHBE）是一种重要的手性药物中间体，可用于合成他汀类药物—羟甲基戊二酰CoA（HMG-CoA）还原酶的竞争性抑制剂，可以抑制肝脏中的胆固醇的合成，从而降低血液中胆固醇的含量，降低心脑血管疾病的发病机率，其药物商品名立普妥（阿托伐他汀钙）是美国第一个年销量超过一百亿美元的药物，目前也是全球最高销量的药物。另外，(S)-CHBE还可以转化生成1，4-二氢吡啶类β-阻滞剂，后者是一种抗高血压药物的有效成分。因此，制备光学活性(S)-CHBE备受研究者的关注。以下是(S)-CHBE分子结构式：

[0003]

[0004] (S)-CHBE的制备方法可以分为外消旋体拆分法和不对称催化合成法。由于外消旋体拆分的方法制备效率不高，理论收率仅为50％，且产物的分离纯化困难，因此，对于外消旋体的手性拆分制备(S)-CHBE意义不大。与拆分法相比较而言，采用不对称合成(S)-CHBE受到了更多的关注。以潜手性底物4-氯乙酰乙酸乙酯（Ethyl4-chloroacetoacetate，COBE）为原料，不对称催化合成单一手性对映体(S)-CHBE可以解决拆分法获得(S)-CHBE中的过程复杂，单一对映体过量值低等问题，同时由于底物COBE价格便宜，容易合成，因此不对称合成法是最经济有效的合成(S)-CHBE方法。

[0005] 以COBE为原料不对称合成制备(S)-CHBE，可分为化学催化法和生物催化法两类。化学催化法是采用手性的钌化合物（例如RuX2[(S)-BINAP]）作为催化剂不对称加氢还原，产物的e.e.值可达97%以上，但这种方法需要高压加氢，对反应器要求较高，而且所用催化剂价格昂贵，因此生产成本较高。而采用的生物催化剂无需苛刻的反应条件，也不需要昂贵的催化剂，因此有较好的应用前景。生物催化过程中，采用纯酶催化需要添加昂贵的辅酶，因此，大规模的生产通常采用具备辅酶再生系统的微生物细胞作为催化剂。生物法羰基不对称还原制备(S)-CHBE具有反应条件温和，产物单一，立体选择性高，在未来的绿色化学的发展过程中有重要的利用开发价值。
（三）发明内容

[0006] 本发明目的是提供一株新菌株——庆笙红球菌（Rhodococcus qingshengii）ZJB-12028，及其在羰基不对称还原制备(S)-CHBE中的应用，该菌株稳定性好，立体选择性严格，产物光学纯度高。

[0007] 本发明采用的技术方案是：

[0008] 庆笙红球菌（Rhodococcus qingshengii）ZJB-12028，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2013年9月4日，保藏编号CCTCC NO:M2013390。

[0009] 该新菌株特征如下：

[0010] 菌落形态：28℃条件下培养24h，菌落呈圆形，中央隆起呈凸镜状，直径2～3mm，乳白色，不透明，表面光滑湿润，边缘整齐，略带锯齿状，易挑起。

[0011] 生理生化特征：革兰氏阳性，接触酶阳性，利用APICoryne自动微生物鉴定系统对菌株进行了生理生化检测表明菌株ZJB-12028为红球菌属（Rhodococcus），具体特征见表1。

[0012] 表1：菌株ZJB-12028的生理生化鉴定结果

[0013]

[0014] Notes:+,positive;-,negative;

[0015] 16S rDNA序列鉴定：以提取到的细胞总DNA为模版，利用通用引物P1和P2扩增菌株的16S rDNA基因，再将PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。菌株ZJB-12028经PCR扩增获得一段长约为1.5kb的片段，经测序确认该菌株16S rDNA的扩增产物实际长度为1422bp，序列如SEQ ID No.1所示：

[0016] CATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCTTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCCTATCGCATGGTGGGTGGTGGAAAGATTTATCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTTTGTGAAAACCAGCAGCTCAACTGCTGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAACGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTCCTTCCACGGAATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATATACCGGAAAGCTGCAGAGATGTGGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCTTATGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCGTAAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCTGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCTTAACCCCTTGTGGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGAA

[0017] 所述菌株的16S rDNA序列与GenBank相关数据进行相似性分析发现，该菌与庆笙红球菌（Rhodococcus qingshengii IARI-JR-58）（No.KF055006.1）同源性最高（homology，100%/1422bps，based on16S rDNA），因此结合细胞形态、生理生化和分子生物学鉴定，可确定该菌株为庆笙红球菌（Rhodococcus qingshengii）。

[0018] 本发明所涉及的微生物是通过以下方法筛选得到的：

[0019] （1）称取从杭州及周边地区采集的土样1g加入到9ml0.85%的生理盐水中，在涡流振荡器上充分混匀。取上清1ml，加入到39ml富集培养基中，28℃、150rpm下培养72h，然后再取1ml培养基加入到39ml的富集培养基，28℃、150rpm下培养72h，如此进行三轮富集。富集培养基终浓度组成如下：葡萄糖8g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏4g/L，NaCl4g/L，溶剂为水，用1.0mol/L盐酸或NaOH溶液调节pH至6.0～8.0。

[0020] （2）第三次富集培养液稀释后涂布到平板培养基上，挑取单菌落至斜面保藏。平板培养基及斜面培养基为前述富集培养基中加入15～20g/L的琼脂。

[0021] （3）挑取的单菌落接种到发酵培养基，发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖40g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl4g/L，K2HPO40.5g/L，溶剂为水，pH7.0（115℃下，灭菌30min）；28℃下，摇瓶转速150rmp，培养24，离心后悬浮于磷酸缓冲液体系中，加入COBE作为底物，进行转化。

[0022] （4）用气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)：

[0023] 反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后采用气相色谱法检测产物的对映体过量值和产率。

[0024] 非手性GC分析条件：HP-5弱极性色谱柱（30m×0.32mm×0.25μm），柱温120℃，保留2.5min，以50℃/min程序升温至165℃，保持1.2min。载气为氮气，流量1.0mL/min，进样量1μL，分流比50：1，检测器温度为250℃，进样口温度为230℃；非手性色谱柱可以检测底物COBE和产物CHBE的含量，进一步计算反应的摩尔转化率。

[0025] 手性GC分析条件：BGB-174手性毛细管气相色谱柱（30m×0.32mm×0.25μm），柱温110℃，以0.5℃/min程序升温至125℃，载气为氦气，流量为1.0mL/min，进样量1μL，分流比40：1，检测及进样口温度均为220℃；手性色谱柱可以检测(S)-CHBE和(R)-CHBE的含量，进一步计算产物的光学纯度（对映体过量值，e.e.%）。

[0026] 本发明还涉及所述的庆笙红球菌ZJB-12028在微生物不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

[0027] 优选的，所述不对称还原在pH4.0～9.0、20～45℃下进行，更优选在pH6.0～7.5、28～35℃下进行。

[0028] 具体的，所述的应用方法如下：在以Rhodococcus qingshengii ZJB-12028发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂、以COBE为底物、水或pH4.0～9.0缓冲溶液为溶剂所构成的转化体系a中，在20～45℃下进行转化反应，反应完全后，将转化液后处理，获得所述(S)-CHBE。所述不对称还原涉及的化学反应如下：

[0029]

[0030] 具体的，所述转化体系a中底物初始浓度为10～3000mmol/L，优选50～1500mmol/L；转化体系a中含酶湿菌体添加量以菌体干重计为10～250g/L，优选50～
200g/L。

[0031] 进一步，为实现辅酶的再生循环，所述转化体系a中还可包括辅助底物，由辅助底物、底物、催化剂与pH4.0～9.0的缓冲液构成转化体系b，所述辅助底物为下列之一：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇，柠檬酸钠，优选葡萄糖或果糖。

[0032] 具体的，所述应用方法可如下：以Rhodococcus qingshengii ZJB-12028发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂，以COBE为底物，加入辅助底物，与水或pH4.0～9.0缓冲溶液构成的转化体系b，在20～45℃下进行转化反应，反应完全后，将转化液后处理，获得所述(S)-CHBE；所述转化体系b中底物初始浓度为10～3000mmol/L（优选50～1500mmol/L），含酶湿菌体添加量以菌体干重计为10～250g/L（优选50～200g/L），辅助底物初始浓度为10～50g/L，所述辅助底物为下列之一：葡萄糖（优选30～50g/L）、果糖（优选30～50g/L）、蔗糖（优选20～35g/L）、麦芽糖（优选30～50g/L）、甘露醇（优选30～50g/L），柠檬酸钠（优选30～50g/L），优选为葡萄糖或果糖。

[0033] 所述转化反应是在20～45℃下反应0.1～24h，优选为28～35℃反应0.5～4h。

[0034] 优选的，所述转化液后处理的方法如下：反应结束后，将转化液离心，去除菌体细胞，取上清液用等体积乙酸乙酯萃取，取有机层用无水Na2SO4脱水、过滤，滤液即为含(S)-CHBE的粗品，将粗品分离纯化，即得(S)-CHBE。所述粗品分离纯化采用本领域公知的技术进行，通常为旋转蒸发和减压蒸馏。

[0035] 进一步，所述转化体系a或转化体系b均是由蒸馏水、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液形成的pH4.0～9.0的反应体系。

[0036] 本发明的有益效果主要体现在：提供了一种不对称还原制备(S)-CHBE的新菌株，通过该菌株可制备阿托伐他汀的重要手性中间体——(S)-CHBE，该菌株稳定性好，立体选择性严格，产物光学纯度高，用于制备(S)-CHBE具有反应条件温和、环境友好等优点，具有较高的工业化应用潜力。（四）具体实施方式

[0037] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0038] 实施例1：菌株的筛选

[0039] 羰基还原酶产生菌的分离：在9mL0.85%的生理盐水中加入1g土样，在涡流振荡器上充分混匀，使成均匀的土壤悬液；吸取1.0mL的土壤悬液接种于装有39mL富集培养基的250mL的三角瓶中，置于28℃，150rmp的摇床培养72h，等富集液出现浑浊后，再吸取1.0mL转接到新鲜的富集培养基中，继续培养72h；如此进行三轮富集，将富集培养液稀释多个梯度后涂布到分离平板上，获得单菌落；

[0040] 富集培养基组成如下（终浓度）：葡萄糖8g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏4g/L，NaCl4g/L，以蒸馏水配制，用1.0mol的盐酸或NaOH溶液调节pH至7.0；分离平板培养基为前述富集培养基中加入15g/L的琼脂，115℃灭菌30min后，倒平板。

[0041] 挑取的单菌落接种到发酵培养基，组成如下（终浓度）：葡萄糖40g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl4g/L，K2HPO40.5g/L，pH7.0（115℃下，灭菌30min）。28℃下，摇瓶转速150rmp，培养24h，离心后取菌体悬浮于磷酸缓冲液体系中，加入COBE作为底物，进行转化12h。转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液通过乙酸乙酯萃取、无水Na2SO4脱水、过滤，采用气相色谱检测分析，能将底物COBE转化生成(S)-CHBE的菌株为目的菌株，最终从中选择出一株立体选择性最高的菌株（编号为ZJB-12028，即CCTCC No：M2013390）做后续的菌种鉴定及转化。

[0042] 实施例2：Rhodococcus qingshengii ZJB-12028的发酵培养

[0043] (1)斜面培养：将Rhodococcus qingshengii ZJB-12028接种于斜面培养基，于28℃下培养24小时，获得斜面菌体。斜面培养基配方：葡萄糖8g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏
5g/L，牛肉膏4g/L，NaCl4g/L，琼脂20g/L，以蒸馏水配制，自然pH。

