基于可感染病毒颗粒型抗体重链库/轻链库的抗体筛选和制备方法转让专利
申请号 : CN201310277207.9
文献号 : CN103603057B
文献日 : 2016-01-06
发明人 : 李凌云 , 周兆平 , 雷明军 , 易俊波 , 苏庆宁
申请人 : 深圳大学
摘要 :
本发明涉及新型抗体筛选方法，该方法包括抗体库构建步骤：构建可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库；第一筛选步骤：利用可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库感染动物细胞，采用特异性抗原筛选被感染的、具有特异性抗体表达能力的动物细胞，获得阳性细胞株；第二筛选步骤：从阳性细胞株获取特异性抗体的重链可变区cDNA序列和轻链可变区cDNA序列，拼接引入特异性抗体的轻链信号肽序列，连接插入表达载体，构建特异性抗体的表达细胞株，以表达制备特异性抗体。本发明的筛选方法工艺简单高效、切实可行；筛选获得的基因工程抗体具有高特异性和高亲和性。
权利要求 :
1.一种可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库的构建方法，其特征在于，包括；
生物信息学分析技术分别获取人IgG重链可变区多组合系列基因序列、人IgG轻链可变区多组合系列基因序列、IgG家族可变区基因序列、和人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区的突变序列，以不同来源的cDNA为模板进行PCR扩增获得；
构建含有T-A连接序列、信号肽序列和跨膜序列的穿梭载体；所述信号肽序列为人抗体轻链的信号肽序列；所述跨膜序列为IgG家族成员CD4的跨膜序列；所述信号肽序列为序列表中的SEQ ID No.1所示的核酸序列和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，所述跨膜序列为序列表中的SEQ ID No.3所示的核酸序列和SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；
为了获取所述信号肽序列，设计如下引物：
上游引物的引物序列1：5’-ATGGACATGATGGTCCCCGC-3’下游引物的引物序列2：5’-CTGAGATGCCCGGCAAGTGA-3’，为了获取所述跨膜序列，设计如下引物：
上游引物的引物序列3：5’-GGCGTCGCCGGCCTCCTGCT-3’下游引物的引物序列4：5’-TCAAATGGGGCTACATGTCT-3’；将获取的所述人IgG重链可变区多组合系列基因序列、所述人IgG轻链可变区多组合系列基因序列、所述IgG家族可变区基因序列、和所述人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区的突变序列连接插入所述穿梭载体，构建得到重组穿梭质粒库；
利用重组穿梭质粒库和腺病毒重组系统构建所述可感染病毒颗粒型抗体重链库和所述可感染病毒颗粒型抗体轻链库。
2.一种抗体筛选方法，其特征在于，包括：
抗体库构建步骤：构建可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库；
第一筛选步骤：利用所述可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库感染动物细胞，采用特异性抗原筛选被感染的、具有特异性抗体表达能力的动物细胞，获得阳性细胞株；
第二筛选步骤：利用测序上游引物1和测序下游引物2，从所述阳性细胞株获取所述特异性抗体的重链可变区cDNA序列和轻链可变区cDNA序列，拼接引入所述特异性抗体的轻链信号肽序列，连接插入表达载体，构建所述特异性抗体的表达细胞株，以表达制备所述特异性抗体；
其中，所述抗体库构建步骤包括：
生物信息学分析技术分别获取人IgG重链可变区多组合系列基因序列、人IgG轻链可变区多组合系列基因序列、IgG家族可变区基因序列、和人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区的突变序列，以不同来源的cDNA为模板进行PCR扩增获得；
