一株浅青紫链霉菌及其应用

摘要

本发明公开了一株浅青紫链霉菌及其应用。所述浅青紫链霉菌的保藏编号为CGMCC No.8083。所述应用是该浅青紫链霉菌在生产蓝色素中的应用，具体包括：将所述的浅青紫链霉菌接种于种子培养液中进行增殖培养，获得种子液；将所述种子液转接到发酵培养液中进行发酵培养，获得发酵液；从所述发酵液中分离、干燥得到蓝色素粗制剂。与现有技术相比，本发明公开了一株可产蓝色素的浅青紫链霉菌，丰富了蓝色素产生菌的种质资源；该浅青紫链霉菌所产的蓝色素不仅性能稳定，具有一定的抑菌作用，且OD585最高为15.4。

权利要求

1.一株浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)，其特征在于，命名为浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)jx-02，保藏编号为CGMCC No.8083。

2.如权利要求1所述的浅青紫链霉菌在生产蓝色素中的应用，其特征在于，包括：

1)从保存菌种的试管中挑取菌落进行菌种活化，于37℃下培养48h；

活化培养基的配方为：2％可溶性淀粉，0.05％NaCl，0.05％K2HPO4，0.05％MgSO4，

0.001％FeSO4，2％琼脂；

2)挑取活化平板上的单个菌落转接到种子培养液中进行增殖培养，于28℃下培养

12h，转速200r/min，获取种子液；

种子培养液的配方为：2％可溶性淀粉，0.2％牛肉膏，0.05％NaCl，0.05％K2HPO4，

0.05％MgSO4，0.001％FeSO4·7H2O，其余为水；

3)将种子液以8％接种到发酵培养液中进行发酵培养，于28℃下培养7天，转速200r/min，获取发酵液；

发酵培养液的配方为：2％甘油，0.1％硝酸钾，0.05％无机盐，0.001％FeSO4·7H2O，其余为水；

4)将发酵液pH调至12，8000r/min离心10min，取上清将其pH调至l～2，10000r/min离心10min弃上清，沉淀物真空干燥至恒重。

说明书

一株浅青紫链霉菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一株浅青紫链霉菌及其应用。

背景技术

[0002] 色素是指能够使被媒染物着色的物质，在生产生活及科研中有着广泛的应用。天然色素通常是指利用自然界存在的物质或培养方法生产的次生代谢物质进行一定的加工而制成的色素。由于其具有安全可靠、无毒副作用、色调自然及多功能性等优点，伴随着食品工业、医药工业、日化工业和养殖业等的发展而得到了广泛的应用。

[0003] 加工天然色素的原材料来源广泛（源于动植物、微生物、矿物质等），种类繁多，截至2004年有记载的就有约600种。但现有加工制得的天然色素主要以红、黄色素为主，蓝色素非常稀少，在我国GB2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》中列出的56种色素中蓝色素仅有栀子色素和藻青素两种。由于蓝色是三原色之一，蓝色素可用于多种色调的调配。但由于蓝色素稀少，使得开发天然蓝色素在色素相关领域中具有极大的现实意义。

[0004] 天然蓝色素的自然来源非常有限。现有技术中，无机天然蓝色素主要来源于自然蓝钒矿，有机天然蓝色素则主要来源于植物和微生物材料，如蓼蓝、茶蓝、马蓝、吴蓝、菘蓝等木蓝属植物的叶子可以用于制备靓蓝染料。虽然目前大多数天然蓝色素产品仍是以动植物材料为原料制取的，但这类材料的获取易受季节、气候、产地等因素影响，使得蓝色素的产量非常有限。而利用微生物资源生产天然色素基本不受这些限制，并且，利用微生物发酵生产不仅生产、提取方法都较为简单，而且成本相对较低，是较为理想的蓝色素生产方法。

[0005] 但微生物中可产蓝色素的菌株也十分少见，主要集中于放线菌。已报道的有：海洋链霉菌（Streptommycete sp.）M259（邓祥元等，海洋链霉菌M259高产蓝色素理化性质研究，食品科学，2006，7：35-39.），天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）100菌株（张和春等，天蓝色链霉菌胞内蓝色素提取方法研究，生物技术，2000，3：19-21.）；链霉菌ZLT菌株（李一苇等，一株产蓝色素菌株生物学特性及色素基本性质的研究，生物学杂志，2007，1：41-43.）；还有如公开号为CN 101864380B的中国专利文献公开了一种蓝色素产生菌及其制备的粗制剂和方法，该蓝色素产生菌是一种黄杆菌（Flavobacterium sp.）B29，保藏编号为CGMCC No.3699。

[0006] 现有报道的产蓝色素的微生物菌株的种类及数量还远不能满足各行业对天然蓝色素研究开发的需要，因此，筛选出能大量生产蓝色素的新型微生物菌种和具有不同特性的蓝色素具有重要的科学研究和应用价值。

发明内容

[0007] 本发明提供了一株可产生蓝色素的浅青紫链霉菌（Streptomyces lividans），利用该菌株生产的蓝色素较为稳定，且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌作用。

[0008] 一株浅青紫链霉菌（Streptomyces lividans），分类命名为浅青紫链霉菌（Streptomyces lividans），株号为jx-02，已于2013年8月28日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8083。

[0009] 本发明还提供了所述浅青紫链霉菌在制备蓝色素中的应用。具体包括：

[0010] （1）将所述浅青紫链霉菌接种于种子培养液中进行增殖培养，获得种子液；

[0011] 冷冻保存的浅青紫链霉菌需先进行菌种活化，活化条件为：温度为37℃，时间为48h。挑取活化平板上的单个菌落接种于种子培养液中，进行增殖培养。作为优选，所述增殖培养的条件为：温度为25～30℃，时间为10～14h；作为进一步优选，所述增殖培养的条件为：温度为28℃，时间为12h。更优选地，所述增殖培养为摇床培养，转速为150～200r/min。

[0012] （2）将所述种子液转接到发酵培养液中进行发酵培养，获得发酵液；

[0013] 所述种子液的接种量优选为5～10%，更优选为8%。所述发酵培养的条件优选为：pH为7，温度为25～30℃，时间为6～8天；更优选为pH为7，温度为28℃，时间为7天。

[0014] 针对所述浅青紫链霉菌，本发明在高氏一号培养基的基础上对发酵培养基进行了优化，以1L计，所述发酵培养液包括：18～22g碳源，0.8～1.2g氮源，0.4～0.6g无机盐；优选地，所述发酵培养液包括：20g碳源，1g氮源，0.5g无机盐；更优选地，所述碳源为甘油，所述氮源为硝酸钾。发酵培养也为摇床培养，转速为150～200r/min。在本发明设定的发酵条件下，所述浅青紫链霉菌的蓝色素产量达到最大，OD585可达15.4。

[0015] （3）从所述发酵液中分离、干燥得到所述蓝色素粗制剂；即将发酵液pH调至12，8000r/min离心10min，取上清将其pH调至l～2，10000r/min离心10min弃上清，沉淀物真空干燥至恒重得蓝色素粗制剂。

[0016] 本发明还提供了利用所述浅青紫链霉菌发酵提取获得的蓝色素粗制。该蓝色素的最大吸收波长为585nm左右，分子结构中具有很大的共轭体系，可能有较多共轭双键、苯环或类似苯环的共轭结构，或含杂原子的一些杂环，具体结构还有待进一步分析。

[0017] 研究表明，室外直射光、高温（大于60℃）、氧化剂H2O2、金属离子Fe3+和Cu2+对该蓝+ +色素有明显的破坏作用，而室外散射光、紫外光、还原剂Na2SO3、部分金属离子(如Na、K及
2+
Ca )以及食品添加剂食盐、蔗糖、柠檬酸对该蓝色素无明显影响。本研究结果可为纺织、食品等领域的应用研究提供基础数据。

[0018] 该蓝色素还对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。

[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0020] 本发明公开了一株可产蓝色素的浅青紫链霉菌，丰富了蓝色素产生菌的种质资源；该浅青紫链霉菌所产的蓝色素不仅性能稳定，具有一定的抑菌作用，且OD585最高可达15.4。

附图说明

[0021] 图1为本发明浅青紫链霉菌的平板生长图；

[0022] 图2为本发明浅青紫链霉菌的光学显微镜观察图；

[0023] 图3为本发明浅青紫链霉菌的电子显微镜观察图；

[0024] 图4为本发明浅青紫链霉菌的基因组琼脂糖凝胶电泳图；

[0025] 图5为的16S rRNA琼脂糖凝胶电泳图；

[0026] 图6为本发明浅青紫链霉菌的系统进化位置图；

[0027] 图7为发酵培养基的碳源优化图；

[0028] 图8为发酵培养基的氮源优化图；

[0029] 图9为发酵培养基的碳源浓度优化图；

[0030] 图10为发酵培养基的碳氮比优化图；

[0031] 图11为发酵培养基的无机盐浓度优化图；

[0032] 图12为发酵培养基的亚铁离子浓度优化图；

[0033] 图13为不同pH对蓝色素产量的影响图；

[0034] 图14为不同温度对蓝色素产量的影响图；

[0035] 图15为不同种子液接种量对蓝色素产量的影响图；

[0036] 图16为本发明蓝色素的紫外可见光谱图；

[0037] 图17为pH对本发明蓝色素稳定性的影响图；

[0038] 图18为室外直射光和室内散射光对本发明蓝色素稳定性的影响图；

[0039] 图19为紫外光照射对本发明蓝色素稳定性的影响图；

[0040] 图20为温度对本发明蓝色素稳定性的影响图；

[0041] 图21为氧化剂H2O2和还原剂Na2SO3对本发明蓝色素稳定性的影响图；

[0042] 图22a为不同浓度的蓝色素溶液对10-1稀释大肠杆菌涂布平板的抑菌圈测试图；

[0043] 图22b为不同浓度的蓝色素溶液对10-2稀释大肠杆菌涂布平板的抑菌圈测试图；

[0044] 图23a为不同浓度的蓝色素溶液对10-1稀释金黄色葡萄球菌涂布平板的抑菌圈测试图；

[0045] 图23b为不同浓度的蓝色素溶液对10-2稀释金黄色葡萄球菌涂布平板的抑菌圈测试图；

[0046] 图24a不同浓度的蓝色素溶液对10-1稀释酿酒酵母涂布平板的抑菌圈测试图；

[0047] 图24b不同浓度的蓝色素溶液对10-2稀释酿酒酵母涂布平板的抑菌圈测试图。

具体实施方式

[0048] 实施例1菌株分离和鉴定

[0049] （1）形态学鉴定

[0050] 从宁波某公园土壤样品中筛选分离得到一株产蓝色素的菌株，经过进一步筛选和纯化，将菌株接种到平皿上培养。平板培养3d后，观察产蓝色素菌落特征，发现菌株在高氏一号固体培养基上的培养特征为：菌体生长比细菌缓慢，培养36-48h后开始出现菌落，60-72h后能观察到有蓝色素产生。菌落表面呈灰白色，气生菌丝较茂盛，呈绒毛状，基内菌丝体呈蓝色，能产生可溶性蓝色素（见图1）。

[0051] 经过进一步光学显微镜和电子显微镜镜检观察，我们初步判断该菌株为放线菌，革兰氏阴性菌（见图2和图3）。由图3可见，该菌株的孢子丝较长，有3-5圈螺旋，孢子呈椭圆或长圆形。

[0052] （2）分子鉴定

[0053] 根 据 文 献（Orsini M,Romano-Spica V.A microwave-based method for nucleic acid isolation from environmental samples[J].Let ApplMicrobiol,2001,33:17-20.）的实验步骤提取产蓝色素菌株的基因组，并对提取好的基因组进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。

[0054] 以提取的基因组DNA为模板，利用下列引物对菌株的16S rRNA序列进行PCR扩增，引物序列如下：

[0055] 上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAAC-3′；

[0056] 下游引物：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。

[0057] 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示，产物长度大约为1500bp；并委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行基因测序，碱基序列如SEQ ID No.1所示。将测序结果NCBI中注册，其GenBank号为：KC898819。

[0058] 将得到的基因测序结果用在线的Blast软件（http：//www.ncbi．nlm.nih．gov/blast)进行同源性分析，结果在GenBank中找到多个链霉菌属显著相似的基因序列，其同源性高达98%。通过Blast工具在NCBI蛋白质序列数据库中进行同源性搜索，并利用Clustal W程序进行多重序列比对。利用MEGA4.0软件，采用相邻拼接方法（Neighbor Joining Method），获得该蛋白系统进化树（图6），将该菌鉴定为浅青紫链霉菌。

[0059] 该菌株已于2013年8月28日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.8083。

[0060] 实施例2菌株发酵生产蓝色素

[0061] 从保存菌种的试管中挑取菌落进行菌种活化，于37℃下培养48h；活化培养基的配方为：2%可溶性淀粉，0.05%NaCl，0.05%K2HPO4，0.05%MgSO4，0.001%FeSO4，2%琼脂。

[0062] 然后挑取活化平板上的单个菌落转接到种子培养液中进行增殖培养，于28℃下培养12h，转速200r/min；种子培养液的配方为：2%可溶性淀粉，0.2%牛肉膏，0.05%NaCl，0.05%K2HPO4，0.05%MgSO4，其余为水，0.001%FeSO4·7H2O。

[0063] 最后将种子液接种到发酵培养液中，进行发酵培养。为获得最大产量的蓝色素，对发酵培养基成分、发酵条件进行了一系列优化。

[0064] （1）培养基成分优化

[0065] 1）碳源优化

[0066] 以高氏一号培养基作为对照，用甘油、甘露醇、葡萄糖、蔗糖作为碳源来代替对照培养基中的可溶性淀粉，挑取已经活化好的菌株到250mL培养集中，培养7天后对发酵液离心，取上清液在波长585nm下测定吸光度，比较OD585选择最优碳源，结果见图7。由图7可见，当以甘油为碳源时，OD585最高，为7.01，因此选择甘油为碳源。

[0067] 2)氮源的优化

[0068] 在确定碳源的基础上，用牛肉膏，蛋白胨，酵母膏，（NH4）2SO4作为氮源代替对照培养基中的硝酸钾，挑取已经活化好的菌株到250mL培养集中，培养7天后对发酵液离心，取上清液在波长585nm下测定吸光度，比较OD585选择最优氮源，结果见图8。由图8可见，除硫酸铵外其它四种氮源都能长出蓝色素菌株，硝酸钾作为氮源时具有最高产量的蓝色素，且硝酸钾也是实验室常见的无机氮，所以选择硝酸钾作为最佳氮源。

[0069] 3)碳氮浓度确定以及最佳碳氮比

[0070] 确定最佳碳氮源后，用4%，6%，8%的碳源浓度来代替对照培养基中2%的碳源浓度，挑取已经活化好的菌株到250mL培养集中，培养7天后对发酵液离心，取上清液在波长580nm下测定吸光度，比较OD585选择最优碳源浓度，结果见图9。由图9可见，随着甘油浓度的增加，蓝色素产量逐渐减少，可能是高浓度的碳源抑制了蓝色素的生长，所以选择2%作为最佳碳源浓度。

[0071] 根据最佳碳源浓度，配置不同碳氮比：30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，挑取已经活化好的菌株到250mL培养集中，培养7天后对发酵液离心，取上清液在波长585nm下测定吸光度，比较OD585选择最优碳氮比，结果见图10。由图10可见，碳氮比为20:1的时候蓝色素产量达到最大，所以选择最佳碳氮比为20:1。

[0072] 最佳碳源浓度为2%，最佳碳氮比为20:1，由此可粗略估计最佳氮源浓度为0.1%。

[0073] 4)氯化钠、磷酸氢二钾和硫酸镁等无机盐浓度的优化

[0074] 根据高氏一号培养基上这三个成分1：1：1的比例，分别配置0.025%，0.05%，0.075%，0.1%，0.15%的浓度的培养基，挑取已经活化好的菌株到250mL培养集中，培养7天后对发酵液离心，取上清液在波长585nm下测定吸光度，比较OD585下的吸光度选择最佳浓度，结果见图11。由图11可见，无机盐浓度在0.05%的时候蓝色素产量达到最大，所以选择无机盐浓度为0.05%。

[0075] 5)亚铁离子的优化

[0076] 在已优化条件的基础上，选取0.0005%，0.001%，0.0015%，0.002%对亚铁离子的浓度进行优化，挑取已经活化好的菌株到250mL培养集中，培养7天后对发酵液离心，取上清液在波长585nm下测定吸光度，比较OD585选择最佳亚铁离子浓度，结果见图12。由图12可见，亚铁离子浓度在0.001%和0.0015%之间时产量达到最高，选择0.001%作为最佳亚铁离子浓度。

[0077] （2）发酵条件的优化

[0078] 1)pH的优化

[0079] 在碳氮源，碳氮源浓度以及碳氮比确定之后，对培养基进行pH的优化。起始pH为：5、6、7、8、9。然后挑取已经活化好的菌株到250mL培养集中，培养7天后对发酵液离心，取上清液在波长585nm下测定吸光度，比较OD585选择最优pH，结果见图13。由图13可见，当pH为7时，OD580值最大，表明蓝色素产量最大。

[0080] 2)温度的优化

[0081] 挑取菌株到已优化的培养基中，分别置于25℃、28℃、30℃、33℃、37℃下发酵培养，培养7天后对发酵液离心，取上清液在波长580nm下测定吸光度（OD585），比较OD585选择最佳发酵温度，结果见图14。由图14可见，28℃和30℃时OD585值最大，表明蓝色素产量最大；考虑实验室设备要求，选择28℃为最佳温度。

[0082] 3)接种量的优化

[0083] 将菌株种子液以2%，4%，6%，8%，10%的接种量接种到已优化的培养基上进行发酵培养，培养7天后对发酵液离心，取上清液在波长585nm下测定吸光度（OD585），比较OD585选择最佳接种量，结果见图15。由图15可见，当接种量为8%时，OD585值最大，表明蓝色素产量最大。

[0084] （3）正交试验

[0085] 根据上述优化条件，选取对蓝色素产量影响较大的因素进行正交实验，正交实验设计见表1，共设置甘油浓度、碳氮比、无机盐浓度、接种量四个因素，每个因素设三个水平。

[0086] 表1 正交实验设计

[0087]

[0088] 按照表1的设置进行发酵培养，培养7天后对发酵液离心，取上清液在波长585nm下测定吸光度（OD585），根据吸光度分析正交实验结果（见表2）。

[0089] 表2 正交试验结果

[0090]

[0091] 由表2可见，最优发酵方案为：甘油2%，碳氮比20:1，无机盐浓度0.05%，接种量8%，该正交试验结果与此前的优化结果相一致。

[0092] （4）利用菌株进行蓝色素发酵

[0093] 根据已优化的条件，利用实施例1的浅青紫链霉菌进行蓝色素发酵，具体包括：

[0094] 1）从保存菌种的试管中挑取菌落进行菌种活化，于37℃下培养48h；

[0095] 活化培养基的配方为：2%可溶性淀粉，0.05%NaCl，0.05%K2HPO4，0.05%MgSO4，0.001%FeSO4，2%琼脂；

[0096] 2）挑取活化平板上的单个菌落转接到种子培养液中进行增殖培养，于28℃下培养12h，转速200r/min，获取种子液；

[0097] 种子培养液的配方为：2%可溶性淀，0.2%牛肉膏，0.05%NaCl，0.05%K2HPO4，0.05%MgSO4，0.001%FeSO4·7H2O，其余为水；

[0098] 3）将种子液以8%接种到发酵培养液中进行发酵培养，于28℃下培养7天，转速200r/min，获取发酵液；

[0099] 发酵培养液的配方为：2%甘油，0.1%硝酸钾，0.05%无机盐，0.001%FeSO4·7H2O，其余为水；

[0100] 4）将发酵液pH调至12，8000r/min离心10min，取上清将其pH调至l～2，10000r/min离心10min弃上清，沉淀物真空干燥至恒重。

[0101] 实施例3获取蓝色素基础数据

[0102] 对实施例2制备获得的蓝色素粗制剂进行一系列的测试，以获取该蓝色素的基础数据。

[0103] （1）溶解性

[0104] 取等量蓝色素粗制剂分别溶于10mL无水乙醇，蒸馏水、甲醇、丙酮、二甲亚砜，乙酸乙酯、石油醚中，静止2h后，观察溶解性及颜色变化。

[0105] （2）紫外可见光谱

[0106] 将蓝色素粗制剂溶于水中，将蓝色素水溶液pH值分别调至3、5、7、9、11、13，用UV-2550型紫外可见分光光度计在200-800nm范围内对不同pH下蓝色素水溶液进行扫描，得到蓝色素的紫外可见光谱。

[0107] 由试验（1）和（2）可知，该蓝色素易溶于碱性水溶液，可溶于pH＞3的酸性溶液，不溶于pH＜3的水溶液，可溶于二甲亚砜，不溶于丙酮，石油醚，甲醇，无水乙醇，乙酸乙酯等有机溶剂。可见光谱图见图16。由图16可知，该色素的最大吸收波长为585nm左右，说明该色素的分子结构具有很大的共轭体系，可能有较多共轭双键、苯环或类似苯环的共轭结构，或含杂原子的一些杂环，该色素的具体结构有待进一步解析。

[0108] （3）稳定性

[0109] 1）pH对蓝色素稳定性的影响

[0110] 调节蓝色素水溶液pH值至3、5、7、9、11、13，每隔1h测定吸光值（见图17），并观察其颜色变化（见表3）。

[0111] 表3 pH对蓝色素稳定性的影响

[0112]

[0113]

[0114] 在酸性或碱性条件下，天然色素容易褪色或变色，色素对pH值变化的耐受性，决定着其应用范围。由图17和表3可见，该蓝色素在不同pH下均较为稳定，在酸性条件下，该蓝色素呈红色，pH值3时，最大吸收峰出现在520nm左右；在中性条件下呈淡紫色，最大吸收峰在560nm左右；在碱性条件下呈现蓝色，pH值9时，最大吸收峰在585nm左右，pH值13时，最大吸收峰在620nm左右。出现这种结果的可能原因是，在不同pH下，该蓝色素分子结构中的共轭体系发生变化，从而表现出不同的最大吸收波长和颜色变化。

[0115] 2）光对蓝色素稳定性的影响

[0116] 调节蓝色素水溶液pH值至5、7、9、11，将不同pH值色素水溶液分别以室外直射和室内散射光照射，每隔1h测定吸光值，同时将上述蓝色素水溶液置于紫外灯下照射，每隔10min测定吸光值，并观察颜色变化。结果见图18和图19。

[0117] 由图18和图19可见，该蓝色素在室内散射光和紫外光照射下，吸光值变化不大，稳定性较好；但在室外直射光照射下，该蓝色素收到显著破坏，8h后残存率仅为40%左右。表明在保存和使用该蓝色素的过程中应避免强光直射。

[0118] 3）温度对蓝色素稳定性的影响

[0119] 调节蓝色素水溶液pH值至9，将蓝色素水溶液置于20℃，40℃，60℃，80℃，100℃下恒温放置，每隔1.5h测定其吸光度，并观察颜色变化。结果见图20。

[0120] 由图20可见，该色素溶液在低于60℃的温度下保存9h后，吸光值变化不大，色素的残存率高于80%。在80℃以上条件下，该色素吸光值显著下降，9h后残存率不足30%。说明该色素溶液在低于60℃的温度下较稳定，更高温度对其有较大的破坏作用。

[0121] 4）氧化剂H2O2和还原剂Na2SO3对蓝色素稳定性的影响

[0122] 调节蓝色素水溶液pH值到9，分别加入0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%不同浓度H2O2和Na2SO3，每隔1h取样测定吸光度，并观察颜色变化。结果见图21。

[0123] 由图21可见，氧化剂H2O2对该蓝色素有显著的破坏作用，且浓度越大，影响越明显，当H2O2浓度达0.5%时，色素残存率仅19.4%，说明该蓝色素易被氧化，在保存时应避免氧化剂的混入或加入适量抗氧化剂以延长保存期。

[0124] 还原剂Na2SO3对该蓝色素的稳定性影响较小，当浓度为0.10%时，色素的残存率约为81.3%，但不随还原剂浓度的增加而降低。其可能原因是Na2SO3把该色素分子中的部分双键还原，破坏了共轭结构，导致颜色和最大吸收峰发生变化。

[0125] 5）金属离子对蓝色素稳定性的影响

[0126] 调节蓝色素水溶液pH值至9，分别加入0.0025mol/L，0.005mol/L，0.01mol/L不同+ + 2+ 2+ 2+ 3+浓度的Na，K，Ca ，Mg ，Cu ，Fe 等金属离子，静置2h测定其吸光度，观察各金属离子对色素的影响情况，结果见表4。

[0127] 表4 金属离子对蓝色素稳定性的影响

[0128]+ + 2+ 2+

[0129] 由表4可见，在一定浓度范围内，Na、K和Ca 对该蓝色素基本没有影响，而Mg2+ 3+
使其吸光度增加，因此在实际应用中可利用含Mg 试剂达到增色效果。加入Fe 后该色素
2+
水溶液由蓝变黄，吸光值显著降低，并产生黄色沉淀，加入Cu 则产生蓝色絮状沉淀。因此
3+ 2+
Fe 和Cu 对该色素影响较大，在使用和保存中应注意避免使用铁质、铜质容器，以及与含铁离子和铜离子的化学试剂接触。

[0130] 6）食品添加剂对蓝色素稳定性的影响

[0131] 调节蓝色素水溶液pH值至9，分别加入1%，2%，3%，4%，5%不同质量分数蔗糖和食盐，测吸光度，并观察颜色变化。结果见表5。

[0132] 表5 食品添加剂对蓝色素稳定性的影响

[0133]

[0134] 由表5可见，在一定浓度范围内，食盐和蔗糖对该蓝色素基本无影响；由于柠檬酸为酸性，加入后蓝色素水溶液由蓝变红，吸光值有小幅下降，但总体来说对该蓝色素影响不大。

[0135] 通过考察不同因素对浅紫链霉菌所产蓝色素稳定性的影响，发现室外直射光、高温（大于60℃）、氧化剂H2O2、金属离子Fe3+和Cu2+对该色素水溶液有明显的破坏作用，而室外散射光、紫外光、还原剂Na2SO3、部分金属离子(如Na+、K+及Ca2+)以及食品添加剂食盐、蔗糖、柠檬酸对该蓝色素无明显影响。本研究结果可为纺织、食品等领域的应用研究提供基础数据。

[0136] （4）抗菌活性

[0137] 称取适量蓝色素粗制剂溶于0.05mol/L的氢氧化钠溶液中，制得一定浓度的药液，检测该蓝色素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母的抗菌活性。

[0138] 1）指示菌制备

[0139] 将保存在零下70℃冰箱中的大肠杆菌菌悬液，在常温下溶解后，在LB固体培养基平板上划线培养，37℃下倒置培养18～24h后，用接种环挑取单菌落转接于装有LB液体培养基的锥形瓶内，37℃恒温震荡培养12-18h，作为指示菌待用。

[0140] 以保存在零下70℃冰箱中的金黄色葡萄球菌菌悬液，在常温下溶解后，在LB固体培养基平板上划线培养，在37℃下倒置培养18～24h后，用接种环挑取单菌落转接于装有LB液体培养基的锥形瓶内，37℃恒温震荡培养12-18h，作为指示菌待用。

[0141] 称取2g葡萄糖和1g干酵母放入摇瓶中，加蒸馏至100mL，在38℃的电热恒温鼓风干燥箱中放置60min，作为指示菌待用。

[0142] 2）抑菌圈测定

[0143] 采用K-B纸片扩散法进行。

[0144] 先将原始菌液（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酿酒酵母）用无菌水作10-1，10-2倍稀释，吸取0.1mL各个浓度的菌悬液于相应的营养平板上，用涂布棒将菌液涂布均匀。

[0145] 将干燥药敏滤纸片用镊子平放于干净无菌的平皿上，分别吸取20μL浓度为2g/L，1g/L的蓝色素于干燥药敏滤纸片（直径5mm）上，然后将平皿开盖放入恒温干燥箱（37℃）中烤干后贴在含菌平板上，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液作对照，每种菌做三个重复。将含菌平板倒置于37℃（真菌28℃）恒温箱中培养24h（真菌48h），采用十字交叉法测定含药滤纸片抑菌圈直径的大小，取平均值，比较抑菌效果。

[0146] 抑菌圈直径的计算公式为：

[0147] 抑菌圈直径(mm)= 测量菌落直径平均值-5.0；结果见图22a、图22b、图23a、图23b，图24a、图24b以及表6、表7。

[0148] 表6 不同浓度蓝色素对大肠杆菌的抑菌圈直径（mm）

[0149]大肠杆菌稀释倍数 10-1 10-2
2g/L蓝色素 11 4
1g/L蓝色素 6 4
0.02mol/L氢氧化钠 0 0

[0150] 表7 不同浓度蓝色素对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径（mm）

[0151]金葡菌稀释倍数 10-1 10-2
2g/L蓝色素 9 3
1g/L蓝色素 7 3
0.02mol/L氢氧化钠 0 0

[0152] 由图22a、图22b以及表6可见，该蓝色素对革兰氏阴性菌大肠杆菌具有明显的抑菌活性；由图23a、图23b以及表7可见，该蓝色素对金黄色葡萄球菌也具有明显的抑菌活性。由图24a、图24b可见，该蓝色素对酿酒酵母没有任何抑菌活性。