瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途

摘要

本发明涉及瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，本申请发明人经过海量筛选和研究，首次发现从石竹科植物瓦草中提取纯化得到的五环三萜皂苷类化合物，特别是以sinocrassuloside为母核的化合物及上述化合物的组合物具有较强的降血糖效果，能够用于制备抗糖尿病药物。

权利要求

1.瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：其中，R1为H、Ac、Glc中的一种；

R2为（E）-MC、(Z)-MC、Ac中的一种；

R3为H、Xyl中的一种；

R4为H、CH3、CH2CH2CH2CH3中的一种；

上述Ac的结构式如下：

上述 的结构式如下：

上述(Z)-MC的结构式如下：

2.根据权利要求1所述的瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

3.根据权利要求1所述的瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

4.根据权利要求1所述的瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

5.根据权利要求1所述的瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

6.根据权利要求1所述的瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

7.根据权利要求1所述的瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

8.根据权利要求1所述的瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

9.根据权利要求1所述的瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

10.根据权利要求1～9任一所述的瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物可以单独使用、两种或两种以上混合使用、或与其他辅料混合使用，制成临床上使用的注射剂、外用溶液剂、膏剂、糊剂、贴剂、滴剂、含漱剂、栓剂、舌下片剂、粘贴片、贴膜剂、气雾剂、泡腾片、滴丸剂。

说明书

瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，属于瓦草五环三萜皂苷类化合物医药新用途领域。

背景技术

[0002] 糖尿病是一种糖代谢紊乱导致的疾病，其表现为在禁食状态或口服葡萄糖耐量试验期间给予葡萄糖后，血浆葡萄糖水平升高，出现高血糖症。糖尿病主要分为两类，即1型糖尿病（胰岛素依赖型糖尿病，insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM）及2型糖尿病（非胰岛素依赖型糖尿病，non-insulin-dependent diabetes mellitus，NIDDM）。1型糖尿病患者体内产生胰岛素的量减少，甚至不产生胰岛素，胰岛素主要负责调节机体葡萄糖的利用，其产生减少则使血糖升高。2型糖尿主要与胰岛素抵抗（IR）等因素有关。2型糖尿病患者通常具有高胰岛素血症，即出现血浆胰岛素水平升高症状。胰岛素抵抗（IR）意味着患者机体内主要的胰岛素敏感组织包括肝脏、肌肉和脂肪组织对胰岛素刺激葡萄糖和脂代谢的作用产生了抵抗。产生葡萄糖抵抗的后果是患者机体通过分泌更多的胰岛素对胰岛素抵抗进行补偿，虽然如此，患者血浆中的葡萄糖水平还是出现了非正常升高。

[0003] 抗糖尿病药物有数种可以选择，除胰岛素外，广泛使用的化学药物有促胰岛分泌剂磺酰脲类，该类药物通过刺激胰腺β-细胞分泌更多的胰岛素来提高血浆中的胰岛素水平，但有导致病人低血糖症的风险。另外一类广泛使用的降糖药物是双胍类，如二甲双胍和苯乙双胍，这类药物主要是促进机体对外周血糖的利用，其优点是可对高血糖水平进行一定的修正，却不会增加低血糖的风险，可与胰岛素或胰岛素促分泌剂联合使用，但存在导致乳酸性酸中毒和腹泻、恶心的副作用。另外一类较新的降糖药物是胰岛素增敏剂格列酮类（噻唑烷二酮类），代表药物有罗格列酮和吡格列酮，这类药物可增加组织对胰岛素的敏感性，提高细胞对葡萄糖的利用而发挥降糖效果，可明显降低空腹血糖及胰岛素，对餐后血糖和胰岛素亦有明显的降低作用，但也存在导致水钠潴留、血容量增加和心脏负荷增加等不良反应。

[0004] 植物来源的抗糖尿病活性物质筛选是一条抗糖尿病新药发掘的重要途径。在抗糖尿病活性物质筛选研究中，皂苷类化合物逐步进入研发人员的视野。皂苷类成分可通过调节血脂、改善胰岛素抵抗、降低血糖等途径预防和治疗糖尿病。目前研究较多的具有降血糖作用的皂甙主要有：三七皂甙、夏枯草三萜皂甙、人参皂甙、齐墩果皂甙、苦瓜皂甙、楤木皂甙等，上述研究结果显示皂甙具有良好的降血糖应用开发潜力。

