谷物和食品中快速检测黄曲霉毒素含量的方法

摘要

本发明公开了一种谷物和食品中快速检测黄曲霉毒素含量的方法。具体为：待测样品粉碎或者切成小块后用萃取溶剂萃取得到供试品；供试品和黄曲霉毒素标准样品分别点加在相同的薄层硅胶板或滤纸上，在紫外灯下比较供试品和黄曲霉毒素标准样品的荧光颜色和荧光强度，以判断供试品中黄曲霉毒素的含量和所含的黄曲霉毒素种类。本发明的检测方法步骤简单，检测时间短，也可以适用于大量样品的同时检测，且检测成本低，使用溶剂量极少，环保，产业应用价值高。

权利要求

1.一种谷物中快速检测黄曲霉毒素含量的方法，包括如下步骤：

(1)将待测样品粉碎或者切成小块，置于试管中，加入萃取溶剂搅拌或振摇萃取，取萃取液，得供试品；

(2)将步骤(1)的供试品和黄曲霉毒素标准样品分别点加在相同的薄层硅胶板或滤纸上，其中点加供试品和黄曲霉毒素标准样品时，均以点加量递增的顺序依次点加；

(3)待步骤(2)的薄层硅胶板或滤纸上的溶剂挥干后，在波长366nm的紫外灯下比较供试品和黄曲霉毒素标准样品的荧光颜色和荧光强度，确定荧光颜色和荧光强度均为相似的标准样品点样斑点B和供试品点样斑点A，认为斑点B和斑点A中含有的黄曲霉毒素总含量相同；

(4)计算待测样品中黄曲霉毒素含量μg，计算公式为：待测样品中加入的萃取溶剂总体积μl×斑点B所含的黄曲霉毒素总量μg/斑点A的供试品点加体积μl；

其中所述的黄曲霉毒素标准样品为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2按质量比1:1:1:1的混合物；所述黄曲霉毒素标准样品溶于三氯甲烷，浓度为

0.1μg/μl。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述萃取溶剂为三氯甲烷、丙酮、甲醇中的一种，所述待测样品与萃取溶剂的质量体积比为1g:1-5ml，萃取时间为

5-10min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为玉米、大米、小麦中的一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中所述供试品和黄曲霉毒素标准样品的点样直径不大于1cm，点样一次性完成或分多次完成，点加量1-80μl。

说明书

谷物和食品中快速检测黄曲霉毒素含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及在谷物和食品中快速检测黄曲霉毒素的方法，属于食品安全检验技术领域。

背景技术

[0002] 黄曲霉毒素(Aflatoxin)是真菌毒素的一种。在结构上，黄曲霉毒素是一类由氨基酸、莽草酸、以及丙二酰-COA通过特殊途径而合成的分子量低的小分子化合物。它们可以在真菌菌丝或分泌到周围的环境中而积累。这些毒素基本上是在农业产品食物中由被黄曲霉菌和寄生曲霉菌污染所产生的。寄生曲霉菌产生四种主要的黄曲霉毒素：B1，B2，G1和G2，而黄曲霉只产生B1和B2两种黄曲霉毒素。黄曲霉毒素最初是从黄曲霉菌中鉴定分离出来的。B型黄曲霉毒素在紫外光线下显示蓝色(Blue)荧光，而G型黄曲霉毒素在紫外光线下显示绿色(Green)荧光。

[0003] 黄曲霉毒素是致癌毒素极强的毒素，广泛存在于花生、玉米，大米、小麦、坚果类等人类常用食品和动物饲料中，严重影响人类的身体健康和畜牧生产力。

[0004] 为了把黄曲霉毒素在食物中的潜在含量降低到最小，许多食品中黄曲霉毒素的最高允许含量现已有明确规定。美国食品药品管理局(FDA)的法律条文特别规定禁止销售被黄曲霉毒素污染超标的食品。FDA规定美国洲际贸易食品和饲料允许总量不得高于20ppb。

[0005] 目前精确定性定量测定黄曲霉毒素的技术和分析方法包括：薄层色谱法、高压液相色谱法(HPLC)、气相色谱分析法(GC)。用于快速检测黄曲霉毒素的方法主要为：在含量精确到每毫升中1毫微克的方法[1]、用血清抗体的原理快速检测的免疫分析法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)[2，3]。另外，对检查各种各样农产品中黄曲霉毒素的体外试剂盒已发展成不少于十种。

[0006] 但是，目前大多数检验检测方法都需要专用仪器和复杂程序[4， 5]，检测时间长，检测费用高等缺点。

[0007] 参考文献：

[0008] [1]J.Public.Health Manag.Pract.1997，3：61-69.

