一种川贝母多倍体脱毒苗的培养方法

摘要

本发明公开了一种川贝母多倍体脱毒苗的培养方法，该方法选用经预处理后的不定根的生长点区域细胞诱导出多倍体愈伤组织，再将多倍体愈伤组织经鳞茎芽的诱导培养、鳞茎芽的生根培养及炼苗与移栽步骤来获得川贝母多倍体脱毒苗，创新性的建立了一整套川贝母多倍体脱毒苗的培养方法；该方法脱毒效果好、培养成本低，为川贝母优良品种的快速培育提供了一条新途径。

权利要求

1.一种川贝母多倍体脱毒苗的培养方法，包括川贝母组培鳞茎的诱导培养步骤，其特征在于还包括如下步骤：川贝母多倍体不定根的获得：将川贝母组培鳞茎先接种于1/2MS+IBA0.1～-1 -1

0.3mg·L +秋水仙素200～700mg·L 的培养基中，在无光照和温度为12～18℃的条件下培养2～5天，再转入不含秋水仙素的上述培养基中，在培养温度为18～24℃、每天光照4～8h和光照强度为800～1200lx的条件下继续培养，在川贝母鳞茎的基部有形状粗大的多倍体不定根产生；

多倍体不定根的预处理：将多倍体不定根从根基部切下后接入MS+6-BA 0.1～-1 -1

0.5mg·L +甘油100～200ml·L 的培养基中,在无光照和培养温度为35～40℃的条件下进行15～25天的预培养处理；

多倍体不定根生长点区域细胞的培养：在超净工作台上，切取多倍体不定根上生长点-1区域的细胞，将其接入愈伤组织诱导培养基B5+6-BA 0.5～2.0mg.L +2,4-D 0.5～4.0mg.-1L 中，在培养温度为15～22℃、每天光照5～8小时、光照强度为400～1000lx的条件下培养40～60天，获得多倍体愈伤组织；

川贝母多倍体鳞茎芽的诱导：选取质地较紧密、生长速度快且颜色为黄白色或淡黄色-1的多倍体愈伤组织，将其接入多倍体鳞茎芽诱导培养基MS+6-BA 1.0～4.0mg·L +IAA -1

0.1～0.3mg·L 中，在培养温度为18～22℃、每天光照12～20h、光照强度为1000～

3000lx的条件下培养45～60天，获得川贝母多倍体鳞茎芽，采用双抗体夹心ELISA方法对培育的川贝母多倍体鳞茎芽进行病毒检测；

多倍体鳞茎芽的生根培养：在超净台上切取生长1.0～3.0cm的多倍体鳞茎芽作为无-1 -1根苗，将其转入生根培养基1/2MS+NAA0.1～0.3mg·L +IBA0.1～0.3mg·L 中诱导生根，获得川贝母多倍体脱毒苗；

炼苗和移栽：选取长出2条以上不定根的川贝母多倍体脱毒苗，打开瓶盖，在室内炼苗

3～5天后，将其从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基后，移栽至消毒后的松软土壤中生长。

2.根据权利要求1所述的一种川贝母多倍体脱毒苗的培养方法，其特征在于所述川贝母组培鳞茎的诱导培养步骤是：选取生长二年以上的川贝母鳞茎上的鳞片叶，用流水冲洗-1 -1干净后进行消毒处理，然后接入MS+6-BA1.0～3.0mg·L +IAA0.1～0.5mg·L +KT0.5～-1

1.5mg·L 培养基中，在培养温度为16～22℃、每天光照6～10h、光照强度为1000～

1500lx的条件下诱导川贝母组培鳞茎。

3.根据权利要求2所述的一种川贝母多倍体脱毒苗的培养方法，其特征在于：所述消毒处理是指在超净台上用浓度为0.1％～0.2％的升汞消毒4～8min，再用无菌水洗3～6次后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分。

4.根据权利要求1所述的一种川贝母多倍体脱毒苗的培养方法，其特征在于：多倍体不定根生长点区域细胞的培养步骤中所述生长点区域的长度为0.2～1.0mm。

5.根据权利要求1所述的一种川贝母多倍体脱毒苗的培养方法，其特征在于：炼苗和移栽步骤中炼苗的培养条件为温度8～18℃、相对湿度80％～90％、每天光照6～10h、光照强度400～800lx，移栽至松软土壤中的培养条件为温度12～22℃、相对湿度75％～

80％、每天光照8～12h、光照强度为800～1000lx。

说明书

一种川贝母多倍体脱毒苗的培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种川贝母植物的组织培养方法，特别是涉及一种川贝母多倍体脱毒苗的培养方法。

背景技术

[0002] 川贝母Fritillaria cirrhosa D.Don）是百合科多年生草本植物，生长在海拔3500m—4500m的高度，主产于四川、西藏、云南等省区。川贝母具有清热润肺，化痰止咳之功效，用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，咯痰带血等症状。川贝母是稀有的治疗咳嗽等的良药，由于川贝母价格昂贵，加之近年来无计划盲目的采挖，自然资源日趋枯竭，预计在近几十年内也难以缓解。

[0003] 川贝母植物的繁殖常采用以种子进行的有性生殖和以鳞茎进行的无性繁殖两种方式。但不论是采用种子还是鳞茎进行的繁殖，对于多年生的川贝母植物都会因各种环境因素而染上病毒，而植物一旦被侵染病毒后，就会产生畸形，并会严重抑制其生长，从而最终造成川贝母药材的品质和产量大大地下降。更为严重的是所感染的病毒不仅可在植物器官中长期生存，还可随植物的器官一代代传递下去，从而使感染了病毒的植物品种会出现明显地退化，甚至因感染严重而濒临灭绝。

[0004] 多倍体植物具有植物器官“巨大化”特点，同时多倍体植物因基因数目增多和基因活性及酶的差异性增强，因此其生态适应性和对逆境的抗耐性较高。将川贝母植物的脱毒苗培育技术和多倍体诱导技术进行有机结合，能培育出品质优良、生长速度快、有效组分含量高和抗逆性强的川贝母多倍体脱毒苗。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种脱毒效果好、生长速度快、有效组分含量高的川贝母多倍体脱毒苗的培养方法。

[0006] 本发明提供的川贝母多倍体脱毒苗的培养方法包括川贝母组培鳞茎的诱导培养步骤和下列步骤：

[0007] 多倍体不定根的获得：将川贝母组培鳞茎先接种于1/2MS+IBA0.1～0.3mg·L-1+-1秋水仙素200～700mg·L 的培养基中，在无光照和温度为12～18℃的条件下培养2～5天，再转入不含秋水仙素的上述培养基中，在培养温度为18～24℃、每天光照4～8h和光照强度为800～1200lx的条件下继续培养，在川贝母鳞茎的基部有形状粗大的多倍体不定根产生；

[0008] 多倍体不定根的预处理：将多倍体不定根从根基部切下后接入MS+6-BA0.1～-1 -10.5mg·L +甘油100～200ml·L 的培养基中,在无光照和培养温度为35～40℃的条件下进行15～25天的预培养处理；

[0009] 多倍体不定根生长点区域细胞的培养：在超净工作台上，切取多倍体不定根上-1生长点区域的细胞，将其接入愈伤组织诱导培养基B5+6-BA0.5～2.0mg.L +2,4-D0.5～-1
4.0mg.L 中，在培养温度为15～22℃、每天光照5～8h、光照强度为400～1000lx的条件下培养40～60天，获得多倍体愈伤组织；

[0010] 川贝母多倍体鳞茎芽的诱导：选取质地较紧密、生长速度快且颜色为黄白色或淡黄色的多倍体愈伤组织，将其接入多倍体鳞茎芽诱导培养基MS+6-BA1.0～-1 -14.0mg·L +IAA0.1～0.3mg·L 中，在培养温度为18～22℃、每天光照12～20h、光照强度为1000～3000lx的条件下培养45～60天，获得川贝母多倍体鳞茎芽；

[0011] 多倍体鳞茎芽的生根培养：在超净台上切取生长1.0～3.0cm的多倍体鳞茎芽作-1 -1为无根苗，将其转入生根培养基1/2MS+NAA0.1～0.3mg·L +IBA0.1～0.3mg·L 中诱导生根，获得川贝母多倍体脱毒苗；

[0012] 炼苗和移栽：选取长出2条以上不定根的川贝母多倍体脱毒苗，打开瓶盖，在室内炼苗3～5天后，将其从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基后，移栽至消毒后的松软土壤中生长。

[0013] 所述川贝母组培鳞茎的诱导培养步骤是：选取生长二年以上的川贝母鳞茎上的-1鳞片叶，用流水冲洗干净后进行消毒处理，然后接入MS+6-BA1.0～3.0mg·L +IAA0.1～-1 -1
0.5mg·L +KT0.5～1.5mg·L 培养基中，在培养温度为16～22℃、每天光照6～10h、光照强度为1000～1500lx的条件下诱导川贝母组培鳞茎；所述消毒处理是指在超净台上用浓度为0.1%～0.2%的升汞消毒4～8min，再用无菌水洗3～6次后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分。川贝母组培鳞茎的诱导培养也可以采用目前已公开的方法。

[0014] 上述多倍体不定根生长点区域细胞的培养步骤中所述生长点区域的长度为0.2～1.0mm。

[0015] 上述炼苗和移栽步骤中炼苗的培养条件为温度8～18℃、相对湿度80%～90%、每天光照6～10h、光照强度400～800lx，移栽至松软土壤中的培养条件为温度12～22℃、相对湿度75%～80%、每天光照8～12h、光照强度为800～1000lx。

[0016] 上述所有培养基还包括琼脂4.0～7.0g·L-1和蔗糖15～50g·L-1，培养基的pH值为5.5～6.5。

[0017] 本发明选用经预处理后的不定根上的生长点区域细胞诱导出多倍体愈伤组织，再经多倍体鳞茎芽的诱导、多倍体鳞茎芽的生根培养和炼苗与移栽等步骤而获得川贝母多倍体脱毒苗，所培养的川贝母多倍体脱毒苗具有生长速度快、有效组分含量高和抗逆性强等优点。本发明方法为川贝母优良品种的快速培育提供了一条新途径。

[0018] 下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

[0019] 实施例1

[0020] （1）川贝母组培鳞茎的获得：选取生长二年以上的川贝母植株鳞茎上的鳞片叶，用流水冲洗干净后，放在超净台上用浓度为0.1%的升汞消毒4min后，再用无菌水震荡洗3-1次，最后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分然后接入pH值为5.8的MS+6-BA1.0mg·L +IA-1 -1 -1 -1
A0.1mg·L +KT0.5mg·L +蔗糖30g·L +琼脂6.0g·L 的培养基中，在培养温度16℃、每天光照6h、光照强度为1000lx的条件下诱导培养55天，川贝母组培鳞茎的诱导率为77.65%；

[0021] （2）川贝母多倍体不定根的获得：将获得的川贝母组培鳞茎先接种于pH值为6.2-1 -1 -1 -1的1/2MS+IBA0.1mg·L +秋水仙素200mg·L +蔗糖15g·L +琼脂4.5g·L 的培养基中，在无光照和温度为12℃的条件下诱导培养2天，再转入不含秋水仙素的上述培养基即-1 -1 -1
1/2MS+IBA0.1mg·L +蔗糖15g·L +琼脂4.5g·L 的培养基中，在培养温度为18℃、每天光照4h和光照强度为800lx的条件下继续培养60天，其多倍体不定根的诱导率为41.17%；

[0022] （3）多倍体不定根的预处理：将多倍体不定根（即根尖细胞检测染色体数目为-1 -12n=4x=48）从其基部切下后接入pH值为6.0的MS+6-BA0.1mg·L +甘油100ml·L +蔗糖-1 -1
45g·L +琼脂5g·L 的培养基中，置于无光照和培养温度为35℃的培养箱中进行20天的预培养处理,不定根的存活率为57.85%左右；