[0005] 瓦草为石竹科（Caryophyllaceae）蝇子草属植物滇白前（Silene viscidula Franch.）的干燥根，具有镇痛、止血、清热、利尿之功，主要用于治疗跌打损伤、风湿骨痛、支气管炎、尿路感染等症。目前瓦草的研究主要集中在化学成分研究方面，药理方面的研究报道较少。瓦草的主要的化学成分有皂苷类、蛋白质类、有机酸类、多糖类、环肽类等，目前申请者经过分离确定结构的有如下几类皂苷类成分：包括皂苷sinocrassulosideⅥ、sinocrassulosideⅦ、sinocrassulosideⅧ、sinocrassulosideⅨ、sinocrassulosideⅫ、sinocrassulosideXⅢ等；环肽类成分，包括瓦草环肽A、B、C（silenins A、B、C）；甾酮类成分，包括20-羟基蜕皮激素、1-epi-integristerone A、abutasterone、旌节花甾酮A、15-羟基旌节花甾酮A；有机酸类成分，包括对羟基桂皮酸、齐墩果酸、香草酸等。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，本申请发明人经过海量筛选和研究，首次发现从石竹科植物瓦草中提取纯化得到的五环三萜皂苷类化合物，特别是以sinocrassuloside为母核的化合物、上述化合物的组合物及含有Sinocrassuloside化合物的植物提取物都有较强的降血糖效果，能够用于制备抗糖尿病药物。

[0007] 以sinocrassuloside为母核的化合物包括含有sinocrassuloside母核结构的修饰物和衍生物，包括：sinocrassuloside化合物的苷元以及带有不同数目和结构葡萄糖的皂苷。主要是指sinocrassulosideⅥ、sinocrassulosideⅦ、sinocrassulosideⅧ、sinocrassulosideⅨ、sinocrassuloside X、sinocrassuloside XI、sinocrassulosideⅫ、sinocrassulosideⅩⅢ及上述化合物药学上可接受的盐。

[0008] 其中，sinocrassulosideⅥ与sinocrassulosideⅦ、sinocrassuloside Ⅷ与sinocrassulosideⅨ、sinocrassulosideⅫ与sinocrassulosideⅩⅢ均为顺反异构体，六种成分均具有较强的降糖活性，体现一定的构效关系。

[0009] 本发明所述药学上可接受的盐是指sinocrassuloside化合物与碱或碱土金属所形成的盐，碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、碳酸氢钠、氯化铵或氨水；碱土金属包括钠、钾、钙、铝、铜、锌或镁。

[0010] 本发明所保护的五环三萜皂苷类化合物及其类似物主要从植物瓦草中提取，但是从其他植物中提取、化学合成、半合成或生物转化的方式获得的五环三萜皂苷类化合物及其类似物也在本发明的保护范围之内。

[0011] 五环三萜皂苷类化合物主要用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病（2型糖尿病），但不限于此，剂量范围：0.1～10mg/kg动物体重。

[0012] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

[0013]

[0014] 其中，R1为H、Ac、Glc（glucose，葡萄糖）中的一种；

[0015] R2为（E）-MC、(Z)-MC、Ac中的一种；

[0016] R3为H、Xyl（Xylose，木糖）中的一种；

[0017] R4为H、CH3、CH2CH2CH2CH3中的一种；

[0018] 上述Ac的结构式如下：

[0019] 上 的结构式如下：

[0020]

[0021] 上述(Z)-MC的结构式如下：

[0022]

[0023] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

[0024] 进一步，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

[0025]

[0026] 进一步，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

[0027]

[0028] 进一步，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

[0029]

[0030] 进一步，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

[0031]

[0032] 进一步，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

[0033]

[0034] 进一步，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

[0035]

[0036] 进一步，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

[0037]

[0038] 进一步，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

[0039]

[0040] 进一步，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物可以单独使用、两种或两种以上混合使用、或与其他辅料混合使用，制成临床上使用的注射剂、外用溶液剂、膏剂、糊剂、贴剂、滴剂、含漱剂、栓剂、舌下片剂、粘贴片、贴膜剂、气雾剂、泡腾片、滴丸剂；

[0041] 进一步，所述注射剂包括静脉注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射及腔内注射等多种注射途径；

[0042] 进一步，所述外用溶液剂为洗剂或搽剂；

[0043] 进一步，所述膏剂为软膏剂或硬膏剂；

[0044] 进一步，所述滴剂为滴眼剂或滴鼻剂；

[0045] 进一步，所述瓦草五环三萜皂苷类化合物可以单独使用、两种或两种以上混合使用、或与其他辅料混合使用，制成食品或饮料。

[0046] 本发明的有益效果是：

[0047] 本发明提供瓦草五环三萜皂苷类化合物制备降血糖药物的用途，特别是以sinocrassuloside为母核的化合物及上述化合物的组合物具有显著的抗糖尿病活性，能够有效降低血糖和/或提高机体的葡萄糖耐受能力。

