本发明公开了一种基于微流体芯片的微生物检测仪器及其SPR检测方法，其中，基于微流体芯片的微生物检测仪器包括入射光源、光纤准直镜、多通道准直镜、多通道光谱仪、透镜和具有表面等离子体共振响应特性的微流体芯片，微流体芯片上开有流体微通道，微流体芯片内设置有金属膜阵列层，金属膜阵列层上固定有多种微生物抗体层，透镜紧贴在微流体芯片上位于金属膜阵列层的一侧，所述入射光源发出的光依次通过光纤准直镜和透镜后照射至金属膜阵列层，然后再通过透镜反射至多通道准直镜后射入多通道光谱仪。本发明将微流体芯片和透镜高度集成在一起，可一次检测大量样品的微生物种类及其所含不同成分的浓度，样品无需标记，检测速度快，检测精度高。
1.一种基于微流体芯片的微生物检测仪器，包括入射光源(6)、光纤准直镜(7)、多通道准直镜(4)和多通道光谱仪(5)，其特征在于：还包括透镜(3)和具有表面等离子体共振响应特性的微流体芯片(2)，微流体芯片(2)上开有带流体进口和流体出口的流体微通道(2-4)，微流体芯片(2)内设置有金属膜阵列层(2-1)，并且金属膜阵列层(2-1)位于流体微通道(2-
4)的下表面上，金属膜阵列层(2-1)上固定有多种微生物抗体层(9)，透镜(3)紧贴在微流体芯片(2)上位于金属膜阵列层(2-1)的一侧，所述入射光源(6)发出的光依次通过光纤准直镜(7)和透镜(3)后照射至金属膜阵列层(2-1)，然后再通过透镜(3)反射至多通道准直镜(4)后射入多通道光谱仪(5)，其中，所述金属膜阵列层(2-1)为相互隔离开并且相互处于非连接状态的金属膜组成；
1)在固化后的第一微流体芯片基体(2-2)上涂上AZ光刻胶(13)，经过光刻和显影工序后，将掩膜板(12)上的图形转移到AZ光刻胶(13)上；
2)采用电子束蒸镀工艺在AZ光刻胶(13)上镀上金属膜，然后采用剥离工艺除掉AZ光刻胶(13)及其上的金属膜，从而在第一微流体芯片基体(2-2)上获得金属膜阵列层(2-1)；
3)在硅衬底(15)上涂SU-8光刻胶，通过光刻和显影工序，在硅衬底(15)上获得流体微通道模板(14)；
4)将第二微流体芯片基体(2-3)倒在流体微通道模板(14)上，经过固化后将流体微通道(2-4)转移到第二微流体芯片基体(2-3)上；
5)采用氧等离子体处理含有金属膜阵列层(2-1)的第一微流体芯片基体(2-2)和含有流体微通道(2-4)的第二微流体芯片基体(2-3)表面，并粘合绑定在一起，即得到需要的微流体芯片(2)。
2.根据权利要求1所述的基于微流体芯片的微生物检测仪器，其特征在于：所述的微流体芯片(2)的基体和透镜(3)均采用聚二甲基硅氧烷材料制成。
3.根据权利要求1所述的基于微流体芯片的微生物检测仪器，其特征在于：所述的金属膜阵列层(2-1)和微生物抗体层(9)之间由里向外还依次设置有自组装单分子层(11)和蛋白G层(10)。
4.根据权利要求1所述的基于微流体芯片的微生物检测仪器，其特征在于：所述的透镜(3)为三棱透镜。
5.根据权利要求1所述的基于微流体芯片的微生物检测仪器，其特征在于：所述的金属膜阵列层(2-1)为金膜阵列层。
6.如权利要求1至5中任一所述的基于微流体芯片的微生物检测仪器的SPR检测方法，其特征在于该方法的步骤如下：
1)将带有微生物的待检测液样通过过滤器(1)过滤后，从流体进口进入流体微通道(2-
4)，当待检测液样中的某种微生物流经金属膜阵列层(2-1)时，金属膜阵列层(2-1)上的该种微生物抗体层(9)与待检测液样中的该种微生物的抗原(8)结合，其余液样则从流体出口流出；
2)启动入射光源(6)，入射光源发出入射光经过光纤准直镜(7)准直后，通过透镜(3)平行地投射至金属膜阵列层(2-1)上并在透镜(3)和金属膜阵列层(2-1)的交界面发生全内反射，反射光通过透镜(3)射入多通道准直镜(4)后进入多通道光谱仪(5)；
3)通过分析多通道光谱仪(5)测量得到的某种微生物的抗原和抗体结合前后的反射光强/波长曲线上共振峰位置的变化，即可得知待检测液样中微生物的类型和浓度。