[0023] （4）多倍体不定根生长点区域细胞的培养：在超净工作台上，切取多倍体不定根生长点处0.2mm区域的细胞，将其接入pH值为5.8的愈伤组织诱导培养基B5+6-BA0.5mg.-1 -1 -1 -1L +2,4-D0.5mg.L +蔗糖50g·L +琼脂6.5g·L 中，在培养温度为15℃、每天光照5h、光照强度为400lx的条件下培养55天，多倍体愈伤组织诱导率为42.16%；

[0024] （5）川贝母多倍体鳞茎芽的诱导：选取质地较紧密、生长速度快且颜色为黄白色的-1 -1愈伤组织，将其接入到pH值为5.5的鳞茎芽诱导培养基MS+6-BA1.0mg·L +IAA0.1mg·L +-1 -1
蔗糖40g·L +琼脂6g·L 中，在培养温度为18℃、每天光照12h、光照强度为1000lx的条件下培养45天，多倍体鳞茎芽的诱导率为57.21%，采用双抗体夹心ELISA方法对培育的川贝母多倍体鳞茎芽进行病毒检测，其脱毒率为92.86%;

[0025] （6）多倍体鳞茎芽的生根培养：在超净台上切取生长1.0cm的多倍体鳞茎芽作为-1 -1无根苗，将其转接入pH值为5.6的生根培养基1/2MS+NAA0.1mg·L +IBA0.1mg·L +蔗糖-1 -1
50g·L +琼脂6.5g·L 中诱导生根，培养55天后统计生根率为83.14%；

[0026] （7）炼苗和移栽：选取长出2条以上不定根的川贝母多倍体脱毒苗，打开瓶盖，先在温度为8℃、相对湿度80%、每天光照6h和光照强度400lx的培养室里炼苗3天，再将其从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基后，移栽至消毒后的松软土壤中，在温度为12℃、相对湿度75%、每天光照8h和光照强度为800lx的条件下生长，川贝母多倍体脱毒苗的存活率为88.64%。

[0027] 实施例2

[0028] （1）川贝母组培鳞茎的获得：选取生长二年以上的川贝母植株鳞茎上的鳞片叶，用流水冲洗干净后，放在超净台上用浓度为0.1%的升汞消毒6min后，再用无菌水震荡洗5-1次，最后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分然后接入pH值为5.8的MS+6-BA2.0mg·L +IA-1 -1 -1 -1
A0.3mg·L +KT1.0mg·L +蔗糖30g·L +琼脂6.0g·L 的培养基中，在培养温度20℃、每天光照8h、光照强度为1200lx的条件下诱导培养55天，川贝母组培鳞茎的诱导率为91.65%；

[0029] （2）川贝母多倍体不定根的获得：将获得的川贝母组培鳞茎先接种于pH值为6.0-1 -1 -1 -1的1/2MS+IBA0.2mg·L +秋水仙素400mg·L +蔗糖15g·L +琼脂4.5g·L 的培养基中，在无光照和温度为16℃的条件下诱导培养4天，再转入不含秋水仙素的上述培养基即-1 -1 -1
1/2MS+IBA0.2mg·L +蔗糖15g·L +琼脂4.5g·L 的培养基中，在培养温度为22℃、每天光照6h和光照强度为1000lx的条件下继续培养60天，其多倍体不定根的诱导率为63.59%；

[0030] （3）多倍体不定根的预处理：将多倍体不定根（即根尖细胞检测染色体数目为-1 -12n=4x=48）从其基部切下后接入pH值为6.0的MS+6-BA0.3mg·L +甘油150ml·L +蔗糖-1 -1
45g·L +琼脂5g·L 的培养基中，置于无光照和培养温度为38℃的培养箱中进行20天的预培养处理,不定根的存活率为48.65%左右；

[0031] （4）多倍体不定根生长点区域细胞的培养：在超净工作台上，切取多倍体不定根生长点处0.4mm区域的细胞，将其接入pH值为6.0的愈伤组织诱导培养基B5+6-BA1.0mg.-1 -1 -1 -1L +2,4-D3.0mg.L +蔗糖50g·L +琼脂6.5g·L 中，在培养温度为20℃、每天光照6h、光照强度为800lx的条件下培养55天，多倍体愈伤组织诱导率为85.6%；

[0032] （5）川贝母多倍体鳞茎芽的诱导：选取质地较紧密、生长速度快且颜色为黄白色的-1 -1愈伤组织，将其接入到pH值为5.5的鳞茎芽诱导培养基MS+6-BA2.0mg·L +IAA0.2mg·L +-1 -1
蔗糖40g·L +琼脂6g·L 中，在培养温度为20℃、每天光照16h、光照强度为2800lx的条件下培养50天，多倍体鳞茎芽的诱导率为75.45%，采用双抗体夹心ELISA方法对培育的川贝母多倍体鳞茎芽进行病毒检测，其脱毒率为95.16%;

[0033] （6）多倍体鳞茎芽的生根培养：在超净台上切取生长2.5cm的多倍体鳞茎芽作为-1 -1无根苗，将其转入pH值为5.8的生根培养基1/2MS+NAA0.2mg·L +IBA0.2mg·L +蔗糖-1 -1
50g·L +琼脂6.5g·L 中诱导生根，培养55天后统计生根率为89.17%，生长的不定根数目在3～5条以上；

[0034] （7）炼苗和移栽：选取长出3条以上不定根的川贝母多倍体脱毒苗，打开瓶盖，先在温度为15℃、相对湿度85%、每天光照8h和光照强度600lx的培养室里炼苗4天，再将其从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基后，移栽至消毒后的松软土壤中，在温度为20℃、相对湿度75%、每天光照10h和光照强度为1000lx的条件下生长，川贝母多倍体脱毒苗的存活率为90.4%。

[0035] 实施例3

[0036] （1）川贝母组培鳞茎的获得：选取生长二年以上的川贝母植株鳞茎上的鳞片叶，用流水冲洗干净后，放在超净台上用浓度为0.1%的升汞消毒8min后，再用无菌水震荡洗6-1次，最后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分然后接入pH值为5.6的MS+6-BA3.0mg·L +-1 -1 -1 -1
IAA0.5mg·L +KT1.5mg·L +蔗糖30g·L +琼脂6.0g·L 的培养基中，在培养温度22℃、每天光照10h、光照强度为1500lx的条件下诱导培养55天，川贝母组培鳞茎的诱导率为
73.85%；

[0037] （2）川贝母多倍体不定根的获得：将获得的川贝母组培鳞茎先接种于pH值为6.2-1 -1 -1 -1的1/2MS+IBA0.3mg·L +秋水仙素700mg·L +蔗糖15g·L +琼脂4.5g·L 的培养基中，在无光照和温度为18℃的条件下诱导培养5天，再转入不含秋水仙素的上述培养基即-1 -1 -1
1/2MS+IBA0.3mg·L +蔗糖15g·L +琼脂4.5g·L 的培养基中，在培养温度为24℃、每天光照8h和光照强度为1200lx的条件下继续培养60天，多倍体不定根的诱导率为61.86%；

[0038] （3）多倍体不定根的预处理：取多倍体不定根（即根尖细胞检测染色体数目为-1 -12n=4x=48），从其基部切下后接入pH值为6.0的MS+6-BA0.5mg·L +甘油200ml·L +蔗糖-1 -1
45g·L +琼脂5.0g·L 的培养基中，置于无光照和培养温度为40℃的培养箱中进行20天的预培养处理,不定根的存活率为23.85%左右；

[0039] （4）多倍体不定根生长点区域细胞的培养：在超净工作台上，切取多倍体不定根上生长点处0.2mm区域的细胞，将其接入pH值为5.8的愈伤组织诱导培养基B5+6-BA2.0mg.-1 -1 -1 -1L +2,4-D4.0mg.L +蔗糖50g·L +琼脂6.5g·L 中，在培养温度为22℃、每天光照8h、光照强度为1000lx的条件下培养55天，多倍体愈伤组织诱导率为92.6%；