[0048] 本发明提供的瓦草五环三萜皂苷类化合物，特别是以sinocrassuloside为母核的化合物及上述化合物的组合物与现有报道的植物源降糖化合物相比，具有降糖效果明显、作用强的特点。

[0049] 本发明提供的瓦草五环三萜皂苷类化合物，特别是以sinocrassuloside为母核的化合物及上述化合物的组合物与现有降糖化学药物相比，具有化学骨架结构独特新颖，制备工艺简单，污染小，降糖作用强而副作用小的特点。

[0050] 此外，本发明提供的瓦草五环三萜皂苷类化合物，特别是以sinocrassuloside为母核的化合物及上述化合物的组合物是除胰岛素类注射给药迅速起效的药物之外，唯一一个注射给药途径能与胰岛素效果媲美的天然提取化学药物。

附图说明

[0051] 图1为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KKAy小鼠血糖的影响；

[0052] 图2为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KKAy小鼠体重的影响；

[0053] 图3为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KKAy小鼠进食量的影响；

[0054] 图4为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KKAy小鼠饮水量的影响；

[0055] 图5为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KKAy小鼠血糖的影响；

[0056] 图6为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物停药后降糖作用维持时间研究；

[0057] 图7为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KKAy小鼠血胰岛素含量的影响；

[0058] 图8为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KKAy小鼠胰岛素敏感性的影响；

[0059] 图9为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KKAy小鼠肝糖原含量的影响；

[0060] 图10为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KKAy小鼠肌糖原含量的影响；

[0061] 图11为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对正常ICR小鼠体重的影响；

[0062] 图12为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对正常ICR小鼠血糖的影响；

[0063] 图13为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对T2DM大鼠血糖的影响；

[0064] 图14为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对T2DM大鼠OGTT的影响；

[0065] 图15为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对T2DM大鼠肝糖原含量的影响；

[0066] 图16为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对T2DM大鼠肌糖原含量的影响；

[0067] 图17为不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对T2DM大鼠GSP含量的影响；

[0068] 附图中，*与正常对照组比较，p<0.05；**与正常对照组比较，p<0.01；

[0069] #与模型组比较，p<0.05；##与模型组比较，p<0.01。

具体实施方式

[0070] 以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

[0071] 实验例1瓦草五环三萜类化合物的提取、分离、纯化、鉴别方法

[0072] 取瓦草21kg，粉碎后用170L的95%的乙醇和70%的乙醇分别提取三次，浓缩得浸膏7kg，分离纯化方法参照文献（J.Zhao，Norio Nakamura，Masao Hattori.New triterpenoidsaponins from the roots of sinocrassulaasclepiadea[J].Pharmaceutical Society of Japan，2004，52(2):230-237.）得 到 大 分 子 化 合 物sinocrassulosideⅥ、sinocrassulosideⅦ、sinocrassulosideⅧ、sinocrassulosideⅨ、sinocrassuloside Ⅻ、sinocrassuloside Ⅹ Ⅲ，其 中，sinocrassuloside Ⅵ 和sinocrassulosideⅦ，sinocrassulosideⅧ和sinocrassulosideⅨ，sinocrassulosideⅫ和sinocrassulosideⅩⅢ为3对顺反异构体。

[0073] 化合物1和化合物2（sinocrassulosideⅥ和sinocrassulosideⅦ）：白色粉末，- 1 13分子式为：C71H102O31。ESI-MS（m/z）：1473.2[M+Na]+，1449.7[M-H]。H-NMR和 C-NMR的具体数据见表1。

[0074] 化合物3和化合物4（sinocrassulosideⅧ和sinocrassulosideⅨ）：白色粉末，+ - - 1分子式为：C72H104O31。ESI-MS（m/z）：1487.2[M+Na]，1499.7[M+Cl]，1463.8[M-H]。H-NMR
13
和 C-NMR的具体数据见表1。

[0075] 化合物7和化合物8（sinocrassulosideⅫ和sinocrassulosideⅩⅢ）：白色粉末，+ - - 1分子式为：C75H110O31。ESI-MS（m/z）：1529.3[M+Na]，1541.8[M+Cl]，1505.6[M-H]。H-NMR
13
和 C-NMR的具体数据见表1。

[0076]

[0077]

[0078]

[0079] 实验例2瓦草五环三萜皂苷类化合物对2型糖尿病小鼠的降糖作用

[0080] 动物与饲养管理

[0081] 12周龄雄性KKAy小鼠80只，12周龄雄性C57BL/6小鼠10只，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号SCXK（京）2009-0015，小鼠适应性喂养1周后进行药效学实验。

[0082] 实验动物饲养条件如表2所示：

[0083] 表2实验动物饲养条件

[0084]温度 22℃±2℃
照明 12小时明/12小时暗

[0085] 12小时明/12小时暗：表示明暗交替时间各为12小时。Ay

[0086] 动物饲养于有垫料的塑料饲养盒中，清洁级KK 专用高脂饲料(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)喂养，自由饮水。

[0087] 实验设计Ay

[0088] 适应性喂养1周后，80只KK 小鼠随机分为8组，分别为模型组、化合物1组、化合物2组、化合物3组、化合物4组、化合物7组、化合物8组和阳性药二甲双胍组，每组10Ay只。另以10只正常C57BL/6小鼠为正常对照组。其中KK 小鼠喂饲特殊高脂饲料，正常对照组喂饲正常饲料。正常对照组、模型组小鼠皮下注射注射用水，瓦草皂苷各组小鼠皮下注射不同的皂苷，阳性药二甲双胍组灌胃二甲双胍水溶液，给药时间均为每天9:00左右给药体积均为10ml/kgBW。连续2周。

[0089] 每周鼠尾采血，试纸条法测定血糖。

[0090] 分组情况如下：

[0091] 表3动物给药与剂量

[0092]分组 给药 剂量（mg/kgBW）
正常对照组 注射用水 _
模型组 注射用水 _
化合物1组 化合物1 2.0
化合物2组 化合物2 2.0
化合物3组 化合物3 2.0
化合物4组 化合物4 2.0
化合物7组 化合物7 2.0
化合物8组 化合物8 2.0
阳性药二甲双胍组 二甲双胍 500

[0093] 给药方法

[0094] 瓦草五环三萜各皂苷类成分分别溶于无菌注射用水中，过滤除菌，每日皮下注射；二甲双胍溶于无菌水中，灌胃给药；正常对照组、模型组小鼠只注射等体积（10ml/kgBW）的注射用水。每天上午9点给药，共计2周。

[0095] 实验方案

[0096] 每周测定一次小鼠血糖，共2次。测血糖前，小鼠禁食过夜，剪尾取血测定血糖。

[0097] 实验终止：给药2周（14天）后结束该实验研究。

[0098] 数据统计

[0099] 采用SPSS10.0软件进行数据处理分析，所有指标均以均数±标准差 表示，组间比较采用方差分析。

[0100] 结果

[0101] 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KKAy小鼠血糖的影响

[0102] 本部分实验主要观察瓦草五环三萜不同皂苷类成分对小鼠血糖的影响，比较不同成分间的降糖作用强弱，为后续工作提供实验依据。

[0103] 给药前(0周)，以血糖水平随机分组，模型组与各给药组小鼠血糖明显高于正常对照组，差异有显著性，数据表明，KKAy小鼠血糖值较高，为合格的糖尿病小鼠模型。

[0104] 药物干预1周后，与模型组比较，各皂苷类成分组小鼠血糖均有不同程度的降低，其中，化合物1降糖作用最强（与模型组比较，p<0.01），其次是化合物2、化合物4、化合物3、化合物7、化合物8，其中化合物8表现出一定的降糖趋势，与模型组比较，未出现统计学差异。

[0105] 2周时，各给药组小鼠血糖下降更为明显（与模型组比，均有p<0.01），瓦草各皂苷类成分降糖作用强弱基本与给药1周时相同，如图1所示。

[0106] 讨论

[0107] 糖尿病患者以血糖升高为主要指征，机体持续性的高葡萄糖会殃及全身组织、器官和细胞，并引发糖尿病肾病、糖尿病足、眼底及周围神经病变等慢性并发症，因此，降低机体葡萄糖水平是治疗糖尿病的首要目标。

[0108] 本实验首先比较了从瓦草提取的不同皂苷类成分降糖作用强弱。研究结果表明，化合物1和化合物2（两者为顺反异构体）降糖作用最强，其次是化合物3和化合物4（两者为顺反异构体），化合物7和化合物8降糖作用稍弱，在给药1周时，化合物8只表现出一定的降糖趋势，与模型组血糖比较，并未出现统计学差异，继续给药一周后，方出现统计学意义，表明该成分降糖作用弱于前5类成分。

[0109] 结论

[0110] 瓦草中提取的各皂苷成分具有较强的降血糖作用，是治疗糖尿病的理想活性成分。

[0111] 实验例3瓦草五环三萜皂苷类化合物对2型糖尿病小鼠的治疗作用

[0112] 动物与饲养管理

[0113] 12周龄雄性KKAy小鼠60只，12周龄雄性C57BL/6小鼠10只（北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号SCXK（京）2009-0015），适应性喂养1周后进行药效学实验。

[0114] 实验动物饲养条件如表4所示：

[0115] 表4实验动物饲养条件

[0116]温度 22℃±2℃
照明 12小时明/12小时暗

[0117] 12小时明/12小时暗：表示明暗交替时间各为12小时。Ay

[0118] 动物饲养于有垫料的塑料饲养盒中，清洁级KK 专用高脂饲料(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)喂养，自由饮水。