构建含有T-A连接序列、信号肽序列和跨膜序列的穿梭载体；所述信号肽序列为人抗体轻链的信号肽序列；所述跨膜序列为IgG家族成员CD4的跨膜序列；所述信号肽序列为序列表中的SEQ ID No.1所示的核酸序列和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，所述跨膜序列为序列表中的SEQ ID No.3所示的核酸序列和SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；
为了获取所述信号肽序列，设计如下引物：
上游引物的引物序列1：5’-ATGGACATGATGGTCCCCGC-3’下游引物的引物序列2：5’-CTGAGATGCCCGGCAAGTGA-3’，为了获取所述跨膜序列，设计如下引物：
上游引物的引物序列3：5’-GGCGTCGCCGGCCTCCTGCT-3’下游引物的引物序列4：5’-TCAAATGGGGCTACATGTCT-3’；
将获取的所述人IgG重链可变区多组合系列基因序列、所述人IgG轻链可变区多组合系列基因序列、所述IgG家族可变区基因序列、和所述人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区的突变序列连接插入所述穿梭载体，构建得到重组穿梭质粒库；
利用所述重组穿梭质粒库和腺病毒重组系统构建所述可感染病毒颗粒型抗体重链库和所述可感染病毒颗粒型抗体轻链库；
所述第二筛选步骤中，所述测序上游引物1和测序下游引物2如下：
测序上游引物1的引物序列5：5’-CTCACGGGGATTTCCAAGTC-3’测序下游引物2的引物序列6：5’-ATGCAGTCGTCGAGGAATTG-3’。
3.根据权利要求2所述的抗体筛选方法，其特征在于，所述人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区的突变序列包括除无义突变以外的随机突变的片段序列。
4.根据权利要求2所述的抗体筛选方法，其特征在于，在所述第一筛选步骤和所述第二筛选步骤之间，所述方法还包括：对所述阳性细胞株进行单克隆培养，以得到亲和性提高的、表达特异性抗体的阳性细胞株。
5.根据权利要求2所述的抗体筛选方法，其特征在于，在所述第二筛选步骤中，所述表达载体为pIRES2-EGFP或pIRES DsRed-Express2。
6.根据权利要求2所述的抗体筛选方法，其特征在于，在所述第二筛选步骤中，所述表达细胞株为HEK 293细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
说明书 :
基于可感染病毒颗粒型抗体重链库/轻链库的抗体筛选和
制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物制药技术领域，并涉及抗体筛选技术领域。更具体地，本发明涉及一种可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库的建立以及新型抗体筛选方法。
背景技术
[0002] 抗体分子是生物医学领域用途最为广泛的蛋白分子，治疗性抗体和诊断用抗体更是具有广泛应用前景和巨大的市场价值。自从1984年第一个基因工程抗体人－鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体如人源化抗体、单价小分子抗体、多价小分子抗体等不断出现。
[0003] 杂交瘤细胞技术给单克隆抗体生产技术带来了革命性变化，大大推动了抗体的应用进程，但由于该技术须经动物免疫、细胞融合、克隆筛选等复杂漫长的工艺流程，且具有不能制备针对稀有抗原的抗体和人源性抗体等缺陷，从而限制了基因工程抗体更为广泛的应用。抗体库技术使人们找到了解决这些问题的有效途径，其中噬菌体抗体库是应用最为普遍的抗体库技术。采用这种技术筛选抗体无需进行动物免疫，没有细胞融合、克隆筛选等过程，为全方位制备各类抗体提供了捷径。核糖体展示抗体库技术是近年来发展出来的另一抗体筛选技术，整个过程体外进行、不经大肠杆菌转化步骤，易于筛选高亲和力抗体和采用体外方法对抗体性质进行改造，但该技术对免疫动物易于执行而对人源抗体的筛选不具优势；而且深入研究表明：利用各种抗体文库所进行的大量筛选，其产物常常因为对抗原亲和力低、特异性差等原因而达不到预期要求；Roger R.Beerli等人新近建立了一种新型抗体筛选方法——哺乳细胞展示法，但该方法仍无法摆脱单链抗体的束缚。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有抗体筛选技术中杂交瘤细胞技术不能制备针对稀有抗原的特异性抗体和人源化抗体等缺陷；针对各种建立在抗体文库基础上的抗体筛选技术出现的抗原亲和力低、特异性差等缺陷；针对哺乳动物细胞展示技术不能制备单链抗体的缺陷，分别建立一种可感染病毒颗粒型抗体重链库和一种可感染病毒颗粒型抗体轻链库，利用所述抗体库建立一种新型抗体筛选方法，筛选更加逼近体内条件的、高特异性且高亲和性的人源化抗体。
[0005] 本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现：提供一种抗体筛选方法，包括：抗体库构建步骤：构建可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库；第一筛选步骤：利用所述可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库感染动物细胞，采用特异性抗原筛选被感染的、具有特异性抗体表达能力的动物细胞，获得阳性细胞株；第二筛选步骤：从所述阳性细胞株获取所述特异性抗体的重链可变区cDNA序列和轻链可变区cDNA序列，拼接引入所述特异性抗体的轻链信号肽序列，连接插入表达载体，构建所述特异性抗体的表达细胞株，以表达制备所述特异性抗体。
[0006] 本发明还提供一种可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库的构建方法，包括；分别获取人IgG重链可变区多组合系列基因序列、人IgG轻链可变区多组合系列基因序列、IgG家族可变区基因序列、和人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区的突变序列；构建含有T-A连接序列、信号肽序列和跨膜序列的穿梭载体；将获取的所述人IgG重链可变区多组合系列基因序列、所述人IgG轻链可变区多组合系列基因序列、所述IgG家族可变区基因序列、和所述人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区的突变序列连接插入所述穿梭载体，构建得到重组穿梭质粒库；利用重组穿梭质粒库和腺病毒重组系统构建所述可感染病毒颗粒型抗体重链库和所述可感染病毒颗粒型抗体轻链库。实施本发明的技术方案，可以获得以下技术效果：本发明建立的一种可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库可以在哺乳动物细胞中通过感染方式繁殖扩增，长期保存；包含尽可能完整的人类IgG重链可变区和轻链可变区序列、IgG家族可变区序列以及根据人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区进行除无义突变以外的随机突变，保证可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库的最大丰度，保证抗体库的容量；保证抗体分子表达在细胞表面，呈现更加天然的抗体形态，便于后续的新型抗体筛选方法的建立；特异性抗体重链、轻链被分泌型表达在细胞外，保证了工程抗体的天然状态，便于后续的纯化生产。可以用于筛选多种特异性抗原——如肿瘤抗原、病毒抗原等的相应的、高特异性、高亲和性、近似天然抗体。
[0007] 本发明建立的新型抗体筛选方法，是建立在可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库的基础上，利用抗原、抗体相互结合，使用流式细胞仪进行多轮分选；获得的阳性细胞株再经过单克隆培养后再次与特异性抗原结合，再次分选获得可以与特异性抗原高亲和能力、高特异性的抗体；分别筛选的特异性抗体重链和轻链cDNA同时双表达在一个真核载体中，保证重链、轻链形成天然抗体结构，并通过引入信号肽序列，使抗体分子得以分泌型表达在细胞外，便于后期纯化。通过所述发明建立的筛选方法可以筛选获得高特异性、高亲和性、天然结构、分泌型、人源化抗体，用于病毒性疾病和肿瘤的治疗性抗体的筛选，或者用于病毒性疾病预防用抗体的筛选，从而有效预防和治疗病毒性传染病和肿瘤发生。
附图说明