[0009] [2]Arch.Environ.Contam.Toxicol.1989，18：308-314.

[0010] [3]Int.J.Food Microbiol.2005，99：185-194.

[0011] [4]Crit.Rev.Food Sci.Nutr.2014，54：64-83.

[0012] [5]Crit.Rev.Food Sci.Nutr.1991，30：403-439.

发明内容

[0013] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种谷物和食品中快速检测黄曲霉毒素含量的方法，该检测方法不需要特殊的检测仪器，检测步骤简单易行，检测成本低，检测时间短。本发明的方法适用于快速检测各种谷物、食品和动物饲料中的黄曲霉毒素的含量。

[0014] 本发明的目的是由如下的技术方案来实现的。

[0015] 一种谷物和食品中快速检测黄曲霉毒素的方法，包括如下步骤：

[0016] (1)将待测样品粉碎或者切成小块，置于试管中，加入萃取溶剂搅拌或振摇萃取，取萃取液，得供试品；

[0017] (2)将步骤(1)的供试品和黄曲霉毒素标准样品分别点加在相同的薄层硅胶板或滤纸上，其中点加供试品和黄曲霉毒素标准样品时，均以点加量递增的顺序依次点加；

[0018] (3)待步骤(2)的薄层硅胶板或滤纸上的溶剂挥干后，在波长366nm的紫外灯下比较供试品和黄曲霉毒素标准样品的荧光颜色和荧光强度，确定荧光颜色和荧光强度均为相似的标准样品点样斑点B和供试品点样斑点A，认为斑点B和斑点A中含有的黄曲霉毒素总含量相同；

[0019] (4)计算待测样品中黄曲霉毒素含量μg，计算公式为：待测样品中加入的萃取溶剂总体积μl×斑点B所含的黄曲霉毒素总量μg/斑点A的供试品点加体积μl。

[0020] 本发明中，步骤(1)中所述萃取溶剂为三氯甲烷、丙酮、甲醇中的一种，所述待测样品与萃取溶剂的质量体积比(g∶ml)为1∶1-5，优选为1∶1-2，萃取时间为5-10min，优选为5min。

[0021] 在本发明中，所述黄曲霉毒素标准样品为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、混合黄曲霉毒素中的一种或多种。

[0022] 在本发明的技术方案中，所述混合黄曲霉毒素为黄曲霉毒素毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2按质量比1∶1∶1∶1混合的混合物。在本发明的技术方案中，所述待测样品优选为花生、玉米，大米、小麦、棉籽、坚果类、饲料中的一种。所述待测样品也可以为其他谷物、各种食品以及动物饲料。

[0023] 在本发明的技术方案中，所述黄曲霉毒素标准样品溶于三氯甲烷，浓度为0.1μg/μl。

[0024] 在本发明的技术方案中，在步骤(2)中所述供试品和黄曲霉毒素标准样品点样直径在不大于1cm，点样一次性完成或分多次完成，点加量1-80μl。

[0025] 本发明的有益效果：

[0026] (1)本发明的检测方法步骤简单，不需要特殊的设备和实验场所，检测时间短，每次检测时间15-20min，也可以大量样品的同时检测，便于产业上应用。

[0027] (2)本发明的检测方法，检测成本低，使用溶剂量极少，环保，产业应用价值高。

[0028] (3)本发明的检测方法，适用于快速检测各种谷物、食品和动物饲料中的黄曲霉毒素的含量以及可以初步判断样品中所含的黄曲霉毒素的种类。

[0029] (4)本发明的检测方法，简单易学、便于培训和推广。

附图说明

[0030] 本发明共有3个附图。

[0031] 图1为本发明实施例1中点加在薄层硅胶板上的供试品和黄曲霉毒素标准样品在紫外灯下的荧光检测结果；其中a(上面的一行样品斑点)为供试品点样斑点，其中斑点1-7的点样量依次为1、2、4、8、16、32、64μl；b(下面的一行斑点)为黄曲霉毒素标准样品点样斑点，其中斑点1-7的点样量依次为1.25、2.5、5、10、20、40、80μl。