[0119] 实验设计Ay

[0120] 适应性喂养1周后，60只KK 小鼠随机分为6组，分别为模型组、化合物1组、化合物2组、化合物3组、化合物4组和阳性药二甲双胍组，每组10只。另以10只正常C57BL/6Ay小鼠为正常对照组。其中KK 小鼠喂饲特殊高脂饲料，正常对照组喂饲正常饲料。正常对照组、模型组小鼠皮下注射注射用水，瓦草皂苷各组小鼠皮下注射不同的皂苷，阳性药二甲双胍组灌胃二甲双胍水溶液，给药时间均为每天9:00左右给药体积均为10ml/kgBW。连续
2周。

[0121] 每周记录小鼠体重、饮水量、进食量。实验结束时取血，分离血清，测定血糖、胰岛素含量，计算胰岛素敏感指数。取部分肝脏、骨骼肌，称重用以测定肝糖原、肌糖原。

[0122] 分组情况如下：

[0123] 表5动物给药与剂量

[0124]分组 给药 剂量(mg/kgBW)
正常对照组 注射用水 _
模型组 注射用水 _
化合物1组 化合物1 2.0
化合物2组 化合物2 2.0
化合物3组 化合物3 2.0
化合物4组 化合物4 2.0
阳性药二甲双胍组 二甲双胍 500

[0125] 给药方法

[0126] 化合物1、化合物2、化合物3、化合物4溶于无菌注射用水中，过滤除菌，每日皮下注射，二甲双胍灌胃给药，正常对照组、模型组小鼠只注射等体积（10ml/kg BW）的注射用水。每天上午9:00给药，共计2周（14天）。

[0127] 实验方案

[0128] 小鼠食水消耗量的测定：每周重量法测一次小鼠24小时进食量和饮水量，注意回收漏入饲养盒的小颗粒饲料以保证进食量的精确性。

[0129] 体重的测定：每周测定一次小鼠体重。

[0130] 血标本：每周测定一次小鼠血糖。小鼠禁食过夜，剪尾取血测定血糖。实验结束时，取血测定血糖、胰岛素，取部分肝脏、骨骼肌，试剂盒法测定肝/肌糖原含量。

[0131] 实验终止：给药2周（14天）后结束该实验研究。

[0132] 数据统计

[0133] 采用SPSS10.0软件进行数据处理分析，所有指标均以均数±标准差 表示，组间比较采用方差分析。

[0134] 结果Ay

[0135] 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KK 小鼠体重的影响Ay

[0136] 模型组小鼠较正常对照组小鼠体重增长明显（均有p<0.01），这是因为KK 小鼠为肥胖鼠的一种，体重明显高于普通同龄小鼠所致。瓦草皂苷各化合物组及阳性药二甲双胍组小鼠体重增加较稳定，日平均增长速度较模型组慢，表明瓦草皂苷对糖尿病小鼠体重增长有一定的抑制作用，如图2所示，其中，化合物1抑制体重增长的作用最明显。Ay

[0137] 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对对KK 小鼠进食量的影响

[0138] 模型组小鼠进食量明显高于正常对照组，符合糖尿病临床“多食”症状。给予不同药物干预1周后，各组小鼠进食量较模型组减少，其中，化合物1组、阳性药二甲双胍组小鼠进食明显减少（与模型组比较，p<0.05），其它各组只表现为减少趋势，与模型组比较，无统计学差异。

[0139] 给药2周时，除化合物4组外，其它各药物干预组小鼠进食量与模型组相比，均有明显下降（p<0.05或p<0.01），表现为一定的时-效关系，如图3所示。Ay

[0140] 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KK 小鼠饮水量的影响

[0141] 模型组小鼠饮水量明显高于正常对照组，符合糖尿病临床“多饮”症状。药物干预1周、2周时，各给药组饮水量均有所下降，与模型组比较，除化合物4组在给药1周时未出现统计学差异外，其余各组饮水量下降均较明显（与模型组比较，p<0.05或p<0.01），如图4所示。
Ay

[0142] 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KK 小鼠血糖的影响

[0143] 本部分实验分别观察药物干预期间及停药后小鼠血糖的变化。

[0144] 药物干预1周后，与模型组比较，除化合物4组未出现统计学差异外，其余各组血糖下降均较明显（与模型组比较，均有p<0.01）。给药2周时，血糖下降更为明显（与模型组比，p<0.01），其中，化合物1组小鼠血糖低于正常对照组；除化合物4组外，瓦草皂苷其它各化合物降血糖作用均优于阳性药二甲双胍，表明具有较强的降血糖作用，如图5所示。

[0145] 同时，本申请发明人还对瓦草皂苷停药后降糖作用的维持时间进行了研究。结果Ay显示，停药后，各给药组KK 小鼠血糖逐渐回升，停药2周时，阳性药二甲双胍组小鼠血糖与模型组已无明显差异，表明降糖作用消失，瓦草皂苷各给药组血糖亦有所回升，但仍明显低于模型组（p<0.01）。停药3周时，化合物1组小鼠血糖仍明显低于模型组，数据表明，停药后，瓦草皂苷降糖作用持续时间较阳性药二甲双胍长，在相对较长时间内，延缓了血糖的回升速度，如图6所示。

[0146] 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KKAy小鼠胰岛素含量及胰岛素敏感性（ISI）的影响

[0147] 模型组小鼠胰岛素水平较正常对照组增加明显（p<0.01），但血糖值较高，表现为一定的胰岛素抵抗（IR），符合2型糖尿病模型指征。药物干预后，除化合物4组外，其余各组小鼠胰岛素水平较模型组明显升高，（p<0.05或p<0.01），表明瓦草皂苷具有促进胰岛β细胞胰岛素分泌的作用，如图7所示。

[0148] 从ISI来看，模型组小鼠ISI明显下降，各给药组小鼠较模型组ISI均有明显提高（均有p<0.01），表明瓦草皂苷具有一定的增加机体胰岛素敏感性的生物学活性，如图8所示。

[0149] 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对KKAy小鼠肝糖原、肌糖原含量的影响[0150] 数据结果显示，KKAy小鼠肝糖原、肌糖原含量较正常对照组明显减少（p<0.01）。药物干预后，各组小鼠肝糖原含量均较模型组明显增加（p<0.05或p<0.01）；不同瓦草皂苷对肌糖原含量影响作用不一致，其中，化合物1、2作用较强（与模型组比较，p<0.01），而化合物3、4组肌糖原含量有一定的增加趋势，但与模型组比较，无明显统计学差异。

[0151] 该实验表明，瓦草皂苷可增强机体组织对糖原的储存功能。其中，化合物1组肝、肌糖原含量增加最明显，与阳性药二甲双胍组相似，如图9～10所示。

[0152] 讨论

[0153] 糖尿病患者以血糖升高为主要指征，临床主要表现为多饮、多食、多尿及身体消瘦，即典型的“三多一少”症状。机体持续性的高葡萄糖会殃及全身组织、器官和细胞，并引发糖尿病肾病、糖尿病足、眼底及周围神经病变等慢性并发症，因此，降低机体葡萄糖水平是治疗糖尿病的首要目标。2型糖尿病患者除了高血糖外，常表现为糖耐量异常、Ins敏感性下降等症状，同时存在脂质代谢紊乱和胰岛素耐量异常，实验室指标表现为TC、TG、LDL升高、HDL降低等。

[0154] 本实验研究结果表明，瓦草皂苷可快速、有效地改善糖尿病模型小鼠多饮、多食症状、降低小鼠血糖、促进胰岛素分泌、增加机体对胰岛素的敏感性，并可增加机体组织肝、肌糖原含量，其中，化合物1的药效学作用与阳性药二甲双胍相似，表现为较好的降糖、增加胰岛素敏感性的生物学活性。同时，其药效学作用维持时间较二甲双胍长，可有效防止停药后血糖在短时间内的反弹。分析其药理学活性作用，可能与增加胰岛素分泌、增强胰岛素敏感性及促进机体组织对外周血糖的储备功能有关。

[0155] 结论

[0156] 瓦草皂苷可显著改善糖尿病小鼠多饮、多食症状，有效促进胰岛素分泌，明显提高机体胰岛素敏感性，加强机组组织的糖原储备功能，具有很强的降血糖作用，是一种治疗糖尿病的理想活性成分，具有较好的成药性。

[0157] 实验例4瓦草五环三萜皂苷类化合物对正常ICR小鼠的降糖作用

[0158] 以降糖作用最强的化合物1、化合物2为代表，考察瓦草五环三萜皂苷类化合物对正常小鼠的降糖作用。

[0159] 动物与饲养管理

[0160] 20～22g雄性ICR小鼠40只（北京斯贝福实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2011-0004）适应性喂养1周后进行药效学实验。

[0161] 实验动物饲养条件如下：

[0162] 表6实验动物饲养条件

[0163]温度 22℃±2℃
照明 12小时明/12小时暗

[0164] 动物饲养于有垫料的塑料饲养盒中，小鼠清洁级维持饲料(北京科澳协力饲料有限公司)喂养，自由饮水。

[0165] 实验设计

[0166] 适应性喂养1周后，40只ICR小鼠随机分为4组，分别为正常对照组、化合物1组、化合物2组和阳性药二甲双胍组，每组10只。各组小鼠均喂饲清洁级小鼠维持饲料。正常对照组小鼠皮下注射注射用水，瓦草皂苷各组小鼠皮下注射不同的皂苷，阳性药二甲双胍组灌胃二甲双胍水溶液，给药时间均为每天9:00左右给药体积均为10ml/kgBW。连续2周。

[0167] 每周测定一次体重和空腹血糖。

[0168] 分组情况如下：

[0169] 表7动物给药与剂量

[0170]分组 给药 剂量(mg/kgBW)
正常对照组 注射用水 -
化合物1组 化合物1 1
化合物2组 化合物2 1
阳性药二甲双胍组 二甲双胍 500

[0171] 给药方法

[0172] 将化合物1、化合物2溶于无菌注射用水中，过滤除菌，每日皮下注射，正常对照组只注射等体积(10ml/kg BW)的注射用水，二甲双胍灌胃给药。每天上午9点给药，共计2周。

[0173] 实验方案

[0174] 体重的测定：每周测定一次小鼠体重。

[0175] 血糖的测定：每周测定一次小鼠血糖。小鼠禁食过夜，剪尾取血，试纸法测定空腹血糖。

[0176] 实验终止：给药2周（14天）后结束该实验研究。

[0177] 数据统计：采用SPSS10.0软件进行数据处理分析，所有指标均以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析。

[0178] 结果

[0179] 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对正常ICR小鼠体重的影响

[0180] 瓦草皂苷给药组小鼠较正常对照组小鼠体重无明显变化，数据表明瓦草皂苷对正常ICR小鼠体重增长无明显影响，如图11所示。

[0181] 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对正常ICR小鼠血糖的影响

[0182] 药物干预1W后，瓦草皂苷组小鼠血糖较正常对照组有所下降，除化合物1组下降明显外（p<0.05），其它各组小鼠仅有下降趋，与正常对照组比较，无统计学差异。给药2周时，化合物1组、化合物2组小鼠血糖下降更为明显（与正常对照组比，p<0.01），表现为较明显的降血糖作用，如图12所示。

[0183] 结论

[0184] 化合物1和化合物2对正常动物也具有一定的降血糖作用，这表明瓦草五环三萜皂苷类化合物可能对正常动物的血糖产生一定影响。

[0185] 实验例5不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对实验性2型糖尿病（T2DM）大鼠的降糖作用

[0186] 动物与饲养管理

[0187] 180～200g雄性SD大鼠50只（斯贝福（北京）实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2011-0004）适应性喂养1周后进行药效学实验。

[0188] 实验动物饲养条件如下：

[0189] 表8实验动物饲养条件

[0190]温度 22℃±2℃
照明 12小时明/12小时暗

[0191] 动物饲养于有垫料的塑料饲养盒中，大鼠清洁级维持饲料(购自北京科澳协力饲料有限公司)喂养，自由饮水。

[0192] 实验设计

[0193] 适应性喂养1周后，大鼠随机分为5组，分别为正常对照组、模型组、化合物1组、化合物2和阳性药拜糖平组，每组10只。各组大鼠均喂饲清洁级大鼠维持饲料。正常对照组、模型组小鼠皮下注射注射用水，瓦草皂苷各组小鼠皮下注射不同的皂苷，阳性药拜糖平组灌胃拜糖平水溶液，给药时间均为每天9:00左右给药体积均为10ml/kgBW。连续2周。

[0194] 每周测一次体重和空腹血糖。

[0195] 分组情况如下：

[0196] 表9动物给药与剂量

[0197]分组 给药 剂量(mg/kg BW)
正常对照组 注射用水 -
模型组 注射用水 -
化合物1组 化合物1 4
化合物2组 化合物2 4
阳性药拜糖平组 拜糖平 20

[0198] 给药方法

[0199] 化合物1、2溶于无菌注射用水中，过滤除菌，每日皮下注射，对照组、模型组小鼠只注射等体积（10ml/kg BW）的注射用水，拜糖平灌胃给药。每天上午9点给药，共计2周。

[0200] 实验方案

[0201] T2DM模型的制备

[0202] 60只大鼠除正常组对照组10只灌胃动物饮用水外，其余各组大鼠均灌胃高脂乳剂，10ml/kg，每周称体重。四周后除正常组外，各组均腹腔注射链脲佐菌素（STZ，溶于pH4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，用前配制，避光保存），30mg/kg。4天后尾静脉取血测血糖。取空腹血糖值>11.1mmol/L的大鼠纳入试验。

[0203] 血糖的测定

[0204] 分别于给药前、给药2周后，测定大鼠血糖。大鼠禁食过夜，剪尾取血，试剂盒法测定空腹血糖。

[0205] 糖耐量实验（OGTT实验）

[0206] 给药2周后进行OGTT实验。实验前大鼠禁食不禁水16h，50%葡萄糖灌胃给予大鼠，5g/kgBW。灌胃给予葡萄糖前，先测定空腹血糖值，灌胃给予葡萄糖后30、60、120min，分别测定大鼠血糖。

[0207] 果糖胺（GSP）、肝糖原、肌糖原含量的测定

[0208] 实验结束时，腹主动脉取血测定GSP、取部分肝脏、骨骼肌，试剂盒法测定肝/肌糖原含量。

[0209] 实验终止：给药2周（14天）后结束该实验研究。

[0210] 数据统计

[0211] 采用SPSS10.0软件进行数据处理分析，所有指标均以均数±标准差 表示，组间比较采用方差分析。

[0212] 结果

[0213] 瓦草皂苷对T2DM大鼠血糖的影响

[0214] 给药2周后，化合物1组、化合物2组与阳性药拜糖平组大鼠的血糖较模型组明显降低（P<0.01），表现为较好的降糖作用，其中，化合物1降糖强度优于阳性药拜糖平，如图13所示。

[0215] 瓦草皂苷对T2DM大鼠OGTT的影响

[0216] 灌饲葡萄糖30min时，各组大鼠血糖均有所升高，其中，正常对照组血糖升高不明显，模型组与各给药组大鼠血糖急剧升高，给药组与模型组间血糖未出现统计学差异。正常对照组大鼠血糖在灌饲葡萄糖30min时血糖开始下降，并在120min时恢复至正常水平；模型组大鼠血糖在60min、120min时虽有所下降，但下降速度较慢，120min时血糖水平仍高于灌饲葡萄糖前水平，表现为葡萄糖耐量减弱；药物干预组大鼠血糖下降速度较模型组明显加快（与模型组比较，p<0.05或p<0.01），化合物1、化合物2改善糖尿病大鼠OGTT的作用与阳性药拜糖平作用相当，如图14所示。

[0217] 瓦草皂苷对T2DM大鼠肝糖原、肌糖原及GSP含量含量的影响

[0218] 模型组肝、肌糖原含量较正常对照组明显减少（P<0.05），而血GSP含量明显增加（P<0.01）。化合物1、化合物2及拜糖平干预后，各组小鼠肝、肌糖原含量均明显增加，血GSP含量明显减少，其中，化合物1、化合物2作用明显，强于阳性药拜糖平，如图15～17所示。

[0219] 讨论

[0220] 目前国内糖尿病的研究多采用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)或四氧嘧啶大剂量注射来制备糖尿病动物模型，其作用机理都是选择性损伤胰腺β细胞，引起细胞坏死，导致血胰岛素不同程度下降伴血糖升高，多形成1型糖尿病，其胰岛素分泌缺乏的特点与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的病理过程和临床特征不符。为此，通过饮食结合亚致病剂量链脲佐菌素腹腔注射的方法制备了T2DM模型。

[0221] 各组造模后的血糖值，与空白对照组相比较全部处于明显的高血糖状态，说明STZ造高血糖模型成功。

[0222] 实验结果表明，化合物1和化合物2皮下注射给药的降糖作用显著，与阳性药拜糖平组比较，其降糖效果均优于拜糖平。

[0223] T2DM糖尿病大鼠模型组的肝糖原和肌糖原均有所降低，而化合物1组和化合物2组肝糖原和肌糖原含量都明显高于正常对照组，表明化合物1和化合物2可与糖尿病的糖原分解发生抵抗，明显增加肝脏和肌肉中的糖原含量，从而抵抗糖尿病对肝脏和外周组织的损坏，其效果均优于阳性对照药拜糖平组。

[0224] GSP是糖尿病高糖状态下葡萄糖与血清蛋白质分子N末端的氨基上发生非酶促糖基化反应形成的稳定高分子酮胺结构。由于血清白蛋白的半衰期为17-20d，因此，GSP的测定可反映测定前2-3周内的平均血糖水平，不受即时血糖浓度影响。测定结果显示，糖尿病大鼠模型组GSP的数值明显升高，而化合物1组、化合物2组和阳性对照拜糖平组GSP值明显降低，化合物1和化合物2效果均优于阳性对照拜糖平。

[0225] 结论

[0226] 化合物1和2皮下注射有明显的降糖、改善糖耐量、增加肝/肌糖原含量和降低大鼠血GSP作用，是一种有效的皮下注射用降糖生物活性成分。

[0227] 以上仅为本发明较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明精神和原则之内所作任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明保护范围之内。