[0008] 图1是制备得到的特异性抗体的PAGE电泳图。
具体实施方式
[0009] 为了使本发明的技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0010] 本发明通过构建可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库，并在所述抗体库基础上建立新型抗体筛选方法，筛选更加逼近体内条件的、高特异性、高亲和性的人源化抗体。
[0011] 构建可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库的具体步骤包括：A.生物信息学分析技术获取人IgG重、轻链可变区多组合系列基因序列、IgG家族可变区基因序列、人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区进行除无义突变以外的随机突变的片段序列，以不同来源的cDNA为模板进行PCR扩增获得；B.构建含有T-A连接序列、信号肽序列（SP，N-末端）和跨膜序列（TM，C-末端）的穿梭载体；C.步骤A中所述全部基因片段连接插入穿梭载体构建含有重链可变区、轻链可变区多组合系列基因片段的重组穿梭质粒库；D.利用重组穿梭质粒库和腺病毒重组系统构建所述可感染病毒颗粒型抗体重链库和所述可感染病毒颗粒型抗体轻链库。
[0012] 建立所述新型抗体筛选方法的具体步骤包括E.利用特异性抗原蛋白（如HBV的S抗原）与所述可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库结合，识别、筛选特异抗体表达细胞，流式细胞仪高通量两次分选阳性细胞；F.所获阳性细胞株经单克隆培养，再次筛选，确定亲和性高的特异性抗体表达细胞；G.PCR扩增获取特异性抗体重链可变区cDNA和轻链可变区cDNA序列，通过PCR拼接技术分别引入抗体轻链信号肽，连接插入双表达真核载体，构建特异性抗体重链和轻链的、可分泌的稳定表达细胞株；H.分离、纯化特异性抗体。
[0013] 进一步地，上述步骤A具体包括以下步骤：
[0014] A1：人IgG重、轻链可变区多组合系列基因序列的获取：
[0015] 随着人类基因组计划的完成，人类基因库信息已经基本完成，人类IgG基因是非常繁多的。在美国国立生物信息中心（NCBI）、欧洲生物信息中心（EBI）、法国免疫球蛋白基因序列数据库（IMGT）等数据库中，可以找到众多的人IgG基因片段，利用生物信息学分析技术、根据相似性分值对它们的重链可变区和轻链可变区进行分组比对，并根据其结果设计出该组的共同引物。针对不同的分组设计多组简并引物。
[0016] A2：人IgG家族蛋白分子基因可变区序列的获取：
[0017] IgG家族是许多与IgG抗体具有相似结构的蛋白分子，包括：T细胞受体、B细胞受体、MHC、细胞粘附分子、天然杀伤细胞受体、淋巴细胞受体、细胞因子受体、生长因子受体等，它们均具有重要的生物学功能，如：细胞粘附功能、识别抗原、识别特异配体、信号传导等，尤其在免疫识别、免疫激活、免疫系统信号传递中具有重要的生物学功能，这些特异性的IgG家族成员也可以被用于肿瘤和病毒性疾病等特异性抗体治疗中。在美国国立生物信息中心（NCBI）、欧洲生物信息中心（EBI）、法国免疫球蛋白基因序列数据库（IMGT）等数据库中，可以查询到大量IgG家族基因片段，利用生物信息学分析技术对它们的可变区进行分组比对，针对不同分组设计多组简并引物。
[0018] A3：人IgG可变区抗原结合位点所在高变区随机突变序列的获取：
[0019] 人IgG轻链可变区和重链可变区分别由110个左右氨基酸组成，其中有些区域的氨基酸残基变化较可变区的其他部分更大，如轻链第24～34、50～56、89～97位和重链第31～35、50～65、95～102位，这些区域成为高变区，是抗体与抗原表位直接接触的部位。为了增加抗体库基因序列信息的丰度，将人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区进行除无义突变以外的随机突变，获得的片段通过PCR拼接合成获得轻链可变区和重链可变区的基因片段。
[0020] A4：重链可变区和轻链可变区基因的PCR扩增和PCR拼接：
[0021] 从来源不同的人新鲜血样中提取总RNA和mRNA，逆转录为人cDNA，以人cDNA为模板，以A1、A2中所述多组简并引物分别扩增，各自得到约330bp左右的基因片段库。选择性基因测序分析证实它们均为所需要的目的基因。
[0022] 分别合成针对重链可变区中高变区域第31～35、50～65、95～102位的随机突变片段以及轻链可变区中高变区域第24～34、50～56、89～97位的随机突变片段，其中去除无义突变以免造成抗体可变区序列的不完整性。通过PCR拼接技术构建含有这些随机突变片段的重链可变区和轻链可变区，用以增加抗体重链库和抗体轻链库的丰度，保证抗体库的最大基因信息量。
[0023] 进一步地，上述步骤B具体包括以下步骤：
[0024] B1：穿梭载体中信号肽序列（SP，N-末端）的获取：
[0025] 利用腺病毒载体系统中的穿梭载体pShuttle-CMV或者pShuttle-IRES-hrGFP-2为母本载体，进行相应的改造。
[0026] 在美国国立生物信息中心（NCBI）数据库中，可以找到轻链可变区的全基因组序列，它们都含有相似的信号肽序列，可以引导抗体分子穿过细胞膜定于细胞表面，在成熟的抗体分子中被切除掉。为了保证抗体库中特异性抗体能够成功穿过细胞膜并有效地表达在细胞表面，需要在穿梭载体中引入信号肽序列。为了获取人抗体轻链的信号肽序列，本发明从人新鲜血样中提取总RNA和mRNA，逆转录为人cDNA，以人cDNA为模板，设计如下引物：
[0027] 上游引物的引物序列1：5’-ATGGACATGATGGTCCCCGC-3’；
[0028] 下游引物的引物序列2：5’-CTGAGATGCCCGGCAAGTGA-3’
[0029] B2：穿梭载体中跨膜序列（TM，C-末端）的获取：
[0030] 在美国国立生物信息中心（NCBI）数据库中，可以找到IgG家族成员CD4的全基因组序列，其中含有跨膜序列，即TM序列；可以将TM序列镶嵌在细胞膜中保证分子定位在细胞膜上。为了保证抗体库中特异性抗体能够有效地表达在细胞表面，并定位在细胞膜表面，需要在穿梭载体中引入跨膜序列。本发明采用IgG家族成员CD4的跨膜序列。为了获取IgG家族成员CD4的跨膜序列，本发明从人新鲜血样中提取总RNA和mRNA，逆转录为人cDNA，以人cDNA为模板，设计如下引物：
[0031] 上游引物的引物序列3：5’-GGCGTCGCCGGCCTCCTGCT-3’；
[0032] 下游引物的引物序列4：5’-TCAAATGGGGCTACATGTCT-3’
[0033] B3：信号肽序列（SP，N-末端）和跨膜序列（TM，C-末端）的PCR扩增：
[0034] 从人新鲜血样中提取总RNA和mRNA，逆转录为人cDNA，以人cDNA为模板，以信号肽序列（SP，N-末端）和跨膜序列（TM，C-末端）的各自上游引物、下游引物分别扩增，各自得到约168bp的跨膜序列（TM，C-末端）和147bp信号肽序列（SP，N-末端）。基因测序分析证实它们均为所需要的目的片段。
[0035] B4：穿梭载体的构建：
[0036] 利用腺病毒载体系统中的穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-2为母本载体，进行相应的改造。将跨膜序列、信号肽序列分别插入pShuttle-IRES-hrGFP-2载体中，引入EcoRV酶切位点。用限制性内切酶EcoRV酶切消化，获得平端线性载体，然后利用末端磷酸转移酶在3’末端引入碱基T，构建含有T-A连接序列、信号肽序列（SP，N-末端）和跨膜序列（TM，C-末端）的穿梭载体。
[0037] 将步骤A中所述全部基因片段（包括人IgG重、轻链可变区多组合系列基因序列、IgG家族可变区基因序列、人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区进行除无义突变以外的随机突变的片段序列）通过T-A序列连接插入穿梭载体构建重组穿梭质粒库，随后利用重组穿梭质粒库和腺病毒重组系统组建所述可感染病毒颗粒型抗体重链库和所述可感染病毒颗粒型抗体轻链库。上述重链库和轻链库可以在真核细胞中（如HEK293细胞中）包装成具有感染性的病毒颗粒库，然后通过感染多种哺乳动物细胞，如CHO细胞、VERO细胞等进行感染扩增，长期保存。在可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库中，抗体分子通过穿梭载体上的信号肽引导穿过细胞膜进入细胞表面、通过跨膜序列定位在细胞膜上，保证了抗体表达并定位于细胞膜表面，以便后续的应用筛选。