7.根据权利要求6所述的基于微流体芯片的微生物检测仪器的SPR检测方法，其特征在于：所述的第一微流体芯片基体(2-2)和第二微流体芯片基体(2-3)均采用聚二甲基硅氧烷材料制成。
基于微流体芯片的微生物检测仪器及其SPR检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基于微流体芯片的微生物检测仪器及其SPR检测方法，属于工业测试和环境监测领域。
背景技术
[0002] 目前，我们日常的饮用水及食物如被微生物所污染，这些被污染的水和食物经过口腔进入肠道，会在肠道内繁殖且散发毒素，破坏肠粘膜组织，引起肠道功能紊乱和损害，严重影响身体健康。人体一旦被感染，微生物虫卵由患者粪便排出将再次感染他人，从而导致更大规模传染疾病的爆发。传统的微生物检测方法主要包括平板计数方法、免疫分析方法和PCR方法等，平板计数方法将稀释的微生物与培养基混合后生长繁殖为多个菌落，通过对菌落计数确定微生物浓度；免疫分析方法通过探测微生物抗体和抗原之间的特异性结合反应来实现检测；PCR方法对微生物进行裂解从而提取纯化DNA，设计引物作用于寄生虫卵特定编码区域并对其进行扩增，从而实现微生物的鉴别和数目检测。这几种方法的共同缺点是耗时长、涉及繁琐的生物化学反应过程、需要多种化学试剂和专业人员参与，无法满足快速准确的微生物检测需求。
发明内容
[0003] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种基于微流体芯片的微生物检测仪器，它将微流体芯片和透镜高度集成在一起，可一次检测大量样品的微生物种类及其所含不同成分的浓度，样品无需标记，检测速度快，检测精度高。
[0004] 本发明解决上述技术问题采取的技术方案是：一种基于微流体芯片的微生物检测仪器，包括入射光源、光纤准直镜、多通道准直镜和多通道光谱仪，还包括透镜和具有表面等离子体共振响应特性的微流体芯片，微流体芯片上开有带流体进口和流体出口的流体微通道，微流体芯片内设置有金属膜阵列层，并且金属膜阵列层位于流体微通道的下表面上，金属膜阵列层上固定有多种微生物抗体层，透镜紧贴在微流体芯片上位于金属膜阵列层的一侧，所述入射光源发出的光依次通过光纤准直镜和透镜后照射至金属膜阵列层，然后再通过透镜反射至多通道准直镜后射入多通道光谱仪。
[0005] 进一步，所述微流体芯片的基体和透镜均采用聚二甲基硅氧烷材料制成。
[0006] 进一步，所述的金属膜阵列层和微生物抗体层之间由里向外还依次设置有自组装单分子层和蛋白G层。
[0007] 进一步，所述的透镜为三棱透镜。
[0008] 更进一步，所述的金属膜阵列层为金膜阵列层。
[0009] 本发明还提供了一种基于微流体芯片的微生物检测仪器的SPR检测方法，该方法的步骤如下：
[0010] 1)将带有微生物的待检测液样通过过滤器过滤后，从流体进口进入流体微通道，当待检测液样中的某种微生物流经金属膜阵列层时，金属膜阵列层上的该种微生物抗体层与待检测液样中的该种微生物的抗原结合，其余液样则从流体出口流出；
[0011] 2)启动入射光源，入射光源发出入射光经过光纤准直镜准直后，通过透镜平行地投射至金属膜阵列层上并在透镜和金属膜阵列层的交界面发生全内反射，反射光通过透镜射入多通道准直镜后进入多通道光谱仪；
[0012] 3)通过分析多通道光谱仪测量得到的某种微生物的抗原和抗体结合前后的反射光强/波长曲线上共振峰位置的变化，即可得知待检测液样中微生物的类型和浓度。
[0013] 进一步，所述微流体芯片的制作方法如下：
[0014] 1)在固化后的第一微流体芯片基体上涂上AZ光刻胶，经过光刻和显影工序后，将掩膜板上的图形转移到AZ光刻胶上；
[0015] 2)采用电子束蒸镀工艺在AZ光刻胶上镀上金属膜，然后采用剥离工艺除掉AZ光刻胶及其上的金属层，从而在第一微流体芯片基体上获得金属膜阵列层；
[0016] 3)在硅衬底上涂SU-8光刻胶，通过光刻和显影工序，在硅衬底上获得流体微通道模板；