[0040] （5）川贝母多倍体鳞茎芽的诱导：选取质地较紧密、生长速度快且颜色为黄白色的-1 -1愈伤组织，将其接入到pH值为5.7的鳞茎芽诱导培养基MS+6-BA4.0mg·L +IAA0.3mg·L +-1 -1
蔗糖40g·L +琼脂6.0g·L 中，在培养温度为22℃、每天光照20h、光照强度为3000lx的条件下培养60天，多倍体鳞茎芽的诱导率为71.16%，采用双抗体夹心ELISA方法对培育的川贝母多倍体鳞茎芽进行病毒检测，其脱毒率为70.96%；

[0041] （6）多倍体鳞茎芽的生根培养：在超净台上切取生长3.0cm的多倍体鳞茎芽作为-1 -1无根苗，将其转接入pH值为5.8的生根培养基1/2MS+NAA0.3mg·L +IBA0.3mg·L +蔗糖-1 -1
50g·L +琼脂6.5g·L 中诱导生根，培养55天后统计生根率为84.97%；

[0042] （7）炼苗和移栽：选取长出3条以上不定根的川贝母多倍体脱毒苗，打开瓶盖，先在温度为18℃、相对湿度90%、每天光照10h和光照强度800lx的培养室里炼苗5天，再将其从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基后，移栽至消毒后的松软土壤中，在温度为22℃、相对湿度80%、每天光照12h和光照强度为1000lx的条件下生长，川贝母多倍体脱毒苗的存活率为88.17%。

[0043] 实施例4

[0044] 将实施例2步骤（2）中所述组培川贝母鳞茎改接入1/2MS+IBA0.2mg.L-1+秋水仙-1 -1素700mg.L +琼脂6.0g·L+蔗糖30g·L 的培养基中培养5天，其它步骤同实施例2，多倍体不定根的诱导率为62.18%。

[0045] 实施例5

[0046] 将实施例2步骤（3）中所述培养基改为MS+6-BA0.1mg·L-1+甘油100ml·L-1+蔗糖-1 -120g·L +琼脂7g·L 的培养基中，其它步骤同实施例2，多倍体不定根的存活率为43.64%左右。

[0047] 实施例6

[0048] 将实施例2步骤（3）中的多倍体不定根的预处理改为在温度为40℃的培养箱中预培养25天,其它步骤同实施例2，其不定根的存活率为27.12%左右。

[0049] 实施例7

[0050] 将实施例2步骤（4）中多倍体不定根生长点区域的细胞改接入B5+6-BA2.0mg.-1 -1 -1 -1L +2,4-D1.0mg.L +蔗糖20g·L +琼脂6.0g·L 中，在培养温度为15℃、每天光照5h和光照强度为400lx的条件下培养，其它步骤同实施例2，多倍体愈伤组织的诱导率为62.63%。

[0051] 实施例8

[0052] 将实施例2步骤（5）中愈伤组织改接入MS+6-BA1.0mg·L-1+IAA0.3mg·L-1+蔗-1 -1糖20g·L +琼脂7g·L 的诱导培养基中，在培养温度为18℃、每天光照12h和光照强度
1000lx的条件下培养，其它步骤同实施例2，多倍体鳞茎芽的诱导率为73.47%。

[0053] 实施例9

[0054] 在实 施 例2步 骤（6）中，切 取 生长 1.5cm的多 倍 体鳞 茎 芽改 接 入-1 -11/2MS+NAA0.3mg·L +IBA0.3mg·L 的生根培养基中，其它步骤同实施例2，其生根率为
84.13%，生长的不定根数目为1～3条。

[0055] 比较实施例1

[0056] 将实施例2步骤（2）中所述川贝母组培鳞茎在含秋水仙素的培养基中的培养条件改为培养温度为22℃、每天光照6小时和光照强度为1000lx，其它步骤同实施例2，其多倍