[0032] 图2为本发明实施例2中生长在培养基上的寄生曲霉(Y1)和生长在培养基上的黄曲霉菌(Y2)的照片。

[0033] 图3为本发明实施例2中点加在薄层硅胶板上的供试品和黄曲霉毒素标准样品在紫外灯下的荧光检测结果；其中斑点Y1-1、Y2-1、Y3-1、Y4-1、E-1分别为点加量为1μl的Y1供试品、Y2供试品、Y3供试品、Y4供试品和黄曲霉毒素标准样品；Y1-10、Y2-10、Y3-10、Y4-10、E-10分别为点加量为10μl的Y1供试品、Y2供试品、Y3供试品、Y4供试品和黄曲霉毒素标准样品。

具体实施方式

[0034] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学试剂公司购买。

[0035] 实施例1花生中生长的黄曲霉毒素含量的测定

[0036] (1)取发霉花生1粒，称重，0.45g，将其切成小块，置于试管中，加入800μl三氯甲烷，搅拌萃取5分钟，取萃取液，得供试品；

[0037] (2)将步骤(1)的供试品和黄曲霉毒素标准样品分别点加在相同的薄层硅胶板，其中点加供试品和黄曲霉毒素标准样品时，均以点加量递增的顺序依次点加，供试品和黄曲霉毒素标准样品的点加量如表1。

[0038] 表1.供试品和黄曲霉毒素标准样品在薄层硅胶板上的点样量

[0039]

[0040]

[0041] 表1中黄曲霉毒素标准样品为黄曲霉毒素毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2按质量比1∶1∶1∶1混合的混合物，混合黄曲霉毒素标准样品溶于三氯甲烷中，最终溶液浓度为0.1μg/μl。

[0042] (3)待步骤(2)的薄层硅胶板上的溶剂挥干后，在波长366nm的紫外灯下比较供试品和黄曲霉毒素标准样品的荧光颜色和荧光强度，结果如图1。

[0043] 图1中a(上面的一行样品斑点)为供试品点样斑点，其中斑点1-7的点样量依次为1、2、4、8、16、32、64μl；b(下面的一行斑点)为黄曲霉毒素标准样品点样斑点，其中斑点1-7的点样量依次为1.25、2.5、5、10、20、40、80μl。

[0044] 由图1的结果可知，斑点a和斑点b均有较强的蓝色荧光，说明均含有黄曲霉毒素B。其中a中的斑点虽有少量的亮光，但主要以蓝色荧光为主，可以判断a斑点的样品(供试品)中主要含有具有蓝色荧光的黄曲霉毒素B，而具有绿色荧光的黄曲霉毒素G含量相对于黄曲霉毒素B低很多。

[0045] 进一步，a中斑点3的荧光与b中斑点4很相似，可以认为b中斑点4中所含的黄曲霉毒素含量与a中斑点3所含的黄曲霉毒素含量相同。虽然荧光颜色和荧光强度有所不同，这是因为黄曲霉毒素标准样品中含有50％黄曲霉毒素G1和G2(绿色荧光)。而供试品中黄曲霉毒素B1和B2(蓝色荧光)为主，G1和G2量少。进一步测试各种毒素的种类与含量，并准确定性和定量，可用较为复杂的分析法。本发明的目的在于提供一种适用于现场的快速估量样品中的黄曲霉毒素种类和含量的方法。

[0046] b中斑点4所含的黄曲霉毒素含量：0.1μg/μl×10μl＝1μg。

[0047] (4)计算待测样品(花生1粒，0.45g)所含的黄曲霉毒素的含量＝提取花生时加入的三氯甲烷总体积(800μl)×b中斑点4所含的黄曲霉毒素含量(1μg)/a中斑点3点样量(4μl)＝200μg。

[0048] 可知，所述发霉的1粒花生样品(0.45g)中含有200μg的黄曲霉毒素，且可以确定所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、B2为主，G1、G2为辅的混合物，进一步可以判断发霉花生中含有少量寄生曲菌。