[0017] 4)将聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料倒在流体微通道模板上，经过固化后将流体微通道转移到第二微流体芯片基体上；
[0018] 5)采用氧等离子体处理含有金属膜阵列层的第一微流体芯片基体和含有流体微通道的第二微流体芯片基体表面，并粘合绑定在一起，即得到需要的微流体芯片。
[0019] 更进一步，第一微流体芯片基体和第二微流体芯片基体均采用PDMS材料制成。
[0020] 采用了上述技术方案后，入射光会在透镜和金属膜阵列层交界面发生全内反射，当产生的倏失波和金属内的表面等离子体波具有相同的波矢时，会形成表面等离子体共振，共振时，界面处的全反射条件被破坏，反射率出现最小值，出现最小位置的点即为共振角或者共振波长，微流体芯片的共振波长位置对金属膜阵列层另一侧电解质的折射率非常敏感，测量时，将具有特异结合和识别属性的抗体固定于金属膜阵列层表面，当流样中某种微生物流经金属膜阵列层表面，若该微生物上具有与此抗体对应的抗原，抗原和抗体结合，将改变金属膜阵列层表面的液样的折射率，从而会引起共振波长的变化，不同种类微生物上的抗原和对应抗体结合，引起的折射率变化量不同，因而产生不同的共振波长变化。即使同一种微生物，其浓度不同，也会产生不同的共振波长变化，通过这种变化就可以得到微生物的种类和浓度。本发明将微流体芯片和透镜高度集成在一起，可一次检测大量样品的微生物种类及其所含不同成分的浓度，样品无需标记，检测速度快，检测精度高。
附图说明
[0021] 图1为本发明的基于微流体芯片的微生物检测仪器的结构示意图；
[0022] 图2为本发明中不同折射率下微流体芯片的共振曲线；
[0023] 图3为本发明中微流体芯片的共振波长偏移量随大肠杆菌浓度变化曲线；
[0024] 图4为金属膜阵列层表面抗原抗体结合原理图；
[0025] 图5为微流体芯片的加工流程图。
具体实施方式
[0026] 为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
[0027] 如图1～5所示，一种基于微流体芯片的微生物检测仪器，包括入射光源6、光纤准直镜7、多通道准直镜4和多通道光谱仪5，还包括透镜3和具有表面等离子体共振响应特性的微流体芯片2，微流体芯片2上开有带流体进口和流体出口的流体微通道2-4，微流体芯片2内设置有金属膜阵列层2-1，并且金属膜阵列层2-1位于流体微通道2-4的下表面上，金属膜阵列层2-1上固定有多种微生物抗体层9，透镜3紧贴在微流体芯片2上位于金属膜阵列层
2-1的一侧，入射光源6发出的光依次通过光纤准直镜7和透镜3后照射至金属膜阵列层2-1，然后再通过透镜3反射至多通道准直镜4后射入多通道光谱仪5。
[0028] 微流体芯片2的基体和透镜3均采用PDMS材料制成。本发明采用同样材质的微流体芯片2和透镜3高度集成在一起，采用PDMS材料，无需使用折射率匹配油，透镜易于和微流体芯片无缝集成，且成本更低。
[0029] 为了提高表面等离子体共振仪的检测灵敏度，需要对固定在金属膜阵列层2-1上的微生物抗体层9的方向进行控制。
[0030] 为了使得某些微生物抗体层9(例如：大肠杆菌抗体)与金属膜阵列层2-1紧密连接，需要基质层物质将微生物抗体层9与金属膜阵列层2-1偶联起来。如图4所示，金属膜阵列层2-1和微生物抗体层9之间由里向外还依次设置有自组装单分子层11和蛋白G层10。首先用异丙醇清洗金属膜阵列层2-1表面，以除掉上面杂质，然后将金属膜阵列层2-1浸入含有11-巯基十一烷酸的丙三醇和乙醇混合液中，放置12小时以上，11-巯基十一烷酸中的巯基与金属原子结合形成牢固的共价键，从而在金属膜阵列层2-1表面形成自组装单分子层11，紧接着将金属膜阵列层2-1置于含有二氯乙烷的水和乙醇混合溶液2个小时以上，以活化11-巯基十一烷酸的羧基。将含有10mg/L蛋白G、0.14M/l氯化钠和0.02％硫汞撒PBS的PBS磷酸盐缓冲液滴在金属膜阵列层2-1表面，反应2小时以上，在自组装单分子层11上形成蛋白G层10，然后将含有微生物抗体的PBS缓冲液滴在蛋白G层10上。2小时后，用PBS缓冲液清洗膜层表面，并在含有0.1％多聚甲醛-吐温20溶液的PBS缓冲液中培育20分钟，使得微生物的抗原易于和金属膜阵列层2-1上的抗体结合。