[0038] 将可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库感染哺乳动物细胞并收集细胞，利用特异性抗原蛋白（如HBV的S抗原，肿瘤标记分子P53等）分别与被感染的细胞结合，利用流式细胞仪高通量分选阳性细胞，获得的阳性细胞在96孔板经单克隆培养放大后，再次结合特异性抗原蛋白，然后再次进行流式细胞仪分选，最终确定阳性细胞株。
[0039] 进一步地，上述步骤G具体包括以下步骤：
[0040] G1：分别从阳性细胞株扩增抗体轻链可变区cDNA和抗体重链可变区cDNA：
[0041] 获得的阳性细胞株分别感染HEK293细胞放大培养，提取总RNA和mRNA，逆转录cDNA,利用穿梭载体中的测序上游引物1和测序下游引物2进行PCR扩增,分别获得特异性抗体重链可变区cDNA序列和轻链可变区cDNA序列，经序列测定得以确定。
[0042] 测序上游引物1的引物序列5：5’-CTCACGGGGATTTCCAAGTC-3’
[0043] 测序下游引物2的引物序列6：5’-ATGCAGTCGTCGAGGAATTG-3’
[0044] G2：特异性重链可变区（含信号肽）序列、轻链可变区（含信号肽）序列的PCR扩增及连接
[0045] 提取保存的阳性细胞的mRNA，逆转录cDNA,利用穿梭载体中信号肽(SP,N-末端)上游引物的引物序列1以及G1中序列测定获得的特异性抗体重链可变区的下游引物或轻链可变区下游引物进行PCR扩增，分别获得特异性抗体重链可变区（含信号肽）序列、轻链可变区（含信号肽）序列。通过PCR技术进行拼接，与IRES序列（内部核糖体进入位点）连接成为轻链可变区（含信号肽）-IRES-重链可变区（含信号肽）双序列片段。
[0046] G3：分泌型双表达重组真核质粒的构建及稳定表达细胞株的建立
[0047] 为便于多方面分析本发明中筛选的特异性抗体的可行性和实用性，本发明采用以下真核表达载体如pIRES2-EGFP、pIRES DsRed-Express2等。将步骤G2中所述双序列片段通过限制性内切酶酶切、连接插入真核表达载体如pIRES2-EGFP、pIRES DsRed-Express2等构建分泌型双表达重组真核质粒。
[0048] 由于抗体的双表达水平主要由表达载体和宿主细胞（表达细胞株）共同决定，因此，真核表达载体和哺乳动物细胞表达系统是最佳的选择。哺乳动物细胞内有抗体折叠形成正确空间结构所必需的分子伴侣和折叠酶，其内质网为抗体分子正确折叠和链内及链间二硫键的形成提供了有利的氧化还原环境；哺乳动物细胞拥有完整的转录后、翻译和翻译后修饰、信号肽的剪切以及跨膜蛋白的定位等优势，使表达抗体能够分泌到胞外，使得空间结构更加接近天然，有利于发挥其生物学功能，提高治疗性抗体的疗效。
[0049] 利用基因工程手段本发明可选用HEK293细胞或中国仓鼠卵巢细胞CHO，并优选使用293细胞作为表达载体的宿主细胞，并建立稳定的表达细胞株用来表达筛选的特异性抗体重链和轻链。
[0050] 以下实施例以HBV S抗原为特异性抗原，详细说明如何建立基于可感染病毒颗粒型抗体重链库/轻链库的新型抗体筛选方法。
[0051] 利用生物信息学分析获取人IgG重、轻链可变区基因序列、IgG家族可变区基因序列，设计随机简并引物；以乙肝抗体阳性外周血液、正常人外周血液等为标本，常规试剂盒提取mRNA，逆转录制备人外周血cDNA；以上述cDNA为模板进行PCR扩增获得大量PCR产物。为了增加抗体库基因序列信息的丰度，针对IgG重、轻链可变区中高变区（轻链第24～34、50～56、89～97位和重链31～35、50～65、95～102位）进行随机突变、拼接获得高变区随机突变基因片段库。
[0052] 以上游引物（引物序列1：5’-ATGGACATGATGGTCCCCGC-3’）和下游引物（引物序列2：5’-CTGAGATGCCCGGCAAGTGA-3’）为引物，人外周血cDNA为模板，PCR扩增获得147bp人抗体轻链的信号肽序列，经序列测定确定序列为序列表中的SEQ ID No.1所示的核酸序列（相对应的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示），并分别引入Nhe I和EcoR V两个限制性酶切位点。以上游引物（引物序列3：5’-GGCGTCGCCGGCCTCCTGCT-3’）和下游引物（引物序列4：