[0049] 根据步骤(1)-(4)计算得到的结果可以估量含有发霉花生的花生样品的黄曲霉毒素含量是否符合相关食品质量标准，具体方法为如下：

[0050] 由上述步骤(1)-(4)，确定0.45g发霉花生中含有大约200μg的黄曲霉毒素，即每g发霉花生中所含的黄曲霉毒素的含量：200μg/0.45g＝444μg，即1g发霉花生中含有444ppb的黄曲霉毒素。

[0051] 在实例应用中，若1000g花生中仅有两粒(大约1克)这样发霉的坏花生，其平均黄曲霉毒素含量大约444ppb，也就是说美国食品药品管理局在花生和其他食品中最高允许含量(20ppb/1000g)的22倍。

[0052] 实施例2

[0053] 检测寄生曲霉、黄曲霉菌生长在培养基上和污染花生样品上黄曲霉毒素种类和含量。

[0054] 待测样品：生长在培养基上的寄生曲霉(Y1)、生长在培养基上的黄曲霉菌(Y2)、寄生曲霉侵染花生(Y3)、黄曲霉菌侵染花生(Y4)。

[0055] 所述Y1、Y2是在PDA培养基上分别接种寄生曲霉和黄曲霉菌后，在30℃培养5天后得到的菌丝体，如图2，可见寄生曲霉在培养基上长满菌丝并产生孢子(Y1)。

[0056] (1)用小刀分别从Y1和Y2剪出1cm x 1cm带有霉菌的琼脂(0.5cm thick)，总量3
为0.5cm。切成小片，分别置于试管中，加入 800μl三氯甲烷，搅拌萃取5分钟，取萃取液，得Y1供试品和Y2供试品。

[0057] 将0.5g Y3、0.5g Y4(一粒)，切成小片，分别置于试管中，加入800μl三氯甲烷，搅拌萃取5分钟，取萃取液，得Y3供试品和Y4供试品。

[0058] (2)Y1供试品、Y2供试品、Y3供试品和Y4供试品和黄曲霉毒素标准样品分别点加在相同的薄层硅胶板。

[0059] 为简化起见，其中点加供试品和黄曲霉毒素标准样品时，分别以1μl(下边一行)和10μl(上边一行)两种剂量点加(如图3)。

[0060] 所述黄曲霉毒素标准样品为黄曲霉毒素毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2按质量比1∶1∶1∶1混合的混合物，混合黄曲霉毒素标准样品溶于三氯甲烷中，最终溶液浓度为0.1μg/μl。

[0061] (3)待步骤(2)的薄层硅胶板上的溶剂挥干后，在波长366nm的紫外灯下比较供试品和黄曲霉毒素标准样品的荧光颜色和荧光强度，结果如图3。图3中斑点Y1-1、Y2-1、Y3-1、Y4-1、E-1分别为点加量为1μl的Y1供试品、Y2供试品、Y3供试品、Y4供试品、黄曲霉毒素标准样品(简称：样品E)；Y1-10、Y2-10、Y3-10、Y4-10、E-10分别为点加量为10μl的样品Y1供试品、Y2供试品、Y3供试品和Y4供试品和样品E。

[0062] (4)根据荧光颜色可以推测黄曲霉毒素的种类。由图3的结果可知，Y1供试品和Y3供试品的荧光颜色与样品E极为相似，为蓝色和绿色的混合色。说明Y1供试品和Y3供试品毒素种类为黄曲霉毒素B和G。这个结果与寄生曲霉产生B1、B2、G1、G2完全吻合。

[0063] Y2供试品和Y4供试品的荧光颜色为蓝色，与样品E有明显区别。Y2供试品和Y4供试品显示蓝色荧光，没有与绿色荧光共混时的发亮的荧光，说明其毒素种类为黄曲霉毒素B而不含黄曲霉毒素G。这个结果与黄曲霉菌只产生黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2完全吻合。

[0064] (5)根据荧光强度可以估算黄曲霉毒素的含量。

[0065] 点加量为1μl时的样品E(斑点E-1)中黄曲霉毒素含量：1μl×0.1μg/μl＝0.1μg。

[0066] 点加量为10μl时的样品E(斑点E-10)中黄曲霉毒素含量：10μl×0.1μg/μl＝1μg。

[0067] