作为MGLU2受体激动剂的双环(3.1.0)己烷-2,6-二羧酸衍生物

摘要

本发明提供了用于治疗躁郁症、精神分裂症和广泛性焦虑症的新mGlu2激动剂。

权利要求

1.下式的化合物或其药物可接受的盐其中

1

R为 或 ；

R2为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或苄基，其中苄基任选被一至两个氟原子、任选被

1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基或-C1-C3烷氧基取代；

R3为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或苄基，其中苄基任选被一至两个氟原子、任选被

1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基或-C1-C3烷氧基取代；

R4为氢、(2S)-2-氨基丙酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基硫烷基-丁酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基或2-氨基乙酰基；

R5为任选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基、-NH2或环丙基；

条件是当R2和/或R3不是氢时则R4是氢；和条件是当硫原子以S构型与双环[3.1.0]己烷环体系连接时R5可为氢。

2.如权利要求1所述的化合物或其药物可接受的盐，其中R5不是氢。

3.如权利要求1所述的化合物或其药物可接受的盐，其中R2为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基，且R3为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基。

4.如权利要求1所述的化合物或其药物可接受的盐，其中R1为 。

2

5.如权利要求1所述的化合物或其药物可接受的盐，其中R 为氢。

3

6.如权利要求1所述的化合物或其药物可接受的盐，其中R 为氢。

4

7.如权利要求1所述的化合物或其药物可接受的盐，其中R 为氢。

8.药物组合物，其包含权利要求1至7中任一项所述的化合物或其药物可接受的盐以及药物可接受的载体或赋形剂。

9.权利要求1至7中任一项所述的化合物或其药物可接受的盐在制备用于治疗选自躁郁症、精神分裂症和广泛性焦虑症的精神病学病症的药物中的用途。

说明书

作为MGLU2受体激动剂的双环(3.1.0)己烷-2,6-二羧酸

衍生物

[0001] 本发明涉及mGlu2受体激动剂化合物，特别是其前药及其盐以及药物组合物和这类化合物，特别是前药及其盐的治疗用途。

[0002] L-谷氨酸是中枢神经系统中的主要兴奋性神经递质并被称为兴奋性氨基酸。代谢型谷氨酸(mGlu)受体是调节神经元兴奋性的G-蛋白-偶联受体。已将神经学或精神病学病症的治疗与mGlu兴奋性氨基酸受体的选择性激活联系。许多研究支持II组 mGlu受体(其包括mGlu2和/或mGlu3)激活用于治疗精神分裂症。更特别地，最近数据表明mGlu2/3受体激动剂具有抗精神病药物特性并且可对精神分裂症的治疗提供新的替代物。mGlu2和mGlu3受体基因敲除小鼠中的研究表明mGlu2/3受体激动剂的抗精神病药物样活性是mGlu2介导的。研究还表明mGlu2/3激动剂具有抗焦虑药、抗抑郁药和神经保护特性。
因此，mGlu2受体激动剂可用于治疗精神病学病症如躁郁症(还称为躁狂抑郁症)、还称为躁狂抑郁症、精神分裂症和广泛性焦虑症。

[0003] WO9717952公开了某些声称为代谢型谷氨酸受体的拮抗剂或激动剂的4-取代的双环[3.1.0]己烷化合物。WO03104217公开了声称为mGlu2受体激动剂化合物的前药形式的双环[3.1.0]己烷和杂双环[3.1.0]己烷化合物。

[0004] 过度谷氨酸调节(tone)已经涉及许多中枢神经系统的疾病状态；然而，纠正这种病理生理学状态的有效药物缺少临床实践。特别地，由于缺乏具有合适类药性质的mGlu2激动剂，因此仍未实现临床应用。因此，仍亟需强效mGlu2激动剂。还亟需有效的mGlu2激动剂。本发明提供了为强效和有效的mGlu2激动剂的新的4-取代的双环[3.1.0]己烷，特别地包括其前药，所述前药提供适用于临床开发的增强的生物利用度。本发明的这类新化合物能解决强效、有效治疗精神病学病症如躁郁症、精神分裂症和广泛性焦虑症的需求。

[0005] 本发明提供了下式的化合物或其药物可接受的盐

[0006]

[0007] 其中

[0008] R1为 或 ；2

[0009] R为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或苄基，其中苄基任选被一至两个氟原子、任3
选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基或-C1-C3烷氧基取代；R 为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或苄基，其中苄基任选被一至两个氟原子、任选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷
4
基或-C1-C3烷氧基取代；R 为氢、(2S)-2-氨基丙酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基硫烷基-丁
5
酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基或2-氨基乙酰基；R为任选被1至3个氟原子取代
2 3 4 4
的-C1-C3烷基、-NH2或环丙基；条件是当R 和/或R 不是氢时则R 是氢；条件是当R 不是
2 3 5
氢时则R和/或R 是氢；条件是当硫原子以S构型与双环[3.1.0]己烷环体系连接时R可为氢。

[0010] 本发明提供了治疗选自躁郁症、精神分裂症和广泛性焦虑症的精神病学病症的方法，其包括给予需要其的患者有效量的本发明的化合物或其药物可接受的盐。

[0011] 本发明还提供了治疗疼痛的方法，其包括给予需要其的患者有效量的本发明的化合物或其药物可接受的盐。

[0012] 本发明还提供了治疗物质滥用的方法，其包括给予需要其的患者有效量的本发明的化合物或其药物可接受的盐。

[0013] 本发明提供了包含本发明的化合物或其药物可接受的盐的药物组合物。本发明提供了包含本发明的化合物或其药物可接受的盐以及一种或多种药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。在特别的实施方案中，制剂还包含一种或多种其它的治疗剂。

[0014] 本发明提供了本发明的化合物或其药物可接受的盐，其用于治疗，特别地用于治疗精神病学病症。此外，本发明提供了本发明的化合物或其药物可接受的盐在制备用于治疗精神病学病症的药物中的用途。本发明还提供了本发明的化合物或其药物可接受的盐，其用于治疗精神病学病症。

[0015] 本发明提供了本发明的化合物或其药物可接受的盐，其用于治疗，特别地用于治疗疼痛。此外，本发明提供了本发明的化合物或其药物可接受的盐在制备用于治疗疼痛的药物中的用途。本发明还提供了本发明的化合物或其药物可接受的盐，其用于治疗疼痛。

[0016] 本发明提供了本发明的化合物或其药物可接受的盐，其用于治疗的，特别地用于治疗物质滥用。此外，本发明提供了本发明的化合物或其药物可接受的盐在制备用于治疗物质滥用的药物中的用途。本发明还提供了本发明的化合物或其药物可接受的盐，其用于治疗物质滥用。

[0017] 此外，本发明提供了适用于治疗精神病学病症的药物制剂。此外，本发明提供了本文描述的方法和用途的优选实施方案，其中所述精神病学病症选自躁郁症、精神分裂症和广泛性焦虑症。

[0018] 此外，本发明提供了适用于治疗疼痛的药物制剂。此外，本发明提供了适用于治疗物质滥用的药物制剂。

[0019] 用于上述通式和整个说明书的一般化学术语具有它们的常见含义。例如，术语“-C1-C3烷基”是-C1-C3烷基基团并且是指甲基、乙基、丙基和异丙基。术语“-C1-C3烷氧基”是与氧原子连接的-C1-C3烷基基团并且是指甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。

[0020] 术语“氮保护基”或“氨基保护基”和“氧保护基”或“羧基保护基”是指对预定的反应条件稳定并且还可被与再生胺或酸相容的试剂和反应条件选择性去除的部分。这类基团是技术人员熟知的并且在文献中进行描述。参见例如，Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第四版, John Wiley & Sons, Inc., (2007)。

[0021] 技术人员理解本发明的化合物能以互变异构体形式存在，例如在下列(1)中描述的。当在本申请中任何提及本发明化合物的具体互变异构体之一时，应当理解包括两种互变异构体形式及其所有混合物。

[0022]

[0023] (1)。

[0024] 技术人员理解本发明的化合物包括包含至少五个手性中心的核心：

[0025]

[0026] (2)。

[0027] 如上述(2)例示的，具有在标记为2至5的原子处的绝对构型的化合物是本发明的优选化合物。在标记为1的原子处，当硫原子在通过虚键表示的相对于环的平面位置的向下位置与双环[3.1.0]己烷环体系连接时定义R-构型。相反，当硫原子在通过实楔形键表示的相对于环的平面位置的向上位置与双环[3.1.0]己烷环体系连接时定义S-构型。

[0028] 此外，技术人员理解通过选择一些变量可在本发明的化合物中建立另外的手性中心。在这种情况出现时，本发明包括所有单独的对映异构体或非对映异构体以及所述化合物的对映异构体和非对映异构体的混合物包括外消旋体。

[0029] 技术人员还理解对所有手性中心的Cahn-Ingold-Prelog(R)或(S)命名依据特定化合物的取代方式而变化。可使用手性试剂开始或通过立体选择性或立体专一性合成技术制备单一的对映异构体或非对映异构体。或者，可在合成本发明化合物中的任何方便点通过标准手性色谱技术或结晶技术从混合物中分离单一的对映异构体或非对映异构体。本发明化合物的单一对映异构体和非对映异构体是本发明的优选实施方案。

[0030] 本发明的化合物能够与例如许多无机酸和有机酸反应以形成药物可接受的酸加成盐或碱加成盐。药物可接受的盐和制备它们的常见方法是本领域熟知的。参见例如，P. Stahl等人，Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use,(VCHA/Wiley-VCH, 2002)；S.M. Berge等人，“Pharmaceutical Salts” Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, 1977年1月。优选的药物可接受的盐是与盐酸形成的那些。

[0031] 尽管所有本发明的化合物适用作mGlu2的激动剂，但一些类别的化合物是优选的。下面段落描述这样的优选类别：

[0032] R1为 ；1

[0033] R为 ；

[0034] R2为氢；

[0035] R2为2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；

[0036] R2为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；

[0037] R2为任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；

[0038] R3为氢；

[0039] R3为2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；

[0040] R3为任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；

[0041] R3为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；

[0042] R4为氢；

[0043] R4为(2S)-2-氨基丙酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基硫烷基-丁酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基或2-氨基乙酰基；

[0044] R5为任选被1至3个氟原子取代的C1-C3烷基、-NH2或环丙基；

[0045] 本发明的化合物是药物可接受的盐；

[0046] 本发明的化合物是盐酸盐。

[0047] 优选的实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中1 2

[0048] R为 或 ；R为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或苄基，其中苄基任选被一至两个氟原子、任选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基或-C1-C3
3
烷氧基取代；R为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或苄基，其中苄基任选被一至两个氟原
4
子、任选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基或-C1-C3烷氧基取代；R 为氢、(2S)-2-氨基丙酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基硫烷基-丁酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基或2-氨
5 2
基乙酰基；R为任选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基、-NH2或环丙基；条件是当R 和/
3 4 4 2 3
或R不是氢时则R 是氢；条件是当R 不是氢时则R 和/或R 是氢。

[0049] 另一优选的实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中[0050] R1为 或 ；R2为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲基3
或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；R 为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲
4
基或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；R 为氢、(2S)-2-氨基丙酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基硫烷基-丁酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基或2-氨基乙酰基；
5 2 3
R为任选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基、-NH2或环丙基；条件是当R 和/或R 不是
4 4 2 3
氢时则R是氢；条件是当R 不是氢时则R 和/或R 是氢。

[0051] 另外优选的实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中[0052] R1为 或 ；R2为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲基3
或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；R 为氢、2,2-二甲基-丙酰氧基甲
4
基或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；R 为氢、(2S)-2-氨基丙酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基硫烷基-丁酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基或2-氨基乙酰基；
5 2 3
R为任选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基、-NH2或环丙基；条件是当R 和/或R 不是
4 4 2 3
氢时则R是氢；条件是当R 不是氢时则R 和/或R 是氢；条件是当硫原子以S构型与双
5
环[3.1.0]己烷环体系连接时R可为氢。

[0053] 另一优选的实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中R1为2
或 ；R为氢或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的
3 4
苄基；R为氢或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；R 为氢、(2S)-2-氨基丙酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基硫烷基-丁酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基或2-氨基乙
5 2
酰基；R为任选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基、-NH2或环丙基；条件是当R 和/或
3 4 4 2 3
R不是氢时则R 是氢；条件是当R 不是氢时则R 和/或R 是氢。
1

[0054] 另外优选的实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中R为或 ；R2为氢或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的3 4
苄基；R为氢或任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；R 为氢、(2S)-2-氨基丙酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基硫烷基-丁酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基或2-氨基乙
5 2
酰基；R为任选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基、-NH2或环丙基；条件是当R 和/或
3 4 4 2 3
R不是氢时则R 是氢；条件是当R 不是氢时则R 和/或R 是氢；条件是当硫原子以S构
5
型与双环[3.1.0]己烷环体系连接时R可为氢。

[0055] 优选的实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中R1为2
或 ；R为2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或任选被一至两个氟
3
原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；R 为2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或任选被一至两个氟原
4 5
子、-CF3或-OCH3取代的苄基；R 为氢；R 为任选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基、-NH2或环丙基。
1

[0056] 另一优选的实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中R为或 ；R2为2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或任选被一至两个氟3
原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；R 为2,2-二甲基-丙酰氧基甲基或任选被一至两个氟原
4 5
子、-CF3或-OCH3取代的苄基；R 为氢；R 为任选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基、-NH2
5
或环丙基；条件是当硫原子以S构型与双环[3.1.0]己烷环体系连接时R可为氢。

[0057] 另外优选的实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中R1为2
或 ；R为任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄
3 4 5
基；R为任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；R 为氢；R 为任选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基、-NH2或环丙基。
1

[0058] 另外优选的实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中R为或 ；R2为任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄3 4 5
基；R为任选被一至两个氟原子、-CF3或-OCH3取代的苄基；R 为氢；R 为任选被1至3个氟原子取代的-C1-C3烷基、-NH2或环丙基；条件是当硫原子以S构型与双环[3.1.0]己烷
5
环体系连接时R可为氢。

[0059] 另一优选的实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中R1为2 3 4
或 ；R为氢；R 为氢；R 为(2S)-2-氨基丙酰基、(2S)-2-氨
5
基-4-甲基硫烷基-丁酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基或2-氨基乙酰基；R为任选被1至3个氟原子取代的C1-C3烷基、-NH2或环丙基。

[0060] 另外优选的实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中R1为2 3 4
或 ；R为氢；R 为氢；R 为(2S)-2-氨基丙酰基、(2S)-2-氨
5
基-4-甲基硫烷基-丁酰基、(2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基或2-氨基乙酰基；R为任选被
1至3个氟原子取代的C1-C3烷基、-NH2或环丙基；条件是当硫原子以S构型与双环[3.1.0]
5
己烷环体系连接时R可为氢。
1

[0061] 特别优选实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中R为或 ；R2为氢；R3为氢；R4为氢；R5为任选被1至3个氟原子取代的C1-C3烷基、-NH2或环丙基。

[0062] 特别优选实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中R1为2 3 4 5
或 ；R为氢；R 为氢；R 为氢；R 为任选被1至3个氟原子
取代的C1-C3烷基、-NH2或环丙基；条件是当硫原子以S构型与双环[3.1.0]己烷环体系连
5
接时R可为氢。
1

[0063] 另一特别优选实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中R为2 3 4 5
；R为氢；R 为氢；R 为氢；R 为任选被1至3个氟原子取代的C1-C3烷
基、-NH2或环丙基。

[0064] 另一特别优选实施方案涉及本发明的化合物或其药物可接受的盐，其中R1为；R2为氢；R3为氢；R4为氢；R5为任选被1至3个氟原子取代的C1-C3烷5
基、-NH2或环丙基；条件是当硫原子以S构型与双环[3.1.0]己烷环体系连接时R 可为氢。

[0065] 可通过本领域已知的多种方法制备本发明的化合物或其盐，这些方法中的一些在下列方案、制备和实施例中例示。可以不同方式结合描述的各个路线的具体合成步骤，或结合来自不同方案中的步骤以制备本发明的化合物或其盐。能通过常规方法回收下列方案中各个步骤的产物，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研磨和结晶。

[0066] 为了清晰考虑，在下列方案中一些立体化学中心未被指定并且一些取代基被删除并且不意图以任何方式限制所述方案的教导。此外，可在合成本发明化合物中的任何方便点通过方法如手性色谱分离单独的异构体、对映异构体或非对映异构体。此外，在下列方案中描述的中间体包含许多羧基和氨基的保护基。在每次出现时依赖待进行的特殊反应条件和特殊转化，可变的保护基可相同或不同。保护和脱保护条件是技术人员熟知的并且在文献中描述。参见例如上述Greene和Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis。

[0067] 根据Aldrichimica Acta, Vol. 17, No. 1, 1984定义本文使用的缩写。如下定义其它的缩写：“tosylate(对甲苯磺酸酯)”是对甲苯磺酰基；“mesylate(甲磺酸酯)”是甲烷磺酰基；“DIPEA”是指二异丙基乙胺；“DIC”是指二异丙基碳二亚胺；“HATU”是指2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)--1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯；methanaminium；“HBTU”是指O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基-脲鎓-六氟磷酸酯；“HOAt”是指1-羟基-7-氮杂苯并三唑；“PyBOP”是指苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷子基-磷鎓六氟磷酸酯；
“PyBrop”是指溴-三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸酯；“DMAP”是指4-二甲基氨基吡啶；“THF”是指四氢呋喃；“SCX”是强阳离子交换；“Prep No”是制备编号；“Ex No”是实施例编号。

[0068] 在下列方案中，除非另外规定所有取代基如前面定义的。试剂和起始材料通常是本领域一般技术人员容易获得的。其它可通过有机和杂环化学的标准技术进行制备，其与已知结构类似化合物的合成以及下面制备和实施例中描述的步骤包括任何新的步骤相似。

[0069] 方案I

[0070]

[0071] 方案I例示了式5化合物的一般合成。“PG1”是开发用于羧基如酯的保护基。“PG2”是开发用于氨基如氨基甲酸和酰胺的保护基。这类保护基是本领域熟知和理解的。“LG”是离去基团如对甲苯磺酸酯或甲磺酸酯。因此，“LG-卤化物”是试剂如对甲苯磺酰氯或甲烷磺酰氯。

[0072] 在合适的溶剂如二氯甲烷中，式1化合物与式2化合物在合适的碱如二甲基氨基吡啶或三乙胺的存在下反应以提供式3化合物。式5化合物是在合适的溶剂如二甲基甲酰胺中式3化合物与合适的式4化合物在合适的碱如碳酸钾或碳酸钠的存在下反应，随后经历促进保护基的去除的条件产生的，这是本领域熟知和理解的。能以游离碱或合适的盐如盐酸盐的形式分离式5化合物。

[0073] 方案II

[0074]

[0075] 方案II例示了式7化合物的一般合成。“PG1”和“PG2”与上述方案I中定义的相同。

[0076] 式1化合物与三苯基膦和Br2在合适的溶剂如甲苯或四氢呋喃中反应以提供生成的式6的溴化合物。式7化合物是在合适的溶剂如二甲基甲酰胺中式6化合物与合适的式4化合物在合适的碱如碳酸钾存在下反应，随后经历促进保护基的去除的条件产生的，这是本领域熟知和理解的。能以游离碱或合适的盐如盐酸盐的形式分离式7化合物。

[0077] 方案III

[0078]

[0079] 方案III例示了产生式11化合物的一般合成。“PG1”和“PG2”与上述方案I中定4
义的相同。R不是氢。

[0080] 使式8化合物进行合适的脱保护条件以实现“PG2”的去除从而产生式9化合物。这样的条件是本领域熟知和理解的。式11化合物是式9化合物与式10化合物在合适的偶联条件下反应，随后经历促进保护基的去除的条件产生的，这是本领域熟知和理解的。本领域的技术人员知道有许多用于从羧酸和胺的反应导致的酰胺形成的方法和试剂。例如，合适的偶联条件包括合适的式9化合物与合适的式10的酸在偶联剂和胺碱如DIPEA或三乙胺的存在下的反应。偶联剂包括碳二亚胺类如DCC、DIC、EDCI和芳香族偶联剂如HOBt和HOAt。此外，非亲核性阴离子的脲鎓或磷鎓盐如HBTU、HATU、PyBOP和PyBrOP能用于代替更多的传统偶联剂。添加剂如DMAP可用于增强反应。能以游离碱或合适的盐如盐酸盐的形式分离式11化合物。

[0081] 方案IV

[0082]

[0083] 方案IV例示了产生式14化合物的一般合成。“PG1”和“PG2”如上述方案I中所述的定义。

[0084] 通过使式8化合物经历合适的脱保护条件以实现仅酸的脱保护从而获得式12化合物。这样的条件是本领域熟知和理解的。通过在合适的条件下用R2OH酯化生成的游离羧酸部分获得式13化合物。注意R2 = R3。技术人员理解有许多实现游离羧酸酯化的方法和试剂。例如，能将过量的一种试剂，例如醇组分加入至反应混合物。或者，能通过蒸馏或脱水剂从反应中去除生成的水。最后，使生成的式13化合物经历合适的条件以实现胺的脱保护。这样的条件是本领域熟知和理解的。能以游离碱或合适的盐如盐酸盐的形式分离式14化合物。

[0085] 或者，能通过合适的中间体如式7化合物的选择性和分步保护和脱保护获得其中R2和R3不同的二酯。这样的条件是本领域熟知和理解的。

[0086] 容易理解，能通过与本文描述的那些相似的方法并通过本领域熟知和已建立的步骤迅速制备式1化合物。容易理解，制备本发明化合物的步骤依赖被合成的特殊化合物、起始化合物和取代部分的相对不稳定性。

[0087] 制备和实施例

[0088] 下列制备和实施例进一步例示本发明。

[0089] 通过SYMYX®Draw 3.2或ACD/命名版本12提供本发明的实施例化合物的名称。

[0090] 制备1

[0091] (1S,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(对甲苯磺酰基氧基) 双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯

[0092]

[0093] 在氮气环境下使用(1S,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-羟基-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(20.7 g, 0.5 mol, 参见WO03/104217/A2的合成细节)、4-二甲基氨基吡啶(10.4 g, 0.85 mol)、三乙胺(6.98 mL, 0.5 mmol)和对甲苯磺酰氯(10.6 g, 0.55 mol)的二氯甲烷(200 mL)装填2-颈圆底烧瓶，并在室温下搅拌混合物过夜。添加1N硫酸氢钾(200 mL)、水(100 mL)的溶液并萃取有机层。使用水(200 mL)、盐水(200 mL)洗涤，在硫酸镁上干燥、过滤并蒸发至干燥。添加四氢呋喃(30 mL)，然后庚烷(90 mL)。在60℃下加热混合物并缓慢添加更多庚烷(200 mL)。冷却混合物至室温。过滤固体并在减压下干燥以产生白色固体形式的标题化合物(24.6 g, 87%)。MS(m/z)：590(M+23)。

[0094] 制备2

[0095] (1R,2S,4R,5R,6R)-4-溴-2-(叔丁氧基羰基氨基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯

[0096]

[0097] 将三苯基膦(41.97 g, 158.4 mmol)溶于新鲜甲苯(660 mL)并添加溴(8.14 mL,158.4 mmol)直至黄色持续。在45 min时间内滴加(1S,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-羟基-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(32.75 g, 79.2 mmol)的甲苯(176 mL)和无水吡啶(528 mL)溶液。在75℃下搅拌反应过夜。冷却至室温，使用乙酸乙酯稀释，过滤并浓缩至干燥。在甲基叔丁基醚中将粗产物制浆，过滤以去除固体并浓缩滤液至干燥。通过使用己烷: 乙酸乙酯(0:100至80:20)洗脱的硅胶色谱(750 g)纯化粗产物以获得白色固体形式的标题化合物(29.52 g, 78 %)。MS(m/z)：498, 500(M+23)。

[0098] 制备3

[0099] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯

[0100]

[0101] 向(1R,2S,4R,5R,6R)-4-溴-2-(叔丁氧基羰基氨基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(2 g, 4.20 mmol)的二甲基甲酰胺(10 mL)溶液添加1H-1,2,4-三唑-3-硫醇(525 mg, 5.04 mmol)和碳酸钾(1.16 g, 8.4 mmol)。在80℃下搅拌混合物过夜。冷却至室温并使用乙酸乙酯稀释，使用10%柠檬酸和盐水洗涤，在无水硫酸钠上干燥，过滤并浓缩至干燥。通过使用己烷: 乙酸乙酯(80: 20至0:100)洗脱的硅胶色谱(80 g二氧化硅柱)纯化以获得标题化合物(1,64g, 78%)。MS(m/z)：497(M+1)。

[0102] 基本上按照制备3的方法从制备1或制备2制备表1中的下列化合物。

[0103] 表1

[0104]制备编号 化学名称 结构 物理数据M(m/z):
4 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(叔 丁 569(M+23)
氧基羰基氨基)-4-[[5-(二
氟 甲 基 )-4H-1,2,4- 三
唑-3-基]硫 烷基]双 环
[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二
叔丁基酯
5 (1R,2S,4R,5R,6R)-4-(5- 氨 512(M+1)。
基-[1,3,4]三唑-2-基硫烷
基)-2-叔丁氧基羰基氨基-双
环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
二叔丁基酯1
6 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(叔 丁 511(M+1)
氧基羰基氨基)-4-[(5-甲
基-4H-1,2,4-三唑-3-基)
硫 烷 基]双 环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
7 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(叔 丁 539(M+1)
氧基羰基氨基)-4-[(5-异丙
基-4H-1,2,4-三唑-3-基)
硫 烷 基]双 环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
8 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(叔 丁 537(M+1)
氧基羰基氨基)-4-[(5-环丙
基-4H-1,2,4-三唑-3-基)
硫 烷 基]双 环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
9 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔 丁 537(M+1)。
氧基羰基氨基)-4-[(5-环丙
基-4H-1,2,4-三唑-3-基)
硫 烷 基]双 环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
10 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔 丁 539(M+1)
氧基羰基氨基)-4-[(5-异丙
基-4H-1,2,4-三唑-3-基)
硫 烷 基]双 环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯2
11 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔 丁 511(M+1)
氧基羰基氨基)-4-[(5-甲
基-4H-1,2,4-三唑-3-基)
硫 烷 基]双 环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯2
12 (1R,2S,4S,5R,6R)-4-[(5- 氨 512(M+1)。
基-1H-1,2,4-三唑-3-基)
硫烷基]-2-(叔丁氧基羰
基 氨 基)双 环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯2

[0105] 1 反应中使用的碱为Na2CO3。

[0106] 2 通过微波加热反应。

[0107] 制备13

[0108] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-[[5-(三氟甲基)-1H-1,2,4-三唑-3-基]硫烷基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯

[0109]

[0110] 使用氮气吹扫(1R,2S,4R,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(2H-三唑-4-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(11.8 mg, 20.77 mmol)和1H-巯基-(三氟甲基)-4H-1,2,4-三唑钠盐(7.7 g, 38.5 mmol)的二甲基甲酰胺(100 mL)溶液并在70℃下搅拌过夜。冷却至室温，使用水稀释并使用乙酸乙酯萃取。使用水、盐水洗涤有机层，在硫酸镁上干燥并浓缩至干燥。通过使用异己烷: 乙酸乙酯(95:5至60:40)洗脱的快速柱色谱纯化以产生标题化合物(10.9 g, 93.5%)。MS(m/z)：587(M+23)。

[0111] 基本上按照制备13的方法制备表2中的下列化合物。

[0112] 表2

[0113]制备编号 化学名称 结构 物理数据M(m/z)
14 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰 519(M+23)
基氨基)-4-(2H-1,2,4-三唑-4-基
硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二
甲酸二叔丁基酯
15 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰 497(M+1)
基氨基)-4-(1H-1,2,3-三唑-5-基
硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二
甲酸二叔丁基酯2
16 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-( 叔 丁 氧 587(M+23)
基 羰基氨 基)-4-[[5-(三氟 甲
基)-1H-1,2,4-三唑-3-基]硫烷
基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
二叔丁基酯2
17 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-( 叔 丁 氧 569(M+23)
基 羰基氨 基)-4-[[5-(二氟 甲
基)-4H-1,2,4-三唑-3-基]硫烷
基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
二叔丁基酯
2

[0114] 通过微波加热反应。

[0115] 制备18

[0116] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯盐酸盐

[0117]

[0118] 使用(1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(4H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(3.7 g, 7.45 mmol)和乙醇(50 mL)装填圆底烧瓶。缓慢添加亚硫酰氯(2.71 mL, 37.25 mmol)(放热反应至45℃)并在80℃下搅拌混合物过夜。真空下去除溶剂以产生白色固体形式的标题化合物(2.8 g, 99%)。MS(m/z)：341(M+1)。

[0119] 基本上按照制备18的方法制备表3中的下列化合物。

[0120] 表3

[0121]制备编号 化学名称 结构 物理数据(MS(m/z)
19 (1R,2S,4R,5R,6R)-2- 氨 341(M+1), 363(M+23)
基 -4-(2H-[1,2,3] 三
唑-4-基硫烷基)-双环
[3.1.0]己烷-2,6-二甲
酸二乙酯盐酸盐
20 (1R,2S,4R,5R,6R)-2- 氨 409(M+1)
基 -4-(5- 三 氟 甲
基 -1H-[1,2,4] 三
唑-3-基硫烷基)-双环
[3.1.0]己烷-2,6-二甲
酸二乙酯盐酸盐

[0122] 制备21

[0123] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-[[-2-( 叔 丁 氧 基 羰 基 氨 基 ) 乙 酰 基 ] 氨基]-4-(4H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯

[0124]

[0125] 向(1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(4H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯盐酸盐(0.869 g, 2.31 mmol)添加四氢呋喃(11.5 mL)并使用冰水浴冷却混合物至0-5℃。添加2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(404.9 mg, 2.31 mmol)和(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)乙酸(0.404 g, 2.31 mmol)。缓慢添加N-甲基吗啉(0.55 mL, 5.07 mmol)并搅拌2小时。过滤混合物并使用四氢呋喃洗涤白色固体。丢弃固体并浓缩溶液至干燥。通过OASIS® HLB盒(负载于DMSO中并使用碳酸氢铵缓冲溶液pH=9 / 乙腈梯度洗脱)纯化。使用3:1(碳酸氢铵/乙腈)洗脱目标化合物。去除溶剂。在二氯甲烷中溶解剩余物并使用水洗涤。丢弃水相。在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥以产生白色固体形式的标题化合物(440 mg, 38%)。MS(m/z)：498(M+1), 520(M+23)。

[0126] 制备22

[0127] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-((S)-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酰基氨基)-4-(4H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯

[0128]

[0129] 在二氯甲烷(9 mL)中混合(1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(4H-1,2,4- 三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯盐酸盐(354 mg, 0. 894 mmol)、(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸(257 mg, 1.34 mmol)、4-二甲基氨基吡啶(10.92 mg,89 µmol)、1-羟基苯并三唑水合物(219 mg, 1.41 mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(208 mg, 1.34 mmol)并添加三乙胺(373 µL, 2.68 mmol)。在氮气环境下，在室温下搅拌混合物过夜。使用10%柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤。丢弃水层，通过硅藻土盒过滤有机层并在真空下去除溶剂。通过使用二氯甲烷: 甲醇(1-15%)洗脱的快速色谱纯化以产生标题化合物(412.5mg, 90.2%)。MS(m/z)：552(M+1),
534(M+23)。

[0130] 基本上按照制备22的方法制备表4中的下列化合物。

[0131] 表4

[0132]制备编号 化学名称 结构 物理数据MS(m/z)
23 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-((S)-2- 叔 丁 554(M+1), 576(M+23)
氧基羰基氨基-4-甲基-戊酰基氨
基)-4-(4H-[1,2,4]三 唑-3-基 硫 烷
基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙
酯
24 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-((S)-2-叔 丁 氧 572(M+1), 594(M+23)
基羰基氨基-4-甲基硫烷基-丁酰基氨
基)-4-(4H-[1,2,4]三 唑-3-基 硫 烷
基)-双环[3.1.0]己烷-2, 6-二甲酸二乙
酯

[0133] 制备25

[0134] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[2-((S)-叔丁氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-4-(5-三氟甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯

[0135]

