一种裂殖壶菌及用于生产二十二碳六烯酸油脂的方法

摘要

本发明公开了一种裂殖壶菌及用于生产二十二碳六烯酸油脂的方法。裂殖壶菌(Schizochytrium sp)S056，于2013年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M2013459。该发明采用诱变育种与快速筛选相结合的方法获得稳定高产的裂殖壶菌S056，利用溶解氧探测补料与温度控制技术，调控发酵培养基的葡萄糖浓度，使葡萄糖利用完全，该菌株DHA产量最高可达23g/L，生产率最高可达8.2g/L.d，DHA产品品质高，DHA含量最高达51％。利用该菌株生产DHA，发酵条件简单易控，且适合在无海水或海水晶的低盐度条件下生长，发酵周期短，生产效率高，发酵废水易于处理，很适合工业化应用。

权利要求

1.一种裂殖壶菌(Schizochytrium sp)S056，其保藏编号为CCTCC M2013459。

2.一种生产权利要求1所述裂殖壶菌种子液的方法，其特征在于：(a1)种子培养：

向种子培养基中接入裂殖壶菌(Schizochytrium sp)S056，接种量体积百分比为

1-5％，在摇床转速150-220rpm、培养温度22.0-28.0℃的条件下进行摇瓶培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子液；

(a2)种子扩大培养：

将步骤(a1)得到的摇瓶种子液进行扩大培养，接种量体积百分比为1-5％，搅拌转速3

150-300rpm，通气量0.2-15.0m/h，培养温度22.0-28.0℃的条件下进行种子扩大培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子扩大种子液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(a1)中的种子培养基组分：葡萄糖30.0-60.0g/L，酵母粉5.0-10.0g/L，蛋白胨1.0-5.0g/L，MgSO40.5-2.0g/L，KH2PO41.0-3.0g/L。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a2)中种子培养罐内的种子扩大培养基组分：葡萄糖30.0-60.0g/L，酵母粉5.0-10.0g/L，大豆饼粉0-3.0g/L，NaNO31.0-2.0g/L，MgSO40.5-2.0g/L，KH2PO41.0-3.0g/L。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a1)中种子液的培养周期为

20-24h。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a2)中，种子扩大培养的培养周期为

20-24h，种子达到对数期时的pH值范围在4.3-4.7。

7.一种利用权利要求2所述裂殖壶菌种子液生产二十二碳六烯酸油脂的方法，其特征在于：包括下述步骤：(b1)发酵罐放大培养：

将种子扩大培养液接入发酵罐中进行培养，培养温度24-30℃，接种量体积百分比为5-10％；通过控制一定范围的搅拌转速，使发酵液中的溶解氧浓度维持在10-15％，当发酵液中的溶解氧浓度开始回升，维持此时通气量和搅拌转速不变，同时降低培养温度至

15-23℃，通过流加浓度为300.0-500.0g/L的葡萄糖溶液来维持发酵液中的溶解氧浓度，当发酵液中的溶解氧浓度对葡萄糖的响应变低，停止流加，继续培养至葡萄糖消耗完全，发酵周期80-90h；

(b2)发酵结束后收集湿菌体，得到富含DHA的油脂。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(b1)中，10L发酵罐的搅拌转速3

为200-400rpm，通气量为0.3-0.4m/h；100L发酵罐的搅拌转速为200-400rpm，通气量为

3 3

3.0-4.0m/h；1000L发酵罐的搅拌转速在150-300rpm，通气量为12.0-15.0m/h；10000L发3

酵罐的搅拌转速在50-150rpm，通气量为30.0-35.0m/h。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(b1)中，开始时的培养温度

25.0-28.0℃，后来降低培养温度至20-23℃。

说明书

一种裂殖壶菌及用于生产二十二碳六烯酸油脂的方法

技术领域

[0001] 本发明属于发酵领域，涉及一种裂殖壶菌及用于生产二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法。

背景技术

[0002] DHA属于多不饱和脂肪酸，具有十分重要的生理功能，是人体自身不能大量合成但又不可缺少的重要营养素。DHA大量存在于人体视网膜及大脑皮层的神经组织中，有促进脑部及视力发育，提高智力，改善记忆力和视力的作用；此外，它还能阻止胆固醇在血管壁上沉积，预防或减轻动脉粥样硬化及冠心病的发生。

[0003] 传统DHA的生产途径主要来源于深海鱼油的提取纯化，而深海鱼油资源十分有限，生产成本高，品质不稳定，产量远不能满足市场需求，且近年来海洋环境遭到严重破坏，使其安全性受到严重质疑，迫切需要寻找一种可规模化生产DHA的新途径。目前，已发现一些低等海洋细菌、海洋真菌和微藻类，如希瓦氏菌(Shewanella)、破囊壶菌(Thraustochytrium)、裂殖壶菌(Schizochytrium)、寇氏隐甲藻(Crythecodinium cohnii)等都能合成DHA。由于微生物具有生长快、营养要求低、且易于进行大规模培养等特点，成为规模化生产DHA的首选途径。为此，研究者进行了有关微生物发酵生产DHA的探索，目前为止，利用裂殖弧菌发酵生产DHA的具有代表性的专利8篇，其中：

[0004] 授权公告号CN1264967C是较早公开的一种利用裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，但生长率较低，仅为1.65g/L.d；随着对利用裂殖壶菌生产DHA的关注度逐渐增加，技术水平也不断提高，DHA生产率也逐渐提高；授权公告号CN101824442B公开了一种裂殖壶菌利用豆粕水解液为主要氮源的生产方法，在降低培养基成本的同时，生产率也有所提高，为2.02g/L.d，但该生产率与规模化生产仍有一定的距离；

[0005] 申请公开号CN101892160A公开了一种裂殖壶菌的工业化应用，该菌株DHA产量为15.3g/L，生产率为4.08g/L.d，DHA含量偏低，仅为35-40％，因此，DHA油脂品质有待提高；
申请号CN102888348A公开了利用裂殖壶菌高密度发酵生产DHA油脂的方法，该菌株DHA产量为17.5g/L，生产率4.12g/L，但该菌株DHA含量偏低，约为35％；

[0006] 授权公告号CN101519676B公开了一种利用裂殖壶菌发酵生产DHA油脂的方法，DHA生产率为4.86g/L.d，DHA含量50％左右，生产率还有进一步提升的空间；授权公告号CN101812484B公开了高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，DHA产量高达26-30g/L，生产率约6.0g/L.d，但由于发酵培养基组分含有大量酵母膏和蛋白胨，导致生产成本较高，同时整个发酵过程需要维持在较小pH值范围，必须通过经常性流加酸碱物质严格控制pH值，故大生产过程中存在染菌的风险。此外，其发酵过程要求溶解氧浓度控制在30-50％，能耗较高；

[0007] 申请公布号CN102864111A公开了一种产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株，该菌株DHA生产率为7.63g/L.d，但其发酵培养基中海水晶需要量达20g/L，海水晶中的氯离子对发酵罐设备具有较强的腐蚀作用，因此，该方法在后期产业化应用过程中对设备材质要求高，大大增加了固定资产的投入，且在发酵过程中，一直维持葡萄糖浓度在15g/L，使发酵废水BOD值偏高，处理困难；申请公布号CN102899254A公开了一种裂殖壶菌高密度发酵生产DHA的方法，该菌株生产率高达7.2-8.5g/L.d，采用人工海水替代了海水晶，该配方虽然降低了氯离子对发酵设备的腐蚀，但高浓度Na2SO4(24g/L)的添加，使得发酵废液含有高浓度的盐，处理困难，且在人工海水中添加了各种重金属，例如锰、钴、镍等，严重影响产品品质。

[0008] 因此，进一步筛选适应性强的DHA油脂优良生产菌株，简化发酵工艺，通过利用廉价氮源替代、提高DHA生产率、降低废水处理难度等降低生产成本和提高产品品质，成为大规模发酵生产DHA亟待研究和解决的问题。

发明内容

[0009] 针对以上问题，本发明提供了一种裂殖壶菌、种子液及用于生产二十二碳六烯酸油脂的方法，本发明利用裂殖壶菌生产DHA，其操作简单，可以显著缩短发酵周期，提高DHA生产率，且菌种适应性强，无需海水或者海水晶进行发酵生产，所需盐度低，使DHA油脂中无重金属残留，在提高了产品品质的同时，降低了废水处理难度。

[0010] 本发明提供的裂殖壶菌，其分类命名为裂殖壶菌(Schizochytrium sp)S056，于2013年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M2013459。

[0011] 本发明提供的所述裂殖壶菌生产种子液的方法，其特征在于：

[0012] (a1)种子培养：

[0013] 向种子培养基中接入裂殖壶菌(Schizochytrium sp)S056，接种量为1-5％(V/V)，在摇床转速150-220rpm、培养温度22.0-28.0℃的条件下进行摇瓶培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子液；

[0014] (a2)种子扩大培养：

[0015] 将步骤(a1)得到的摇瓶种子液进行扩大培养，接种量体积百分比为1-5％，搅拌3
转速150-300rpm，通气量0.2-15.0m/h，培养温度22.0-28.0℃的条件下进行种子扩大培养，使裂殖壶菌菌种生长到达对数期，获得种子扩大种子液。

[0016] 利用上述裂殖壶菌种子液生产二十二碳六烯酸油脂的方法，包括下述步骤：

[0017] (b1)发酵罐放大培养：

[0018] 将种子扩大培养液接入发酵罐中进行培养，培养温度24-30℃，接种量体积百分比为5-10％；通过控制一定范围的搅拌转速，使发酵液中的溶解氧浓度维持在10-15％，当发酵液中的溶解氧浓度开始回升，维持此时通气量和搅拌转速不变，同时降低培养温度至15-23℃，通过流加浓度为300.0-500.0g/L的葡萄糖溶液来维持发酵液中的溶解氧浓度，当发酵液中的溶解氧浓度对葡萄糖的响应变低，停止流加，继续培养至葡萄糖消耗完全，发酵周期80-90h；

[0019] (b2)发酵结束后收集湿菌体，得到富含DHA的油脂。

[0020] 上述技术方案可以采用下述方式中的任一种或任几种进行改进：

[0021] 所述步骤(a1)中的种子培养基组分：葡萄糖30.0-60.0g/L，酵母粉5.0-10.0g/L，蛋白胨1.0-5.0g/L，MgSO40.5-2.0g/L，KH2PO41.0-3.0g/L；

[0022] 所述步骤(a2)中种子培养罐内的种子扩大培养基组分：葡萄糖30.0-60.0g/L，酵 母 粉 5.0-10.0g/L，大 豆 饼 粉 0-3.0g/L，NaNO31.0-2.0g/L，MgSO40.5-2.0g/L，KH2PO41.0-3.0g/L；

[0023] 步骤(b1)中发酵罐内的发酵培养基组分：葡萄糖80.0-100.0g/L，酵母粉10.0-20.0g/L，大豆饼粉0-8.0g/L，MgSO40.5-2.0g/L，KH2PO41.0-3.0g/L，NaNO33.0-5.0g/L，Na2SO45.0-10.0g/L；

[0024] 步骤(a1)中，种子液的培养周期为20-24h，步骤(a2)中，种子扩大培养的培养周期为20-24h，种子达到对数期时的pH值范围在4.3-4.7；

[0025] 步骤(b1)中，100L发酵罐的搅拌转速为200-400rpm，通气量为3.0-4.0m3/h；3
1000L发酵罐的搅拌转速在150-300rpm，通气量为12.0-15.0m/h；10000L发酵罐的搅拌转
3
速在50-150rpm，通气量为30.0-35.0m/h。

[0026] 步骤(b2)中，将离心收集到的湿菌体进行破壁(如采用碱性蛋白酶，或者中性纤维素酶和碱性蛋白酶进行酶解破壁)，进行萃取(如采用正己烷)，回收萃取溶剂，得含有DHA的油脂。

[0027] 上述技术方案中，所述裂殖壶菌(Schizochytrium sp)S056是通过紫外-盐酸胍复合诱变和基于高产菌株形态特征的快速筛选获得的，其富含DHA油脂，菌种保藏号：CCTCC M2013459。所述基于高产菌株形态特征是指筛选其中细胞直径较大的裂殖壶菌菌株。

[0028] 所述裂殖壶菌S056，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，菌株保藏号：CCTCC M2013459，保藏日：2013年9月29日。

[0029] 本发明优点在于：

[0030] 选育到一株高效发酵生产富含DHA油脂的裂殖壶菌，其发酵周期短，发酵过程pH值不需要控制，故发酵过程污染几率很小；该菌株发酵所需的溶解氧浓度低，故发酵过程能耗较低；该菌株适合在不含海水或者海水晶的较低盐浓度的条件下快速生长，因此，对发酵设备的材质要求低，大生产的固定资产投入明显减少，且所生产的DHA油脂中不存在重金属残留；该菌株还可采用廉价的大豆饼粉作为氮源替代部分酵母粉，且其利用碳源完全，发酵废水的残糖非常低、易于处理，从而显著降低了生产成本；此外，该菌株稳定性很好，其种子罐中的菌体仍可通过补加新鲜的无菌种子培养基，制备种子接入下一个发酵生产罐中进行新一轮的发酵生产，因此，可以显著减少种子制备量及其制备时间，大幅降低生产成本。该菌株生产的DHA产量最高可达23g/L，生产率最高可达8.2g/L.d，平均生产率为6.0-6.4g/L.d，DHA含量最高达51％；发酵培养基成分简单、成本较低，发酵条件简单易控，发酵设备投入成本较低，且已成功应用于10吨规模的发酵生产，同样适合于DHA更大规模的工业化发酵生产。

[0031] 以上富含DHA油脂的发酵生产方法，可以通过进一步增加种子罐放大级数，同时满足发酵过程中的溶氧控制补料及温度控制条件，可实现更大规模的发酵生产。

附图说明

[0032] 图1是裂殖壶菌菌落形态图；

[0033] 图2是裂殖壶菌生长繁殖显微图；

[0034] 图3是裂殖壶菌中脂肪酸组成的气相色谱分析。

具体实施方式

[0035] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

[0036] 取一定量的水样，将其涂布于高盐的YPD固体培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母粉10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，琼脂20.0g/L，海水晶10.0g/L)上，25.0℃培养48h，获得大量单菌落，挑取单菌落于液体培养基中，在摇床转速180rpm、培养温度25.0℃的条件下进行摇瓶培养72h后，分别对菌体进行染色，显微镜观察，筛选得到产油量高的菌株，利用气相色谱仪对以上菌株油脂的脂肪酸组分进行分析，选取脂肪酸组分中含有DHA且含量较高的一株，进一步通过菌落形态及显微结构观察，以及18s rDNA的分子进化分析，鉴定该菌株为裂殖壶菌。

[0037] 将该裂殖弧菌经多次紫外线-亚硝基胍复合诱变，诱变方法为，利用0.5mL PBS缓冲液(100mmol/L，pH7.0)制成裂殖壶菌菌悬液，再加入0.5mL2.5mg/mL亚硝基胍溶液，30℃处理1h；无菌条件下离心上述处理液，用蒸馏水洗涤菌体使其菌液OD650达到0.4-0.6左右后，倒入培养皿，使该菌液成为厚度1-5mm的薄层液体，再于25W紫外灯下，40mm距离处照射30秒，在无菌条件下离心经上述紫外处理的菌体，并将其重新悬浮与1mL液体YPD培养基中，涂布于固体YPD平板，于25℃条件下黑暗培养48h至长出单菌落，诱变后长出的单菌落大小不等，筛选其中细胞直径较大的裂殖壶菌菌株，以此作为高产菌株形态特征进行快速筛选，分别接入含1.5mL液体YPD(配方同前)培养基的96孔高通量筛选设备中，在摇床转速200rpm条件下震荡培养72h，离心获得生物量较高的菌株；

[0038] 将获得的生物量较高的菌株，进一步接入含30mL液体YPD培养基的250mL三角瓶中，在摇床转速180rpm条件下震荡培养72h，以油脂量及DHA含量为指标进行筛选。采用正己烷溶剂萃取各菌株中油脂，进一步利用BF3-甲醇法对以上油脂进行甲酯化处理，即取油脂0.05g，加入1mL的1mol/L的KOH-CH3OH，60℃水浴15min，冷却加2mL三氟化硼乙醚2mL，60℃水浴2min，加入正己烷1mL，饱和氯化钠溶液1mL，吸取上清，利用GC-MS检测油脂中各组分的含量和比例，将其中DHA含量较高的一株命名裂殖壶菌S056，菌株保藏号为CCTCC M2013459。

[0039] 实施例1.DHA产生菌的筛选

[0040] 1)取一定量的水样，涂布于高盐的YPD固体培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母粉10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，琼脂20.0g/L，海水晶10.0g/L)上，25℃培养48h，获得多株单菌落。

[0041] 2)分别挑取单菌落于液体培养基中，在摇床转速180rpm、培养温度25.0℃的条件下进行摇瓶培养72h后，采用苏丹III对菌体染色约1h，显微镜观察，筛选得到几株产油量高的菌株。

[0042] 3)利用GC-MS方法分别对以上几株菌的油脂组成成分进行分析，其中一株菌具有较高含量的DHA，具体含量为34.8％。

[0043] 4)将该株菌在25℃的YPD固体培养基中培养2天，肉眼观察单菌落，呈浅黄色，表面光滑、饱满，如图1所示，进一步利用光学显微镜对其生长过程进行观察，该菌株以二分裂法进行繁殖，繁殖过程中形成四分体结构，如图2所示。以上形态特征及繁殖方式与已报道的裂殖壶菌相同。

[0044] 5)进一步采用18s rDNA分子进化分析的方法对该菌株进行鉴定，即以裂解法提取该菌株的DNA，通过对其18s rDNA的扩增与测序，将测序所得的结果在NCBI库中进行比对，比对结果显示，该菌株的18s rDNA的序列与已报的裂殖壶菌的序列同源性高达99％。

[0045] 因此，根据以上实验分析结果，将该DHA产生菌鉴定为裂殖壶菌。实施例2.裂殖壶菌的诱变育种

[0046] 1)挑取裂殖弧菌单菌落于含50mL液体YPD培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母粉10.0g/L，蛋白胨20.0g/L)的250mL三角瓶中，在培养温度25℃，摇床转速180rpm的条件下培养48h，6000g离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液(100mmol/L，pH7.0)冲洗1次，加入
0.5mL PBS缓冲液(100mmol/L，pH7.0)制成菌悬液。

[0047] 2)加入0.5mL2.5mg/mL亚硝基胍溶液，30℃处理1h；无菌条件下离心上述处理液，用蒸馏水洗涤菌体使其菌液OD650达到0.4-0.6后，倒入培养皿，使该菌液成为厚度1-5mm的薄层液体，再于25W紫外灯下，40mm距离处照射0秒(对照)，10秒，20秒，30秒，40秒，50秒，60秒，再在无菌条件下离心经上述紫外处理的菌体，并将其重新悬浮与1mL液体YPD培养基中，涂布于固体YPD平板。于25℃条件下黑暗培养48h至长出单菌落，计算不同条件下的致死率(见表一)。根据育种实践经验，致死率在70％左右的诱变剂量有利于正突变的产生，因此，根据致死曲线，综合考虑该菌株对亚硝基胍的敏感程度，挑取致死率在70％左右，诱变时间为30秒的单菌落，重新对菌株进行诱变，诱变时间为30秒，方法同前。

[0048] 3)诱变后长出的单菌落大小不等，筛选其中细胞直径较大的裂殖壶菌菌株(如直径在20-25μm)，以此作为高产菌株形态特征进行快速筛选，分别接入含1.5mL液体YPD培养基(配方同前)的96孔高通量筛选设备中，在摇床转速200rpm条件下震荡培养72h，离心获得生物量较高的菌株12株。

[0049] 4)将获得的生物量较高的菌株，进一步接入含30mL液体YPD培养基的250mL三角瓶中，在摇床转速180rpm条件下震荡培养72h，以DHA油脂含量及DHA在油脂中的含量为指标进行筛选。筛选出DHA含量较高的一菌株，将该株菌连续传代10次以上，采用液体YPD培养基(配方同前)进行发酵培养，检测结果稳定。其DHA含量为44.42％，命名为裂殖壶菌S056，菌株保藏号CCTCC M2013459；

[0050] 裂殖壶菌S056菌体油脂脂肪酸组成的气相质谱检测结果如图3，具体的脂肪酸的含量见表二。

[0051] 实施例3.培养温度对菌体生长和DHA合成的影响

[0052] 1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基(葡萄糖50.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，MgSO42.0g/L，KH2PO42g/L)，接种量3％，在培养温度20℃，摇床转速220rpm条件下培养24h；

[0053] 2)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养液(葡萄糖90.0g/L，酵母粉20.0g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO41.5g/L，NaNO33.0g/L，Na2SO410.0g/L)；121℃，灭菌30min，冷却备用。共配制15瓶，每3瓶为一个平行。

[0054] 3)每瓶按照10％的接种量接入培养好的种子液，分别在15℃，18℃，20℃，23℃，25℃，28℃，30℃条件下振荡培养60h，振荡转速为220rpm，6000g离心10min收集菌体，离心收集菌体，利用中性纤维素酶和碱性蛋白酶进行破壁后，利用正己烷提取获得DHA油脂，结果见表三，表明该裂殖壶菌菌体生长及DHA合成所需的温度不同，较高的温度有利于菌体生长，而较低的温度有利于促进DHA合成。

[0055] 实施例4.不同溶解氧浓度对菌体生长和DHA合成的影响

[0056] 1)配制种子培养基：葡萄糖60.0g/L，酵母粉10.0g/L，蛋白胨4.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用。

[0057] 2)配制发酵培养基：葡萄糖100.0g/L，酵母粉18.0g/L，大豆饼粉4.0g/L，MgSO42.0g/L，KH2PO41.0g/L，NaNO34.0g/L，Na2SO48.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用；

[0058] 3)按照5％的接种量，将培养好的种子液接入含有200mL上述种子培养基的500mL三角瓶中，在28℃的摇床中以180rpm转速培养24h，此时pH值为4.7；再按5％接种量，将培养好的种子液接入装有7L种子培养基的10L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速3
200rpm，通气量0.4m/h的条件下培养20h，此时，pH值为4.5。

[0059] 4)按照5％的接种量，将培养好的种子液接入装有70L如上所述发酵培养液的100L发酵罐中。维持发酵温度25℃，通过调节通气量和搅拌转速维持DO值在不同浓度，
5％，10％，15％，20％，30％，50％，培养60h后对发酵结果进行分析，结果见表四，表明较低的溶解氧浓度范围(10-15％)更有利于该菌体生长及DHA合成。

[0060] 实施例5.利用100L发酵罐发酵生产含有DHA油脂的方法

[0061] 1)配制种子培养基：葡萄糖60.0g/L，酵母粉10.0g/L，蛋白胨4.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用。

[0062] 2)配制发酵培养基：葡萄糖100.0g/L，酵母粉18.0g/L，大豆饼粉4.0g/L，MgSO42.0g/L，KH2PO41.0g/L，NaNO34.0g/L，Na2SO48.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用；

[0063] 3)按照5％的接种量，将培养好的种子液接入含有200mL上述种子培养基的500mL三角瓶中，在28℃的摇床中以180rpm转速培养24h，此时pH值为4.7，按5％接种量，将培养好的种子液接入装有7L种子培养基的10L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速300rpm，3
通气量0.2m/h的条件下，培养24h，此时，pH值为4.5。

[0064] 4)按照5％的接种量，将培养好的种子液接入装有70L如上所述发酵培养基的3
100L发酵罐中。维持发酵温度25℃，通气量3.0m/h，通过控制搅拌转速(200-400rpm)维持DO值在15％，在发酵至50h，DO值开始回升，此时维持搅拌转速和通气量不变，降低发酵温度至22℃，开始流加葡萄糖浓度为300.0g/L的溶液，维持DO值在15％，流加至DO值对流加的葡萄糖响应低，停止流加，当发酵液中葡萄糖浓度为零时，即培养82h结束发酵，6000g离心10min收集菌体，利用中性纤维素酶和碱性蛋白酶进行破壁后，利用正己烷提取获得含有DHA的油脂。取样检测，此时菌体干重达62.9g/L，DHA含量50.03％，DHA产量21.87g/L。

[0065] 实施例6.利用1000L发酵罐发酵生产DHA油脂的方法

[0066] 1)配制种子培养基：葡萄糖45.0g/L，酵母粉6.0g/L，蛋白胨5.0g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO42.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用。

[0067] 2)配制种子扩大培养基：葡萄糖45.0g/L，酵母粉6.0g/L，大豆饼粉1.0g/L，NaNO32.0g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO42.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用。

[0068] 3)配制发酵培养基：葡萄糖80.0g/L，酵母粉10.0g/L，大豆饼粉8g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO35.0g/L，Na2SO410.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用。

[0069] 4)按照5％的接种量，将培养好的种子液接入含有200mL上述种子培养基的500mL三角瓶中，在25℃的摇床中以220rpm转速培养20h，按4％的接种量接入装有7L种子培养3
基的10L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速300rpm，通气量0.3m/h的条件下培养22h，此时pH值为4.4。

[0070] 5)按照5％的接种量，将培养好的种子液接入装有60L如上所述种子扩大培养基3
的100L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速220rpm，通气量3.0m/h的条件下培养24h，此时pH值4.5。

[0071] 6)按照6％的接种量，将培养好的种子液接入装有600L如上述发酵培养基的3
1000L发酵罐中，维持发酵温度26℃，通气量13.0m/h，通过控制搅拌转速(150-300rpm)维持DO值在12％，在发酵至44h，DO值开始回升，此时维持搅拌转速和通气比不变，降低发酵温度至22℃，开始流加葡萄糖浓度为500.0g/L的溶液，维持DO值在12％左右，流加至DO值对流加的葡萄糖响应低，停止流加，当发酵液中葡萄糖浓度为零时，即培养88h结束发酵，取样，6000g离心10min收集菌体，利用中性纤维素酶和碱性蛋白酶进行破壁后，利用正己烷提取获得含有DHA的油脂。取样检测，此时菌体干重达61.6g/L，DHA含量49.29％，DHA产量21.96g/L。

[0072] 实施例7.利用1000L发酵罐发酵生产DHA油脂的方法

[0073] 1)配制种子培养基：葡萄糖50.0g/L，酵母粉10.0g/L，蛋白胨2.0g/L，MgSO40.8g/L，KH2PO41.5g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用；

[0074] 2)配制种子扩大培养基：葡萄糖50.0g/L，酵母粉10.0g/L，NaNO32.0g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO42.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用。

[0075] 3)配制发酵培养基：葡萄糖100.0g/L，酵母粉15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO41.0g/L，NaNO31.0g/L，Na2SO410.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用。

[0076] 4)按照10％的接种量，将培养好的种子液接入含有200mL上述种子培养基的500mL三角瓶中，在25℃的摇床中以200rpm转速培养24h，此时pH值为4.7，按4％的接种量将培养好的种子液接入装有7L种子培养基的10L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速
3
300rpm，通气量0.3m/h的条件下，培养22h；