[0044] (2)种子培养：用接种环从斜面菌体挑取一环菌体接种于种子培养基，28℃，150r/min条件下培养24小时，获得种子液。种子培养基的配方为：葡萄糖8g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏4g/L，NaCl4g/L，蒸馏水配制，初始pH为6.0。

[0045] (3)发酵培养：将培养好的种子液按照2%的体积比接种到发酵培养基中，在28℃、摇床转数150r/min条件下培养24小时，获得含菌细胞发酵液。将获得的含菌细胞发酵液离心，弃去上清液，生理盐水洗涤两次后，离心收集获得湿菌体，菌体的产量为8.7g/L（干重计）。发酵培养基的配方为：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl4g/L，K2HPO40.5g/L，溶剂为水，初始pH为6.0。

[0046] 实施例3：Rhodococcus qingshengii ZJB-12028的发酵培养

[0047] 发酵培养：将按实施例步骤（1）～（2）培养好的种子液按照2%的体积比接种到发酵培养基中，在30℃、摇床转数150r/min条件下培养24小时，获得含菌细胞发酵液。将获得的含菌细胞发酵液离心，弃去上清液，生理盐水洗涤两次后，离心收集获得湿菌体，菌体的产量为11.3g/L（干重计）。发酵培养基的配方为：葡萄糖40g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl4g/L，K2HPO40.5g/L，溶剂为水，初始pH为7.0。

[0048] 实施例4：Rhodococcus qingshengii ZJB-12028生物催化制备(S)-CHBE[0049] 发酵培养获得湿菌体，过程如实施例2。

[0050] 在转化瓶中加入10mL磷酸钠缓冲液（pH7.0，0.1M），其中含有湿菌体0.5g，底物COBE40mmol/L，在28℃恒温水浴搅拌反应4小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度>99%，转化率为23%。

[0051] 实施例5：Rhodococcus qingshengii ZJB-12028生物催化制备(S)-CHBE[0052] 发酵培养获得湿菌体，过程如实施例2。

[0053] 在转化瓶中加入10mL柠檬酸钠缓冲液（pH6.0，0.1M），其中含有湿菌体1.0g，底物COBE40mmol/L，辅助底物葡萄糖为35g/L，在30℃恒温水浴搅拌反应2小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度>99%，转化率为78%。

[0054] 实施例6：Rhodococcus qingshengii ZJB-12028生物催化制备(S)-CHBE[0055] 发酵培养获得湿菌体，过程如实施例3。

[0056] 在转化瓶中加入10mL磷酸钠缓冲液（pH7.0，0.1M），其中含有湿菌体0.5g，底物COBE40mmol/L，辅助底物葡萄糖为35g/L，在35℃恒温水浴搅拌反应2小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度>99%，转化率为45%。

[0057] 实施例7：Rhodococcus qingshengii ZJB-12028生物催化制备(S)-CHBE[0058] 湿菌体的制备同实施例3。

[0059] 在转化瓶中加入10mL磷酸钠缓冲液（pH7.5，0.1M），其中含有湿菌体0.5g，底物COBE80mmol，辅助底物葡萄糖为35g/L，在30℃恒温水浴搅拌反应2小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度>99%，转化率为48%。

[0060] 实施例8：Rhodococcus qingshengii ZJB-12028生物催化制备(S)-CHBE[0061] 湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入10mL磷酸钠缓冲液（pH7.5，0.1M），其中含有湿菌体1.0g，底物COBE60mmol，辅助底物果糖为40g/L，在30℃恒温水浴搅拌反应2小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度>99%，转化率为58%。

[0062] 实施例9：Rhodococcus qingshengii ZJB-12028生物催化制备(S)-CHBE[0063] 湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲液（pH7.5，0.1M），其中含有湿菌体10g，底物COBE40mmol/L，辅助底物葡萄糖为40g/L，在30℃恒温水浴搅拌反应4小时。反应结束后，转化液在8000rpm离心5分钟，有机层用无水Na2SO4脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度>99%，转化率为82%。