[0136] 在室温下，在无水二甲基甲酰胺(12 mL)中混合(1R,2S,4R,5R,6R)-2-氨基-4-(5-三氟甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯盐酸盐(657mg, 1.48mmol)、o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(730 mg, 1.92mmol)和(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸(363mg, 1.92mmol)，添加二异丙基乙胺(3.0 mL, 17.20mmol)并在氮气环境下在室温下搅拌混合物过夜。使用乙酸乙酯(60 mL)稀释反应混合物并使用饱和碳酸氢钠溶液(30 mL)洗涤。使用乙酸乙酯萃取水相。混合有机相，使用水(30 mL)和盐水(30 mL)洗涤。在无水硫酸钠上干燥有机相，过滤并在真空下去除溶剂。通过使用异己烷: 乙酸乙酯(95:5至10:90)洗脱的硅胶色谱(110 g二氧化硅柱)纯化以产生标题化合物(321 mg, 38%)。MS(m/z)：602(M+23)。

[0137] 基本上按照制备25的方法制备表5中的下列化合物。

[0138] 表5

[0139]制备编号 化学名称 结构 物理数据MS(m/z)
26 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[2-((S) 662(M+23)
-叔丁氧基羰基氨
基)-4-甲 基 硫 烷基-丁
酰基氨基]-4-(5-三氟甲
基-1H-[1,2,4]三 唑-3-基
硫烷基)-双环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸二乙酯
27 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(2- 叔 558(M+23)
丁氧基羰基氨基-乙酰
基 氨 基)-4-(5-三 氟 甲
基-1H-[1,2,4]三唑-3-基硫
烷基)-双环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸二乙酯
28 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[2-((S)- 520(M+23)
叔丁氧基羰基氨基)-丙酰
基 氨基]-4-(2H-[1,2,3]三
唑-4-基 硫 烷 基)-双 环
[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙
酯
29 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[2-((S)- 534(M+23)
叔丁氧基羰基氨基)-丙酰基氨
]-4-(2H-[1,2,3]三唑-4-基
硫烷基)-双环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸二乙酯
30 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[2-((S)- 572(M+1), 594(M+23)
叔丁氧基羰基氨基)-4-甲
基硫烷基-丁酰基氨
基]-4-(2H-[1,2,3]三唑-4-基
硫烷 基)-双环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸二乙酯

[0140] 制备31

[0141] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯

[0142]

[0143] 向(1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯盐酸盐(2.04 g, 5.41 mmol)的1,4-二氧杂环己烷(27.07 mL,317.02 mmol)悬浮液添加二碳酸二叔丁酯(2.39 g, 10.83 mmol)和碳酸钾(1.89 g,
13.53 mmol)。十分钟后，添加水(27.07 mL, 1.50 mol)并在室温下搅拌2天。去除二氧杂环己烷并使用乙酸乙酯稀释。分离层并在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩。获得白色固体形式的标题化合物(1.97g, 83%)。MS(m/z)：441(M+1)。

[0144] 制备32

[0145] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-[[-2-( 叔 丁 氧 基 羰 基 氨 基 ) 乙 酰 基 ] 氨基]-4-(4H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸

[0146]

[0147] 在四氢呋喃(7 mL)中溶解(1R,2S,4S,5R,6R)-2-[[-2-(叔丁氧基羰基氨基)乙酰基]氨基]-4-(4H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯(0.420 g, 0.84 mmol)，然后添加2.5M 氢氧化锂(6.7 mL, 16.88 mmol)。在室温下搅拌混合物3.5小时。用水稀释反应混合物并使用乙酸乙酯洗涤。丢弃有机层。使用1N 盐酸调整水相至pH=2并使用乙酸乙酯萃取。在硫酸镁上干燥有机相，过滤并浓缩至干燥以产生白色固体形式的标题化合物(250 mg, 66%)。MS(m/z)：442(M+1)，464(M+23)。

[0148] 基本上按照制备32的方法制备表6中的下列化合物。

[0149] 表6

[0150]制备编号 化学名称 结构 物理数据MS(m/z)
33 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-((S)-2-叔 456(M+1)
丁氧基羰基氨基-丙酰基氨
基)-4-(4H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷
基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
34 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-((S)-2-叔 丁 497(M+1)
氧基羰基氨基-4-甲基-戊酰基氨
基)-4-(4H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷
基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
35 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-((S)-2-叔丁氧 516(M+1)
基羰基氨基-4-甲基硫烷基-丁酰基
氨基)-4-(4H-[1,2,4]三唑-3-基硫
烷基)-双环[3.1.0]己烷-2, 6-二
甲酸
36 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[2-((S)-叔 546(M+23)
丁氧基羰基氨基)-丙酰基氨
基]-4-(5-三氟甲基-1H-[1,2,4]三
唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸3
37 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[2-((S)-叔丁 584(M+1)
氧基羰基氨基)-4-甲基硫烷基-丁酰
基氨基]-(5-三氟甲基-1H-[1,2,4]
三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸3
38 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(2-叔丁氧基 510(M+1), 532(M+23)
羰基氨基-乙酰基氨基)-4-(5-三氟
甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷
基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
3
39 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(2-叔丁氧基羰 442(M+1), 464(M+23)
基氨基-乙酰基氨基)-4-(2H-[1,2,3]
三唑-4-基硫烷基)-双环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸3
40 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[2-((S)-叔 456(M+1), 478(M+23)
丁氧基羰基氨基)-丙酰基氨
基]-4-(2H-[1,2,3]三唑-4-基硫烷
基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
3
41 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[2-((S)-叔丁 516(M+1),
氧基羰基氨基)-4-甲基硫烷基-丁酰
基氨基]-4-(2H-[1,2,3]三唑-4-基
硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二
甲酸3

[0151] 3 在反应中使用的碱为2.0M LiOH。

[0152] 制备42

[0153] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸

[0154]

[0155] 向(1R,2S,4S,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯(1.9 g, 4.31 mmol)的四氢呋喃(20 mL)添加2.5M氢氧化锂水溶液(20.70 mL, 51.76 mmol)并在室温下搅拌过夜。蒸发四氢呋喃。使用水稀释并使用乙酸乙酯洗涤。丢弃有机层。使用5M盐酸调整水相至pH=2并使用乙酸乙酯萃取。分离层并在硫酸镁上干燥有机物，过滤并浓缩。获得白色固体形式的标题化合物(1.58g, 95%)。MS(m/z)：385(M+1)。

[0156] 制备43

[0157] (1S,2S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-氧代-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸

[0158]

[0159] 向搅拌的(1S,2S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-氧代-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁酯(2.0 g, 4.86 mmol)的四氢呋喃(24.3 mL)和乙醇(9.72 mL)溶液添加2.5M 氢氧化钠(15.55 mL, 38.88 mmol)。加热反应混合物至60℃并保持搅拌过夜。继续加热4小时，然后使用乙酸乙酯洗涤。在冰浴中冷却水相并使用1N 盐酸溶液酸化至pH=2-3。使用乙酸乙酯萃取(3次)，在硫酸钠上干燥有机物，过滤并浓缩以产生橙色固体形式的标题化合物(1.4 g, 96%)。MS(m/z)：322(M+23)。

[0160] 制备44

[0161] (1S,2S,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-氧代-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二苄酯

[0162]

[0163] 向搅拌的(1S,2S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-氧代-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸(7.27 g, 24.3 mmol)和碳酸铯(15.83 g, 48.6 mmol)的干燥N,N-二甲基甲酰胺(60 mL)悬浮液滴加溴苄(8.69 mL, 72.9 mmol)。在氮气下，在室温下搅拌生成的混合物过夜。使用水淬灭并使用乙酸乙酯稀释。使用乙酸乙酯萃取水相(3次)并使用盐水和水洗涤有机层。在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩以产生浅褐色油状物形式的粗产物。通过使用乙酸乙酯: 己烷(20:80至30:70)洗脱的快速色谱纯化以产生粘性黄色泡沫形式的标题化合物(9.15 g, 78.5%)。MS(m/z)：502(M+23)。

[0164] 制备45

[0165] (1S,2S,4S,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-羟基-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二苄酯

[0166]

[0167] 在-78℃下，向搅拌的(1S,2S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-氧代-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸双[(苯基)甲基]酯(9.15 g, 19.08 mmol)的四氢呋喃(20 mL)溶液滴加1M 三仲丁基硼氢化锂(L-selectride)溶液的THF(30 mL, 30 mmol)。在氮气下搅拌生成的橙色混合物1小时45分钟。在-78℃下使用饱和碳酸氢钠溶液淬灭。使用水和乙酸乙酯稀释。分离层并使用盐水和水洗涤有机相。在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩至干燥以产生浅黄色油状物形式的粗产物。通过使用乙酸乙酯: 己烷(20:80至50:50)洗脱的快速色谱纯化合并的物质以产生单一异构体形式的标题产物(9.19 g, 100%)。MS(m/z)：504(M+23)。

[0168] 制备46

[0169] (1S,2S,4S,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(甲苯-4-磺酰基氧基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二苄酯

[0170]

[0171] 基本上根据制备1的方法制备标题产物(75%产率)。MS(m/z)：658(M+23)。

[0172] 制备47

[0173] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(1H-[1,2,3]三唑-4-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二苄酯

[0174]

[0175] 向搅拌的(1S,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(对甲苯磺酰氧基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二苄酯(0.6 g, 0 943 mmol)的无水二甲基甲酰胺(8 mL)溶液添加1H-5-巯基-1,2,3-三唑钠盐二水合物(0.174 g, 1.42 mmol)并在70℃下加热过夜。使用乙酸乙酯(60 mL)稀释反应混合物并使用NaHCO3(30 mL)和盐水(30 mL)洗涤有机层，在无水Na2SO4上干燥，浓缩并通过使用 0-60%的乙酸乙酯的异己烷洗脱的硅胶色谱(40 g二氧化硅柱)纯化以产生无色胶状物形式的标题化合物(0.405 g,76%产率)。MS(m/z)：587(M+23)。

[0176] 制备48

[0177] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸双(4-甲氧基-苄基)酯

[0178]

[0179] 搅拌(1R,2S,4S,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸(369 mg, 0.959 mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(0.985 g, 2.59 mmol)、二异丙基乙胺(0.920 mL)的二氯甲烷(9.60 mL)悬浮液15 min。然后，添加4-甲氧基苯甲醇(0.365 g,2.59 mmol)并在室温下搅拌过夜。去除溶剂并通过使用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱的硅胶色谱(12 g硅胶盒)纯化以提供标题化合物(240 mg, 40%)。MS(m/z)：625(M+1)。

[0180] 基本上按照制备48的方法制备表7中的下列化合物。

[0181] 表7

[0182]制备编号 化学名称 结构 物理数据MS(m/z)
49 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-( 叔 701(M+1)
丁氧 基羰基氨
基 )-4-(1H-1,2,4- 三
唑-3-基硫烷基)双环
[3.1.0]己烷2,6-二甲酸双
[[3-(三氟甲基)苯基]甲
基]酯

[0183] 制备50

[0184] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸双(2,2-二甲基丙酰氧基甲基)酯

[0185]