5’-TCAAATGGGGCTACATGTCT-3’）为引物，人外周血cDNA为模板，PCR扩增获得168bp人IgG家族成员CD4的跨膜序列，即TM序列，经序列测定确定序列为序列表中的SEQ ID No.3所示的核酸序列（相对应的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示），并分别引入EcoR V和Sal I两个限制性酶切位点。
5’-TCAAATGGGGCTACATGTCT-3’）为引物，人外周血cDNA为模板，PCR扩增获得168bp人IgG家族成员CD4的跨膜序列，即TM序列，经序列测定确定序列为序列表中的SEQ ID No.3所示的核酸序列（相对应的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示），并分别引入EcoR V和Sal I两个限制性酶切位点。
[0053] 以腺病毒载体系统载体pShuttle-IRES-hrGFP-2为母本载体，分别利用Nhe I、EcoR V和EcoR V、Sal I将上述信号肽和跨膜区与载体连接，构建穿梭载体（含有人抗体轻链信号肽和CD4跨膜区）。用限制性内切酶EcoRV酶切消化，获得平端线性载体，然后利用末端磷酸转移酶在3’末端引入碱基T，构建含有T-A连接序列、信号肽序列和跨膜序列的穿梭载体。
[0054] 将获得的全部基因片段（包括人IgG重、轻链可变区多组合系列基因序列、IgG家族可变区基因序列、人IgG可变区抗原结合位点所在的高变区进行除无义突变以外的随机突变的片段序列）通过T-A序列连接插入穿梭载体构建重组穿梭质粒库，利用重组穿梭质粒库和腺病毒重组系统并转染人胚肾HEK293细胞包装成具有感染性的病毒颗粒库，即可感染病毒颗粒型抗体重链库/轻链库，病毒库的丰度可以利用穿梭载体特征性正向引物和反向引物进行PCR鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳检测特征谱带的均匀分布予以确定。上述重链库/轻链库在真核细胞CHO细胞和VERO细胞等进行感染扩增，液氮长期保存。
[0055] 分别将可感染病毒颗粒型抗体重链库和可感染病毒颗粒型抗体轻链库感染哺乳动物细胞并收集细胞，将酵母系统表达纯化的HBV S抗原分别与上述细胞结合，反复洗涤，800-1000rpm离心收集细胞，去除未结合的HBV S抗原。利用抗HBV S的荧光抗体与HBV S抗原结合使得表达特异性抗体的细胞被标记荧光从而被筛选，利用流式细胞仪高通量分选带有荧光的阳性细胞，经两次分选确定获得阳性细胞。阳性细胞在96孔板经单克隆培养放大后，再次与HBV S抗原蛋白结合，利用常规ELISA（酶联免疫吸附实验）的颜色反应确定高亲和性的阳性细胞。然后再次进行流式细胞仪分选，最终确定特异性抗体的高亲和性阳性细胞株。
[0056] 获得的阳性细胞株感染HEK293细胞放大培养，提取mRNA并逆转录cDNA,利用穿梭载体中的测序上、下游引物进行PCR扩增,分别获得HBV S抗原特异性、高亲和性抗体重链可变区cDNA序列和轻链可变区cDNA序列，序列测定得以确定。以特异性阳性细胞cDNA为模板,以穿梭载体信号肽(SP,N-末端)上游引物（引物序列1）为正向引物，以筛选获得的特异性抗体重链可变区下游引物或轻链可变区下游引物为下游引物进行PCR扩增，分别获得特异性抗体重链可变区（含信号肽）序列、轻链可变区（含信号肽）序列。通过PCR技术进行拼接，与IRES序列（内部核糖体进入位点）连接成为轻链可变区（含信号肽）-IRES-重链可变区（含信号肽）双序列片段，插入真核表达载体pIRES2-EGFP构建分泌型双表达重组真核质粒。转染中国仓鼠卵巢细胞CHO，G418筛选建立稳定表达细胞株。培养细胞收集上清液，利用特异性S抗原纯化、收集和浓缩分泌表达的特异性抗体（重链可变区和轻链可变区），对特异性抗体进行蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测，考马斯亮蓝染色后可见清晰的目的蛋白，结果如图1的特征性谱带所示。图1中左侧的两列条带分别为重链可变区的电泳结果，右侧两列条带分别为轻链可变区的电泳结果。