[0077] 5)按照5％的接种量，将培养好的种子液接入含60L如上所述种子扩大培养基的3
100L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速200rpm，通气量3.5m/h的条件下，培养22h，同时再加入已灭菌的30L种子培养基到100L发酵罐继续培养，在25℃培养条件下，搅拌转速
3
200rpm，通气量3.5m/h的条件下，培养24h，用于下一批次发酵；

[0078] 6)按照7％的接种量，将培养好的种子液接入装有750L如上述发酵培养基的3
1000L发酵罐中，维持发酵温度25℃，通气量12m/h，通过控制搅拌转速(150-300rpm)维持DO值在10％，在发酵至48h，DO值开始回升，此时维持搅拌转速和通气比不变，降低发酵温度至20℃，开始流加葡萄糖浓度为500.0g/L的溶液，维持DO值在10％左右，流加至DO值对流加的葡萄糖响应低，停止流加，当发酵液中葡萄糖浓度为零时，即培养80h，结束发酵，
6000g离心10min收集菌体，利用中性纤维素酶和碱性蛋白酶进行破壁后，利用正己烷提取获得含有DHA的油脂。取样检测，此时菌体干重达57.2g/L，DHA含量50.87％，DHA产量
20.06g/L。

[0079] 实施例8.利用10000L发酵罐发酵生产DHA油脂的方法

[0080] 1)配制种子培养基：葡萄糖60.0g/L，酵母粉8.0g/L，蛋白胨4.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO41.5g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用；

[0081] 2)配制种子扩大培养基：葡萄糖60.0g/L，酵母粉8.0g/L，大豆饼粉3.0g/L，NaNO31.0g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO42.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用。

[0082] 3)配制发酵培养基：葡萄糖90.0g/L，酵母粉18.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO42.0g/L，NaNO33.0g/L，Na2SO45.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用。

[0083] 4)按照5％的接种量，将培养好的种子液接入装有200mL上述种子培养基的500mL三角瓶中，在25℃的摇床中以200rpm转速培养30h，按2％的接种量将培养好的种子液接3
入装有7L种子培养基的10L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速200rpm，通气量0.5m/h的条件下，培养22h；

[0084] 5)按照5％的接种量，将培养好的种子液接入装有60L如上所述种子培养基的3
100L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速200rpm，通气量4.0m/h的条件下，培养23h，按照4％的接种量接入装有750L如上述种子扩大培养基的1000L发酵罐中，在培养温度
3
25℃，搅拌转速150rpm，通气量15m/h的条件下，培养23h，同时再加入已灭菌的30L种子
3
培养基到100L发酵罐继续培养，在25℃培养条件下，搅拌转速200rpm，通气量3.5m/h的条件下，培养24h，用于下一批次发酵；

[0085] 6)按照4％的接种量，将培养好的种子液接入装有7000L如上述发酵培养基的3
10000L发酵罐中，维持发酵温度28℃，通气量30.0m/h，通过控制搅拌转速(50-150rpm)维持DO值在13％，在发酵至48h，DO值开始回升，此时维持搅拌转速和通气比不变，降低发酵温度至23℃，开始流加葡萄糖浓度为500.0g/L的溶液，维持DO值在13％左右，流加至DO值对流加的葡萄糖响应低，停止流加，当发酵液中葡萄糖浓度为零时，即培养85h结束发酵，
6000g离心10min收集菌体，利用中性纤维素酶和碱性蛋白酶进行破壁后，利用正己烷提取获得含有DHA的油脂。取样检测，此时菌体干重达62.9g/L，DHA的含量51.14％，DHA产量
21.6g/L。

[0086] 实施例9.利用10000L发酵罐发酵生产DHA油脂的方法

[0087] 步骤1-5同实施例8，步骤6按照10％的接种量，直接将步骤5培养好的发酵液直接接入装有7000L如上述发酵培养基的10000L发酵罐中，维持发酵温度28℃，通气量3
33.0m/h，通过控制搅拌转速(50-150rpm)维持DO值在10％，在发酵至42h，DO值开始回升，此时维持搅拌转速和通气比不变，降低发酵温度至23℃，流加葡萄糖浓度为500.0g/L的溶液，维持DO值在10％左右，流加至DO值对流加的葡萄糖响应低，流加至DO值对流加的葡萄糖响应低，停止流加，当发酵液中葡萄糖浓度为零时，即培养85h结束发酵，6000g离心10min收集菌体，利用中性纤维素酶和碱性蛋白酶进行破壁后，利用正己烷提取获得含有DHA的油脂。取样检测，此时菌体干重达58.7g/L，DHA含量48.79％，DHA产量21.25g/L。

[0088] 实施例10.利用10000L发酵罐发酵生产DHA油脂的方法

[0089] 1)配制种子培养基：葡萄糖50.0g/L，酵母粉10.0g/L，蛋白胨4.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用；