[0031] 如图1所示，透镜3为三棱透镜。
[0032] 金属膜阵列层2-1为金膜阵列层。
[0033] 图3可以看出，大肠杆菌浓度越高，共振波长变换量越大，两者基本上成线性关系实际测量时，实现通过标定得到变化曲线，然后通过测量共振波长变换量即可反演得到大肠杆菌的浓度，其他微生物的浓度的推演方法也与其类似。
[0034] 基于微流体芯片的微生物检测仪器的表面等离子体共振微生物检测方法，该方法的步骤如下：
[0035] 1)将带有微生物的待检测液样通过过滤器1过滤后，从流体进口进入流体微通道2-4，当待检测液样中的某种微生物流经金属膜阵列层2-1时，金属膜阵列层2-1上的该种微生物抗体层9与待检测液样中的该种微生物的抗原结合，其余液样则从流体出口流出；
[0036] 2)启动入射光源6，入射光源发出入射光经过光纤准直镜7准直后，通过透镜3平行地投射至金属膜阵列层2-1上并在透镜3和金属膜阵列层2-1的交界面发生全内反射，反射光通过透镜3射入多通道准直镜4后进入多通道光谱仪5；
[0037] 3)通过分析多通道光谱仪5测量得到的某种微生物的抗原和抗体结合前后的反射光强/波长曲线上共振峰位置的变化，即可得知待检测液样中微生物的类型和浓度。
[0038] 微流体芯片2的制作方法如下：
[0039] 1)在固化后的第一微流体芯片基体2-2上涂上AZ光刻胶13，经过光刻和显影工序后，将掩膜板12上的图形转移到AZ光刻胶13上；
[0040] 2)采用电子束蒸镀工艺在AZ光刻胶13上镀上金属膜，然后采用剥离工艺除掉AZ光刻胶13及其上的金属膜，从而在第一微流体芯片基体2-2上获得金属膜阵列层2-1；
[0041] 3)在硅衬底15上涂SU-8光刻胶，通过光刻和显影工序，在硅衬底15上获得流体微通道模板14；
[0042] 4)将PDMS材料倒在流体微通道模板14上，经过固化后将流体微通道2-4转移到第二微流体芯片基体2-3上；
[0043] 5)采用氧等离子体处理含有金属膜阵列层2-1的第一微流体芯片基体2-2和含有流体微通道2-4的第二微流体芯片基体2-3表面，从而粘合在一起，即得到需要的微流体芯片2。
[0044] 第一微流体芯片基体2-2和第二微流体芯片基体2-3均采用PDMS材料制成。
[0045] SPR指的是表面等离子体共振。
[0046] 本发明的工作原理如下：
[0047] 启动入射光源后，入射光会在透镜3和金属膜阵列层2-1交界面发生全内反射，当产生的倏失波和金属内的表面等离子体波具有相同的波矢时，会形成表面等离子体共振，共振时，界面处的全反射条件被破坏，反射率出现最小值，出现最小位置的点即为共振角或者共振波长，微流体芯片的共振波长位置对金属膜阵列层2-1另一侧电解质的折射率非常敏感，测量时，将具有特异结合和识别属性的抗体固定于金属膜阵列层2-1表面，当流样中某种微生物流经金属膜阵列层2-1表面，若该微生物上具有与此抗体对应的抗原，抗原和抗体结合，将改变金属膜阵列层2-1表面的液样的折射率，从而会引起共振波长的变化，不同种类微生物上的抗原和对应抗体结合，引起的折射率变化量不同，因而产生不同的共振波长变化。即使同一种微生物，其浓度不同，也会产生不同的共振波长变化，通过这种变化就可以得到微生物的种类和浓度。本发明将微流体芯片2和透镜3高度集成在一起，可一次检测大量样品的微生物种类及其所含不同成分的浓度，样品无需标记，检测速度快，检测精度高。
[0048] 以上所述的具体实施例，对本发明解决的技术问题、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