[0186] 向(1R,2S,4S,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸(0.300 g, 0.780 mmol)的3 mL的干燥二甲基甲酰胺溶液添加碳酸氢钠(0.393 g, 4.68 mmol)、碘化钠(0.351 g, 2.34 mmol)和丙酸2,2-二甲基-氯甲酯(352.60 mg, 2.34 mmol)。搅拌生成的不均匀混合物18 h。真空下去除溶剂，添加水并使用乙酸乙酯萃取。分离层并在硫酸镁上干燥有机物，过滤并浓缩。通过5 g使用50% 己烷: 乙酸乙酯混合物洗脱的Phenomenex STRATA™正相盒纯化粗产物以提供标题化合物(96 mg, 20%)。MS(m/z)：613(M+1)。

[0187] 制备51

[0188] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸2-叔丁基-6-乙酯盐酸盐

[0189]

[0190] 向(1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-4,6-二甲酸二叔丁酯(1.3 g, 2.62 mmol)的乙醇(9.14 mL)溶液滴加乙酰氯(1.12 mL, 15.71 mmol)。在密封管中，在50℃下加热混合物2小时。去除溶剂以提供标题化合物(950 mg, 90%)。MS(m/z)：369(M+1)。

[0191] 制备52

[0192] (1R,2S,4S,5R,6R)-4-氨基-6-乙氧基羰基-2-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-4-甲酸盐酸盐

[0193]

[0194] 在氯化氢气体的乙酸乙酯(8 mL)饱和溶液中溶解(1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸2-叔丁基-6-乙酯盐酸盐(946 mg, 2.34 mmol)并在室温下搅拌25小时。去除溶剂以提供标题化合物(831 mg, 101%)。MS(m/z)：313(M+1)。

[0195] 制备53

[0196] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-6-乙氧基羰基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2-甲酸

[0197]

[0198] 向(1R,2S,4S,5R,6R)-4-氨基-6-乙氧基羰基-2-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-4-甲酸盐酸盐(740 mg, 2.12 mmol)的1,4-二氧杂环己烷(10.61 mL)悬浮液添加二碳酸二叔丁酯(935.39 mg, 4.24 mmol)和碳酸钾(888.5 mg, 6.36 mmol)。在室温下搅拌混合物。十分钟后，添加水(10.61 mL)并在室温下搅拌2天。去除二氧杂环己烷并使用乙酸乙酯稀释，使用5M HCl调整pH酸性。分离层并在硫酸镁上干燥有机物，过滤并浓缩以提供标题化合物(270 mg, 31%)。MS(m/z)：413(M+1)。

[0199] 制备54

[0200] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸2-苄基-6-乙酯

[0201]

[0202] 在室温下搅拌(1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-6-乙氧基羰基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2-甲酸(270 mg, 0.654 mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(0.373 g, 0.982 mmol)、二异丙基乙胺(0.342 mL, 1.96 mmol)的二氯甲烷(6.55 mL)悬浮液15分钟并添加苄醇(0.101 mL, 0.982 mmol)。在室温下搅拌过夜。去除溶剂并首先通过二氧化硅柱色谱(4 g硅胶盒，二氯甲烷/甲醇梯度洗脱(使用6%的甲醇洗脱目标化合物)纯化，其次通过使用3:1 乙腈/水洗脱的Waters OASIS® HLB盒纯化。获得白色固体形式的标题化合物(100 mg, 30%)。MS(m/z)：503(M+1)。

[0203] 实施例1

[0204] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-氨基-4-(2H-[1,2,3]三唑-4-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸盐酸盐

[0205]

[0206] 向搅拌的(1R,2S,4R,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(2H-[1,2,3]三唑-4-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁酯(194 mg, 0.39 mmol)的二氯甲烷(30 mL)溶液添加二溴化锌(0.88 g, 3.91 mmol)。在50℃下搅拌过夜。添加更多的二溴化锌(0.44 g, 1.95 mmol)并在50℃下持续搅拌直至起始材料完全消耗。蒸发溶剂并在50℃下在2M 盐酸水溶液(5mL)中搅拌剩余物直至仅存在目标产物。冷却反应混合物并通过阳离子交换色谱(DOWEX® 50WX8-100)纯化剩余物。使化合物以约1滴每1-2秒的滴速流过柱。在初始的负载体积降至树脂表面后，使用水(5 mL至10 mL)冲洗并重复3次。监测流出物的pH并用水持续冲洗直至完全应用(观察到的pH循环: 来自柱的流出物最初处于pH=7，然后降至pH=1并返回至pH=7)。使用至少一个柱体积的下列的每一个：水、水: 四氢呋喃(1:1)然后水洗涤柱。使用10%吡啶: 水置换来自树脂中的产物。使用10%吡啶: 水继续洗脱直至检测没有另外的产物。浓缩包含产物的级分以获得无色固体。干燥固体。在2M 盐酸中溶解并蒸发以提供白色固体形式的标题化合物(94 mg, 75%)。MS(m/z)：285(M+1)。

[0207] 基本上按照实施例1的方法制备表8中的下列化合物。

[0208] 表8

[0209]

[0210] 4 从阳离子交换色谱中直接分离最终化合物并浓缩至干燥。

[0211] 实施例8

[0212] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-氨基-4-(5-二氟甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸盐酸盐

[0213]

[0214] 向氯化氢(4M的二氧杂环己烷)溶液添加(1R,2S,4R,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-[[5-(二氟甲基)-4H-1,2,4-三唑-3-基]硫烷基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁酯(0.356 g, 651.3 µmol)的1,4-二氧杂环己烷(1.63 mL)。伴随搅拌加热混合物至50℃。在加热开始后固体立刻从溶液中沉淀出。冷却反应混合物并在减压下浓缩。通过在40 mL/分钟的流速下使用0-20% 盐酸(0.01 M水溶液)的乙腈梯度洗脱的硅胶色谱(40 g SiO2)纯化剩余物时间为60分钟。在减压下浓缩以提供油状物形式的粗产物。
使用相同条件再纯化。在减压下浓缩以提供白色固体形式的标题化合物(0.196 g, 93%)。
MS(m/z)：335(M+1)。

[0215] 基本上按照实施例8的方法制备表9中的下列化合物。

[0216] 表9

[0217]实施例编号 化学名称 结构 物理数据MS(m/z)
9 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-{[5-(二氟 335(M+1)
甲基)-4H-1,2,4-三唑-3-基]硫烷基}双
环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸盐酸盐

[0218] 实施例10

[0219] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸

[0220]

[0221] 向(1R,2S,4S,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁酯(1.64 g, 3.30 mmol)的1,4-二氧杂环己烷(20 mL)溶液添加4M 氯化氢的1,4-二氧杂环己烷(20 mL)并在50℃下摇动混合物过夜。浓缩至干燥。通过阳离子交换(DOWEX® Marathon C, Na+形强酸性)纯化。在最少量的水中溶解剩余物以溶解物质并负载在树脂上。相继使用2柱体积的水，然后2柱体积的水: 四氢呋喃(1:1)和2柱体积的水洗涤树脂。使用2柱体积的10% 吡啶的水洗脱目标产物以提供白色固体形式的标题化合物。MS(m/z)：285(M+1)。1H NMR(300 MHz, D2O)：4,25(d, J=7,3 Hz, 1H), 2,53-2,38(m, 3H), 2,23(dd, J= 8,1, 16,1 Hz, 1H), 1,95(t, J= 3,3 Hz, 1H)。

[0222] 基本上按照实施例10的方法制备表10中的下列化合物。

[0223] 表10

[0224]实施例编号 化学名称 结构 物理数据MS(m/z)
11 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-三 285(M+1)
唑-4-基硫烷基)双环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸盐酸盐5
12 (1R,2S,4S,5R,6R)-2- 氨 353(M+1)
基-4-[[5-(三氟甲基)-1H-1,2,4-三
唑-3-基]硫烷基]双环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸盐酸盐5

[0225] 5 向生成的溶液添加2 M HCl并在减压下浓缩。

[0226] 实施例13

[0227] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-氨基-4-[(5-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)硫烷基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸

[0228]

[0229] 溶解(1R,2S,4R,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-[(5-甲基-4H- 1,2,4-三唑-3-基)硫烷基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁酯(85 mg, 0.166 mmol)、乙酸(1 mL)和水(1 mL)。在BIOTAGE® Initiator微波中在约40瓦下加热混合物至160℃时间为6分钟。在减压下浓缩反应混合物。添加水并在减压下去除两次以去除过量的乙酸从而提供白色固体形式的标题化合物(40 mg, 88.6%)。MS(m/z)：299(M+1)。

[0230] 基本上按照实施例13的方法制备表11中的下列化合物。

[0231] 表11

[0232]实施例编号 化学名称 结构 物理数据MS(m/z)
14 (1R,2S,4R,5R,6R)-2- 氨 327(M+1)
基 -4-{[5-(1- 甲 基 乙
基)-4H-1,2,4-三唑-3-基]硫烷
基}双环[3.1.0]己烷-2,6-二
甲酸
15 (1R,2S,4R,5R,6R)-2- 氨 325(M+1)
基-4-[(5-环丙基-4H-1,2,4-三
唑-3-基)硫烷基]双环[3.1.0]
己烷-2,6-二甲酸

[0233] 实施例16

[0234] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- 氨 基 丙 酰 基] 氨 基 -4-[[5-( 三 氟 甲基)-1H-1,2,4-三唑-3-基]硫]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸盐酸盐

[0235]

[0236] 使用盐酸水溶液(2M, 7 mL)处理(1R,2S,4R,5R,6R)-2-[2-((S)-叔丁氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-4-(5-三氟甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸(340 mg, 0.65 mmol)并在室温下搅拌过夜。浓缩反应混合物至干燥并通过阳离子交换色谱(DOWEX® 50WX8-100)纯化剩余物。在水中溶解化合物并调整至pH=2。使化合物以约1滴每1-2秒的滴速流过柱。在初始的负载体积降至树脂表面后，使用水(5 mL至10 mL)冲洗并重复3次。监测流出物的pH并用水持续冲洗直至完全应用(观察到的pH循环: 来自柱的流出物最初处于pH=7，然后降至pH=1并返回至pH=7)。使用至少一个柱体积的下列的每一个：水、水: 四氢呋喃(1:1)然后水洗涤柱。使用10%吡啶: 水置换来自树脂中的产物。使用10%吡啶: 水继续洗脱直至没有另外的产物洗脱。浓缩包含产物的级分以获得无色固体(204 mg)。在水中溶解固体，添加2M 盐酸(1.5 eq)并冻干溶液
48小时以提供白色固体形式的标题化合物(225 mg, 75.4%)。MS(m/z)：424(M+1)。

[0237] 基本上按照实施例16的方法制备表12中的下列化合物。

[0238] 表12

[0239]实施例编号 化学名称 结构 物理数据MS(m/z)
17 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-((S)-2-氨 484(M+1)
基-4-甲基硫烷基-丁酰基氨
基)-4-(5-三氟甲基-1H-[1,2,4]三
唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸盐酸盐
18 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(甘 氨 411(M+1)
酰 基 氨 基)-4-{[5-(三 氟 甲
基)-1H-1,2,4-三唑-3-基]硫烷
基}双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
盐酸盐
19 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-氨 356(M+1)。
基丙酰基]氨基]4-(2H-1,2,3-三
唑-4-基硫烷基)双环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸盐酸盐
20 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(2-氨基-乙 342(M+1),
酰 基 氨 基)-4-(2H-[1,2,3]三 364(M+23)
唑-4-基硫烷基)-双环[3.1.0]己
烷-2,6-二甲酸盐酸盐
21 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-((S)-2-氨 416(M+1),438(M+23)
基-4-甲基硫烷基-丁酰基氨
基)-4-(2H-[1,2,3]三唑-4-基硫烷
基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲
酸盐酸盐

[0240] 实施例22

[0241] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-[(-2-氨基乙酰基)氨基]-4-(4H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸盐酸盐

[0242]

[0243] 在氯化氢气体的乙酸乙酯(7 mL)饱和溶液中溶解(1R,2S,4S,5R,6R)-2-[[-2-(叔丁氧基羰基氨基)乙酰基]氨基]-4-(4H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸(220 mg, 0.49 mmol)并在室温下搅拌2小时。去除溶剂以提供白色固体形式的标题化合物(180 mg, 98%)。MS(m/z)：342(M+1)。

[0244] 基本上按照实施例22的方法制备表13中的下列化合物。

[0245] 表13

[0246]实施例编号 化学名称 结构 物理数据MS(m/z)
23 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-(L-丙氨酰基 356(M-+1),
氨基)-4-(4H-1,2,4-三唑-3-基硫 378(M-+23)
烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲
酸盐酸盐
24 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-(L-亮氨酰基 398(M-+1)
氨基)-4-(4H-1,2,4-三唑-3-基硫
烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲
酸盐酸盐
25 (1R,2S,4S,5R,6R)-2-(L-甲硫氨酰 416(M-+1)
基氨基)-4-(4H-1,2,4-三唑-3-基
硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二
甲酸盐酸盐

[0247] 实施例26

[0248] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-[1,2,3]三唑-4-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二苄酯盐酸盐

[0249]

[0250] 向(1R,2S,4R,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(1H-[1,2,3]三唑-4-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二苄酯(0.4 g, 0.71 mmol)的二氯甲烷(12 mL)溶液添加三氟乙酸(3 mL, 40 mmol)并在室温下搅拌4.5 h。在减压下浓缩反应混合物，在乙腈(10 mL)中溶解并负载在10 g SCX-2盒(使用乙腈预处理的)上。使用乙腈(20 mL)洗涤盒，然后使用90:10 v/v 乙腈/氢氧化铵溶液(5 × 20 mL级分)洗脱。蒸发包含产物的级分并通过使用90:10:1 二氯甲烷/甲醇/氢氧化铵洗脱的硅胶色谱(12 g二氧化硅柱)纯化以获得无色胶状物形式的产物游离碱。在二氯甲烷(10 mL)中溶解胶状物，添加盐酸(0.25 mL的2M 乙醚溶液；0.5 mmol)，并蒸发溶剂以获得白色固体形式的标题化合物(0.2 g, 56.3%)。MS(m/z) 465(M+1)。

[0251] 实施例27

[0252] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二苄酯

[0253]

[0254] 在密封管中，向搅拌的(1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁酯(1.00g, 2.01 mmol)的苄醇(0.15 M)溶液添加对甲苯磺酸(5 eq)。在80℃下伴随搅拌加热反应混合物4天。冷却反应混合物至室温。通过SCX-2柱(10 g)预纯化。在使用甲醇预处理的柱上负载反应混合物，使用甲醇(×3)洗涤以去除过量的相应的苄醇，并使用2N 氨水的甲醇溶液洗脱。减压下蒸发溶剂以提供油状物。将生成的油状物溶于乙酸乙酯并使用饱和碳酸钠溶液洗涤以去除反应中形成的单酯。干燥并浓缩有机层以提供油状物。通过使用二氯甲烷/2N 氨水:甲醇(98:2)洗脱的快速色谱纯化油状物以产生固体形式的标题化合物(270 mg, 28%) MS(m/z)：465(M+1)。

[0255] 基本上按照实施例27的方法制备表14中的下列化合物。

[0256] 表14

[0257]实施例编号 化学名称 结构 物理数据MS(m/z)
28 (1R,2S,4S,5R,6R)-2- 氨 601(M+1)
基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷
基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
双[[4-(三氟甲基)苯基]甲基]酯

[0258] 实施例29

[0259] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸双[[2-(三氟甲基)苯基]甲基]酯盐酸盐

[0260]

[0261] 在密封管中，向搅拌的(1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁酯(500 mg, 1.01 mmol)的2-三氟甲基苄醇(30 eq)添加对甲苯磺酸(3 eq)。在88℃下伴随搅拌加热反应混合物4小时。冷却反应混合物至室温。在使用甲醇预处理的SCX-2柱(10 g)上负载反应混合物，使用甲醇(×3)洗涤以去除过量的相应的苄醇，并使用2N 氨水的甲醇溶液洗脱。减压下蒸发溶剂以提供油状物。使用乙酸乙酯处理油状物产生固体沉淀，其为单酯。过滤固体并在减压下浓缩滤液以产生油状物。通过使用二氯甲烷: 甲醇(95:5)洗脱的快速色谱纯化油状物以提供油状物形式的标题化合物(40 mg, 6%)。

[0262] 在氯化氢气体的乙酸乙酯(1 mL)饱和溶液中溶解(1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸双[[2-(三氟甲基)苯基]甲基]酯(0.07 mmol)。在室温下搅拌混合物(30 min)。减压下去除溶剂并在50℃的真空烘箱中干燥生成的固体过夜(30 mg, 65%) MS(m/z)：601(M+1)。

[0263] 基本上按照实施例29的方法制备表15中的下列化合物。

[0264] 表15

[0265]实施例编号 化学名称 结构 物理数据
MS(m/z)
30 (1R,2S,4S,5R,6R)-2- 氨 537(M+1)
基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷
基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
双[(2,4-二氟苯基)甲基]酯盐酸
盐
31 (1R,2S,4S,5R,6R)-2- 氨 525(M+1)
基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷
基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
双[(3-甲氧基苯基)甲基]酯盐酸
盐
32 (1R,2S,4S,5R,6R)-2- 氨 501(M+1)
基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷
基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
双[(2-氟苯基)甲基]酯盐酸盐
33 (1R,2S,4S,5R,6R)-2- 氨 501(M+1)
基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷
基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
双[(3-氟苯基)甲基]酯盐酸盐
34 (1R,2S,4S,5R,6R)-2- 氨 501(M+1)
基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷
基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
双[(4-氟苯基)甲基]酯盐酸盐

[0266] 实施例35

[0267] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸双(4-甲氧基苄基)酯

[0268]

[0269] 在氯化氢气体的乙酸乙酯(0.5 mL)饱和溶液中溶解(1R,2S,4S,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸双(4-甲氧基-苄基)酯(102 mg, 163.3 µmol)并在室温下搅拌10 min。去除溶剂。在使用乙腈预处理的SCX柱上负载反应混合物，使用乙腈(×2)洗涤，然后使用2N 氨水的甲醇 : 乙腈溶液(2柱体积)洗脱，然后在减压下蒸发溶剂。通过使用梯度为二氯甲烷/ 6% 2N 氨水的甲醇溶液洗脱的硅胶色谱(4 g)纯化粗剩余物以提供标题化合物(30 mg, 37%)。MS(m/z)：525(M+1)。

[0270] 实施例36

[0271] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸双[3-(三氟甲基)苄基]酯盐酸盐

[0272]

[0273] 将(1R,2S,4S,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸双(3-三氟甲基-苄基)酯(200 mg,285 µmol) 溶于氯化氢气体的乙酸乙酯(2 mL)饱和溶液中并在室温下搅拌。在2h后，完全转化为目标产物。因此，真空去除溶剂。使用乙酸乙酯洗涤固体并在50℃下真空干燥过夜以提供标题，0.17 g( 94%) , %)。 MS(m/z)：601 (M+1)。

[0274] 实施例37

[0275] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸双(2,2-二甲基-丙酰氧基甲基)酯

[0276]

[0277] 在氯化氢气体的乙酸乙酯(2 mL)饱和溶液中溶解(1R,2S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸双(2,2-二甲基丙酰氧基甲基)酯(98 mg, 156 µmol)并在室温下搅拌2小时。去除溶剂。获得白色固体的目标化合物(68 mg, 79%)。 MS(m/z)：399(M+1)。

[0278] 实施例38

[0279] (1R,2S,4S,5R,6R)-2-氨基-4-(1H-1,2,4-三唑-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸4-苄基-6-乙酯盐酸盐

[0280]

[0281] 在氯化氢气体的乙酸乙酯(2 mL)饱和溶液中溶解2(1R,2S,4S,5R,6R)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-(1H-[1,2,4]三唑-3-基硫烷基)-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸2-苄基-6-乙酯(78 mg, 155.20 µmol)并在室温下搅拌2小时。去除溶剂。获得白色固体形式的标题化合物(60 mg, 91%)。MS(m/z)：403(M+1)。

[0282] mGlu受体是调节神经元兴奋性的G-蛋白-偶联受体。尽管失调的谷氨酸神经传递与精神分裂症有关，但所有常用的处方抗精神病药对多巴胺受体起作用。许多研究支持II组 mGlu受体(其包括mGlu2、mGlu3或二者)激活用于治疗精神分裂症。特别地，最近数据表明mGlu2/3受体激动剂具有抗精神病药物特性并且可对精神分裂症的治疗提供新的替代物(Patil等人，Nature Medicine(2007) 13(3), 1102-1107)。使用基因敲除小鼠的临床前研究表明mGlu2/3激动剂的抗精神病药物样活性主要是mGlu2介导的。另外的临床前功效模型表明mGlu2/3受体激动剂的抗焦虑药、抗抑郁药和神经保护特性。因此，mGlu2激动剂可用于精神病学病症的治疗如躁郁症、精神分裂症、抑郁症和广泛性焦虑症。

[0283] 人mGlu2激动剂FLIPR®试验

[0284] 衍生自Syrian仓鼠成纤维细胞并且稳定表达人mGlu2受体并且与大鼠谷氨酸转运体EAAT 1(兴奋性氨基酸转运体1)和Gα15亚基一起共转染的AV-12细胞系用于这些研究。Gα15的表达允许Gi-偶联受体通过磷脂酶C通路发信号，导致通过荧光钙反应检验检测受体激活的能力。通过在具有高葡萄糖和盐酸吡哆醇，其补充有5%透析胎牛血清、1 mM 丙酮酸钠、10 mM HEPES [4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸]、1 mM的L-谷氨酰胺和5 µg/mL 杀稻瘟素(所有培养基购自Invitrogen)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中培养来维持细胞系。使用不含酶的裂解溶液(Chemicon S-004-B)每两周一次地传代汇合培养物。在试验之前24小时收获细胞并使用Matrix Well-Mate细胞播种机以
85,000(mGlu2)或115,000(mGlu3)细胞每孔将其于仅包含250(mGlu2)或125(mGlu3) µM L-谷氨酰胺(新添加的)的培养基中分配至96-孔、黑壁、聚-D-赖氨酸-涂覆的板(BD BioCoat #354640)。

[0285] 使用荧光成像读板仪(FLIPR®, Molecular Devices)检测添加化合物之前和之后的细胞内钙水平。试验缓冲液由补充有20 mM HEPES的汉克氏缓冲盐溶液(HBSS；Sigma)组成。去除培养基并在25℃下，使用在试验缓冲液中的8 µM 氟-3AM(Molecular Probes，F-1241；50 µL每孔)将细胞孵育90分钟。去除染色溶液并使用新鲜试验缓冲液(50 µL每孔)替换。在各个实验之前进行用于激动剂谷氨酸(Fisher A125-100)的产生11-点浓度反应曲线(在10 µM开始的3×稀释液)的单一添加FLIPR®试验以确定典型的EC50反应。使用PRISM® v4.03(GraphPad软件)分析结果。使用在25 µM的最终浓度开始的3×稀释液，使用10-点浓度反应曲线在单一添加的FLIPR®试验中测试本发明的实施例化合物。将本发明的实施例化合物溶解为在0.1N NaOH中的10 mM原液并在-20℃下储存。通过三倍稀释液系列将它们稀释至试验缓冲液。在FLIPR®仪器上读取最初5-秒荧光读数后，将本发明的化合物加入至细胞板(50 µL每孔)。对于最初30秒收集每一秒的数据，然后收集每
3秒的数据达总计90秒以检测激动剂活性。将最大反应定义为由ECmax(100 µM谷氨酸)诱导的。以在没有谷氨酸下检测的基础荧光性校正的相对荧光单位(RFUs)形式，检测作为最大峰高度减去最小峰高度的化合物功效。使用单一板进行测定。将激动剂功效量化为相对于最大谷氨酸反应的由单独的化合物诱导的刺激百分比。使用四参数对数曲线拟合程序(ACTIVITY BASE ® v5.3.1.22)以相对EC50值形式计算所有数据。

[0286] 基本上如上所述测试本文的实施例化合物并且在hMGLUR2 FLIPR®试验中显示低于 0.5 μM的相对EC50值。

[0287] 基本上如上所述测试表16中的下列实施例化合物并且显示下列活性：

[0288] 表16

[0289]

[0290] 这些数据概述了在hmGlu2 FLIPR®试验中对于官能性激动剂活性的表16化合物的活性并且证实了化合物是mGlu2激动剂。

[0291] 大鼠中苯环利定(PCP)-诱导的运动过度(Hyperlocomotor)活动的逆转[0292] NMDA受体拮抗剂如克他命或苯环利定(PCP)的给药产生与在患有精神分裂症的患者中观察到的那些症状相似的人类中的拟精神病样效应。药物逆转NMDA拮抗剂的运动刺激效应的能力常用作精神病的动物模型，表明对于检测精神分裂症和躁郁症用药物的临床功效的良好预测有效性。

[0293] 通过将单个雄性、Sprague-Dawley (Harlan, Indianapolis, IN)大鼠放置在具有1 cm深的木片作为垫草和笼顶部的金属格栅，尺寸为45 × 25 × 20 cm的透明、塑料鞋盒笼中监测运动活动。运动监测器(Kinder Scientific)由高度为5 cm的以8 × 4 格式布置的12光束的矩形架(或15×7模式的22的高密度分组)，和高度为15 cm的第二个架(用于检测养育行为)组成。鞋盒笼放置在这些架的内部，所述架在3英尺高的单独空间中的台面上。在5 mg/kg攻击剂量的苯环利定(PCP)之前30分钟在0.3 - 10 mg/kg的范围内给予本发明的化合物(腹膜内途径(i.p.)，非前药)。在5 mg/kg攻击剂量的PCP之前4小时在过夜禁食的大鼠中在0.3 - 30 mg/kg的范围内给予本发明的化合物(口服途径，前药)。在测试当天，将大鼠放置在测试笼中并在PCP攻击之前使其适应30分钟；在PCP给药后，监测大鼠另外60分钟。

[0294] 使用GraphPad PRISM®(San Diego, CA. USA)进行数据分析和ED50计算。功效(Power)分析确定需要8-10只大鼠每组以具有合适的统计学功效用于检测治疗差异(功效 = 0.8)。在总共60分钟运动活动上进行具有Dunnett事后多重比较试验的单因素方差分析(ANOVA)。使用在各个剂量的百分比逆转转换数据上拟合的非线性回归曲线进行ED50计算。

[0295] 基本上如上所述运行，在该试验中检测实施例10的化合物及其相应的前药(实施例25)，分别导致ED50值为 0.9 mg/kg(i.p.给药)和6.4 mg/kg(口服给药)。这些结果表明在患有精神分裂症和躁郁症的患者中活性母体及其前药形式在该功效的药理学模型预测中显示强劲功效。

[0296] 小鼠中苯环利定(PCP)-诱导的运动过度(Hyperlocomotor)活动的逆转[0297] 基本上按照上面提供的大鼠试验中的苯环利定(PCP)-诱导的运动过度(Hyperlocomotor)活动的逆转进行小鼠中苯环利定(PCP)-诱导的运动过度活动的逆转的试验，使用小鼠代替大鼠并具有下面指出的变化。

[0298] 通过将单个雄性、ICR(CD-1) (Harlan, Indianapolis, IN)小鼠放置在具有0.5 cm深的木片作为垫草和笼顶部的塑料盖子，尺寸为45 × 25 × 20 cm的透明、塑料鞋盒笼中监测运动活动。运动监测器(Kinder Scientific)由高度为2.5 cm的以8 × 4 格式布置的12光束的矩形架(或15×7模式的22的高密度分组)组成。鞋盒笼放置在这些架的内部，所述架在3英尺高的单独空间中的台面上。在7.5 mg/kg攻击剂量的苯环利定(PCP)之前30分钟，尽管可使用较高剂量，但通常在0.3 - 30 mg/kg的范围内给予本发明的化合物(腹膜内途径，非前药)。在测试当天，将小鼠放置在测试笼中并在PCP攻击之前使其适应45分钟；在PCP给药后，监测小鼠另外60分钟。

[0299] 功效(Power)分析确定需要7-8只小鼠每组以具有合适的统计学功效用于检测治疗差异(功效 = 0.8)。

[0300] 在i.p.给药后，在实施例1、2、3和11上进行剂量反应实验。ED50值如下：实施例1 = 18.4 mg/kg；实施例2 = 14.4和14.3(2次独立实验)；实施例3 = 17.1 mg/kg；实施例11 = 1.2 mg/kg。最后，在10 mg/kg的单剂量后，实施例8逆转PCP-诱导的运动活动
52%。这些结果表明本发明范围内的实施例化合物是精神分裂症和躁郁症的有用药物。

[0301] 大鼠中应激诱导的高热的减轻

[0302] 高热即身体核心温度上升是已在许多哺乳动物包括人中可靠证实的对应激反应的普遍现象。在许多焦虑症中，高热出现作为病理学的一部分并且被认为是疾病的症状。认为减轻动物中应激诱导的高热的化合物适用于治疗人中的焦虑症。广泛性焦虑症是可使用这类化合物治疗的这类病症的实例。用于分析应激诱导的高热的常规和微创方法是通过直肠温度计检测体温和应激诱导的体温增加。测试重量为275 - 350 g的雄性Fischer F-344 大鼠(Harlan, Indianapolis, IN, USA)。使用可自由获取的食物和自动化水单独安置所有动物，并保持12 h 光/暗循环(在06:00灯亮)。在实验前，使动物禁食约12-18小时，其在光阶段期间进行。在实验之前一小时，以1 mL/kg的剂量体积，通过腹膜内(i.p.)的给药途径对大鼠给药。使用的媒介物为水，添加足够的NaOH以达到5-7的pH。mGluR5拮抗剂MTEP(3-[(2-甲基-1,3-噻唑-4-基)乙炔基]吡啶)和mGlu2/3激动剂LY317206用作质量对照，只要它们在该模型中产生可靠的功效。在给药后立即将大鼠送回至它们的栖息笼，并且实验者关闭灯并离开房间。在剩余的1小时预处理时间段将给药房间变黑。

[0303] 在预处理时间段之后，将大鼠单独带至灯火通明的邻近房间，在那里通过插入使®用矿物油润滑的直肠探针测定基线体温。使用具有PHYSITEMP RET-2大鼠直肠探针的®
PHYSITEMP BAT-12微探针温度计(Physitemp Instruments Inc., Clifton, NJ, USA)评价体温。将探针插入直肠约2 cm以检测核心体温(这是摄氏度形式的基线体温，T1)。10分钟后，记录第二次体温检测(T2)。将体温(T2 - T1)的差定义为应激诱导的高热反应。
将相对于媒介物反应，本发明化合物产生35%的应激诱导的高热反应的降低的剂量定义为T35剂量。

[0304] 在基本上如上所述运行的该试验中检测实施例10的化合物，其具有1.7 mg/kg的T35并且在10 mg/kg下最高应激诱导的高热的降低为75%。相比之下，MTEP(3 mg/kg)和LY317206(20 mg/kg)分别降低应激诱导的高热53%和32%。这些结果表明mGlu2激动剂活性在该应激诱导的焦虑的大鼠模型产生抗焦虑药样效应并且与报道的临床前(Imre(2007) CNS Drug Rev. 13: 444-464)和临床(Dunayevich等人，(2008) Neuropsychopharm. 33:1603-1610)研究中的mGlu2/3激动剂的抗焦虑药活性一致。这些结果表明mGlu2激动用于治疗焦虑症的潜在临床效用。

[0305] 啮齿动物中的强迫游泳试验

[0306] 啮齿动物强迫游泳测试试验被良好地表征并且显示用于检测目前用于重度抑郁症的药物的抗抑郁药样活性的良好预测有效性。在该试验中，具有声称的抗抑郁药样活性的机制减少短暂的无法避免的强迫游泳事件中的悬浮(immobility)。

[0307] 在小鼠(雄性，NIH-Swiss小鼠，20-25 g，Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)中进行强迫游泳试验。将小鼠放置在6 cm的22-25℃的水填充的透明塑料圆筒(直径10 cm；高度：25 cm)中6分钟。在6分钟试验的最后4 min 记录悬浮的持续时间。在试验之前60 min，按照腹膜内给药测试实施例2、3、8、11和12的化合物。丙咪嗪用作这些研究的阳性对照。在具有添加的最少的NaOH的水媒介物中配制化合物。悬浮耗费的时间量(定义为仅对保持受试者的头在水上必要的运动)是因变量并由不知道受试者的药物治疗的观察者记录。通过具有设置在0.05的α水平的Dunnett事后试验分析数据。计算ED60值(相对于媒介物对照的60%悬浮的量)以估计测试化合物的效力。

[0308] 在两个单独的实验中测试实施例2并产生9.8 mg/kg和4.2 mg/kg的ED60值。实施例3更有效并且估计ED60值小于3 mg/kg的最低测试剂量。实施例8的ED60为7.95 mg/kg。实施例11具有0.88 mg/kg的ED60；然而，在其中评价较高剂量(3 - 30 mg/kg)的第二次研究中失去功效。实施例12产生3.31 mg/kg的ED60。这些结果表明本发明范围内的化合物是抑郁症的潜在有用药物。

[0309] 体外PepT1 GlySar抑制筛选和IC50测定

[0310] 建立PepT1试验以检测氨基酸前药化合物与肠吸收转运体PepT1相互作用的能力。

[0311] 在5%CO2潮湿环境中在37℃下，使来源于人癌细胞(American Type Culture Collection)的HeLa细胞在包含10% 胎牛血清(FBS)、0.1 mM非必需氨基酸(NEAA)和100单位/mL青霉素（含100 µg/mL链霉素）的Hyclone培养基(Invitrogen, Cat# SH30243)中生长。细胞系用于多达40代，然后丢弃。在水浴中将1 mL小瓶中的冷冻细胞解冻1-2分钟并在37℃下加入至5 mL的细胞培养基。各个T-烧瓶装有8.5 mL的新鲜培养基和1.5 mL的细胞原液。在一周期间将细胞传代两次。这通过使用10 mL的磷酸盐缓冲盐水-乙二胺四乙酸(PBS-EDTA)冲洗烧瓶、添加2 mL的胰蛋白酶达2-5分钟以分离细胞并添加8 mL的新鲜培养基以抑制胰蛋白酶的进一步活动完成。各个新烧瓶接受8.5 mL的新鲜培养基和1.5 mL的细胞原液的组合以获得1:6的细胞稀释液。在37℃下孵育细胞直至准备好用于摄取研究。

[0312] 在转染过程之前1天，将在T-烧瓶中70-80%汇合的细胞铺板。使用PBS-EDTA和胰蛋白酶处理具有细胞原液的烧瓶以分离细胞，并从该点使用转染培养基。转染培养基由达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM) + NEAA组成。向各个孔添加0.5 mL的细胞混合5
物(1.3 × 10是期望的细胞浓度)并将细胞在37℃下孵育过夜。在试验前24小时，使用PEPT1转染细胞。通过混合600 µL的不含血清的转染培养基、18 µL的FUGENE6®(Roche Diagnostics)和11 µg的PepT1 DNA制备转染混合物。将转染试剂-DNA复合物孵育20分钟并将24 µL的试剂-DNA复合物加入至各个孔。

[0313] 如前面所公开(Zhang等人，2004. J. Pharm. Exper Ther. 310:437-445)的，在14
转染后24-小时，在24-孔板中培养的细胞中检测PEPT1-介导的[甘氨酰基-1-2- C]甘
14
氨酰肌氨酸(GlySar)摄取活动的抑制。为了检测本发明化合物抑制[ C]Gly-Sar摄取的
14
能力，在5 µM [ C]Gly-Sar(Moravek Biochemicals)和20 µM冷Gly-Sar的存在下，在pH
6.0摄取培养基中，使用5 mM的80%至90%汇合的PepT1瞬时转染HeLa细胞孵育前药化合物。摄取培养基由140 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl2、0.8 mM MgSO4、5 mM 葡萄糖、25 mM三(羟基甲基)氨基甲烷缓冲液(TRIS)组成。然后，使用2-(N-吗啉代)乙烷磺酸将溶液带至pH 6.0。孵育体积为500 µL并在室温下进行3分钟。为了在孵育时间结束时停止摄取，将摄取培养基从细胞单层抽出并将500 µL 的冰冷PBS加入至孔。使用500 µL的不含+2 +2
Ca 和Mg 的室温PBS将细胞洗涤3次。然后，使用300 µL的1% TRITON® X100 H2O溶液将细胞裂解。去除200 µL等份并通过液体闪烁计数法测定放射性以检测各个孵育孔中存在的
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[ C]Gly-Sar。建立没有抑制剂对照并且关于该对照计算各个前药的百分比抑制。与各个实验平行进行阴性对照(甘氨酸)和两个阳性对照(头孢羟氨苄和头孢氨苄)，以证明试验系统的可行性。具有等于或大于头孢氨苄的GlySar摄取抑制的前药化合物被认为是可接受的。甘氨酸的平均值 ± 标准偏差为10.1±9.5%(n=19)、头孢羟氨苄的平均值 ± 标准偏差为53.2 ± 13.2 %(n=19)且头孢氨苄的平均值 ± 标准偏差为37.5±14.7%(n=18)。

[0314] 对于PepT IC50试验，在5 µM [14C]Gly-Sar和20 µM冷Gly-Sar的存在下，在0.0625 mM至25 mM的浓度范围下孵育前药化合物。孵育和取样程序与上述PepT1筛选完
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全相同。针对各个前药化合物浓度评价[ C]Gly-Sar摄取数据并计算IC50值。

[0315] 基本上如上所述测试下列化合物并且显示下列活性：

[0316] 表17

[0317]实施例 平均GlySar摄取抑制%
16 53.9%
21 57.4%
22 46.7%
24 47.1%

[0318] 这些结果表明表17的化合物能够通过PepT1转运体被口服吸收并且等于或优于头孢羟氨苄和头孢氨苄(Zhang等人，2004. JPET 310:437-445)，其预测通过PepT1转运体的人口服吸收。

[0319] 体外肠前药水解试验

[0320] 从Celsius In Vitro Technologies(Baltimore, MD)获得既是苯甲基磺酰基氟(PMSF)又不含EDTA的冷冻的人十二指肠肠匀浆液(使用100 mM Tris 磷酸盐缓冲液的1:2组织:缓冲液比，pH 7.4)。

[0321] 从单一供体获得各个批次的人十二指肠并将肠子刮净并且单独冷冻切片。在4℃下进行所有原始组织收集并立即在-70℃下冷冻。将人肠匀浆液解冻并在孵育之前立即在100 mM PBS缓冲液，pH 7.4中稀释至0.5 mg/mL的最终蛋白质浓度。

[0322] 在96-孔板中进行孵育并且每天重复两次运行所有前药化合物。以1 mM的浓度在水中制备前药化合物溶液原液。在37℃的水浴中，将200 μL的0.5 mg/mL肠匀浆液的等份和196 μL的100 mM PBS缓冲液放置在96-孔板中。为了确保水解不是由于化学不稳定性而产生，还使用没有肠匀浆液的单独的PBS缓冲液孵育前药化合物。使用96-孔移液管将4 μL的1 mM 前药化合物溶液转移至匀浆液。在添加前药化合物(时间零)后并在1小时孵育后立即使用自动化一次性同时96孔移液管去除50 μL的孵育混合物样品并直接添加至200 μL的包含100 ng/mL内标的甲醇淬灭溶液。然后，在10℃下将样品在3500 rpm下离心5分钟。将上清液(200 μL)转移至最终的96孔PCR板并密封用于通过LC/MS/MS分析。

[0323] 在具有Analyst版本1.4.2，TURBOIONSPRAY®，正离子化和选择反应监控(SRM)的Sciex API 4000™四极质谱仪上使用LC/MS/MS检测测定孵育混合物中水解的本发明的化合物的浓度。在环境温度下使用Waters ATLANTIS® T3(20 × 2.1 mm, 5 μM) HPLC柱，流速为1.0 mL/min且流动相梯度从0.1%的流动相A至99%的流动相A。流动相A为1000:5 水: 七氟丁酸且流动相B为1:1 甲醇:冰醋酸。

[0324] 从通过在100 mM PBS pH 7.4中复制在10 μM开始的两倍稀释液制备的标准曲线测定肠孵育混合物中水解的本发明的化合物的浓度并且随后使用与样品相同的甲醇-内标溶液淬灭。使用MICROSOFT® Office EXCEL® 2007计算平均偏差和标准偏差。以相对于添加的前药化合物浓度形成的化合物的摩尔百分比形式测定水解的量。每个批次中运行的阳性对照、内部前药化合物A至内部化合物药物A的水解平均为75.3%(n=20)。然后，相对于内部化合物药物A的形成将最终值归一化。

[0325] 基本上如上所述测试下列化合物并且显示下列活性：

[0326] 表18

[0327]实施例编号 体外人肠水解%(相对于阳性对照)
17 63.3%
18 65.5%
19 58.1%
21 63.8%

[0328] 这些结果表明表18的化合物能够在人肠中被水解。

[0329] 体外人肝脏S-9匀浆液水解试验

[0330] 从Xenotech LLC(Lenexa, MO)获得肝脏S9部分。所述批次来自两种供体即一种为雄性另一种为雌性的混合物(pool)。制备肝脏S9部分并使用由4℃的50 mM Tris，pH7.4和150 mM氯化钾且不含EDTA组成的均匀缓冲液稀释。在37℃下，在肝脏匀浆液中将前药化合物孵育2小时，此后通过LC/MS/MS测定化合物的浓度。氯吡格雷至氯吡格雷羧酸的水解用作试验阳性对照。

[0331] 在96-孔形式中进行孵育并在每天重复两次运行所有前药化合物。以1 mM浓度，在水中制备前药化合物溶液原液。在100 mM PBS缓冲液，pH 7.4中，将人肝脏S9部分稀释至0.5mg/mL的最终蛋白质浓度。

[0332] 在37℃的水浴中，将200 μL的0.5 mg/mL人肝脏S-9匀浆液的等份和196 μL的100 mM PBS缓冲液放置在96-孔板中。使用96-孔移液管将4 μL的1 mM 前药溶液转移至匀浆液中。为了确保水解不是由于化学不稳定性而产生，还使用没有肝脏S-9的单独的PBS缓冲液孵育前药化合物。在添加前药化合物(时间零)后并在1小时孵育后立即使用自动化一次性同时96孔移液管去除50 μL的孵育混合物样品并直接添加至200 μL的包含100 ng/mL内标的甲醇淬灭溶液。然后，在10℃下将样品在3500 rpm下离心5分钟。将上清液(200 μL)转移至最终的96孔PCR板并密封用于通过LC/MS/MS分析。

[0333] 在Sciex API 4000，Analyst版本1.4.2，TURBOIONSPRAY®，正离子化和选择反应监控(SRM)上进行在孵育期间形成的化合物的LC/MS/MS定量。使用的HPLC柱为在环境温度下的Waters ATLANTIS® T3(20 × 2.1 mm, 5 μm)，流动相流速为1.0 mL/min。流动相A为1000:5 水: 七氟丁酸且流动相B为1:1 甲醇/冰醋酸。使用流动相梯度，开始的流动相比例A/B为99.9/ 0.1且最终处于1/99。

[0334] 从通过在100 mM PBS pH 7.4中重复在10 μM开始的两倍稀释液制备的标准曲线测定孵育混合物中水解的化合物的浓度并且随后使用与样品相同的甲醇-内标溶液淬灭。使用MICROSOFT® Office EXCEL® 2007计算平均偏差和标准偏差。以相对于添加的前药化合物浓度形成的化合物的摩尔百分比形式提供最终值。氯吡格雷至氯吡格雷羧酸的水解用作阳性对照且平均为73.0%(n=27)。

[0335] 基本上如上所述测试下列化合物并且显示下列活性：

[0336] 表19

[0337]