[0090] 2)配制种子扩大培养基：葡萄糖50.0g/L，酵母粉10.0g/L，大豆饼粉2.0g/L，NaNO31.0g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO42.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用。

[0091] 3)配制发酵培养基：葡萄糖90.0g/L，酵母粉18.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO34.0g/L，Na2SO410.0g/L；121℃，灭菌30min，冷却备用。

[0092] 4)按照5％的接种量，将培养好的种子液接入装有200mL上述种子培养基的500mL三角瓶中，在25℃的摇床中以200rpm转速培养20h，按2％的接种量将培养好的种子液接3
入装有7L种子培养基的10L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速200rpm，通气量0.3m/h的条件下，培养24h；

[0093] 5)按照5％的接种量，将培养好的种子液接入装有60L如上所述种子培养基的3
100L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速180rpm，通气量4.0m/h的条件下，培养21h，此时pH值为4.5，按照4％的接种量接入装有600L种子扩大培养基的1000L发酵罐中，在25℃
3
培养条件下，搅拌转速180rpm，通气量13m/h的条件下，培养24h，同时在1000L发酵罐中补加等量的无菌种子扩大培养基，同条件培养24h，用于下一批次的发酵；

[0094] 6)按照4％的接种量，将培养好的种子液接入装有7000L如上述发酵培养基的3
10000L发酵罐中，维持发酵温度28℃，通气量35.0m/h，通过控制搅拌转速(50-150rpm)维持DO值在12％，在发酵至52h，DO值开始回升，此时维持搅拌转速和通气比不变，降低发酵温度至23℃，流加葡萄糖浓度为500.0g/L的溶液，维持DO值在12％左右，流加至DO值对流加的葡萄糖响应低，停止流加，当发酵液中葡萄糖浓度为零时，即培养90h结束发酵，6000g离心10min收集菌体，利用中性纤维素酶和碱性蛋白酶进行破壁后，利用正己烷提取获得含有DHA的油脂。取样检测，此时菌体干重达60.1g/L，DHA含量49.78％，DHA产量22.5g/L。

[0095] 实施例11.利用10000L发酵罐发酵生产富含DHA油脂的方法

[0096] 步骤1-4同实施例10，步骤5按照4％的接种量，将培养好的种子液接入装有3
7000L如上述发酵培养基的10000L发酵罐中，维持发酵温度28℃，通气量33.0m/h，通过控制搅拌转速(50-150rpm)维持DO值在10％，在发酵至45h，DO值开始回升，此时维持搅拌转速和通气比不变，降低发酵温度至23℃，流加葡萄糖浓度为400.0g/L的溶液，维持DO值在
10％左右，流加至DO值对流加的葡萄糖响应低，停止流加，当发酵液中葡萄糖浓度为零时，即培养90h结束发酵，6000g离心10min收集菌体，利用中性纤维素酶和碱性蛋白酶进行破壁后，利用正己烷提取获得含有DHA的油脂。取样检测，此时菌体干重达63.9g/L，DHA含量
50.05％，DHA产量22.97g/L。实施例12.利用10000L发酵罐发酵生产DHA油脂的方法[0097] 步骤1-4同实施例10，步骤5按照4％的接种量，将培养好的种子液接入装有
3
7000L如上述发酵培养基的10000L发酵罐中，维持发酵温度28℃，通气量30.0m/h，通过控制搅拌转速(50-150rpm)维持DO值在10％，在发酵至48h，DO值开始回升，此时维持搅拌转速和通气比不变，降低发酵温度至23℃，流加葡萄糖浓度为500.0g/L的溶液，维持DO值在
10％左右，流加至DO值对流加的葡萄糖响应低，停止流加，当发酵液中葡萄糖浓度为零时，即培养90h结束发酵，6000g离心10min收集菌体，利用中性纤维素酶和碱性蛋白酶进行破壁后，利用正己烷提取获得含有DHA的油脂。取样检测，此时菌体干重达62.3g/L，DHA含量
49.27％，DHA产量23.01g/L。

[0098] 以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例和附图所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

[0099] 表一：不同紫外线照射时间下裂殖壶菌的致死率

[0100]

[0101] 表二：裂殖壶菌中主要脂肪酸组成及百分含量的GC-MS分析结果

[0102]脂肪酸组成 C14：0 C15：0 C16：0 C16：1 C18：0 C20：4 C22：5 C22：6 其他含量(％) 2.76 2.73 34.45 0.31 1.48 1.53 8.73 44.42 3.59

[0103] 表三：培养温度对菌体生长及DHA合成的影响

[0104]

[0105]

[0106] 表四：不同溶解氧浓度对菌体生长及DHA合成的影响

[0107]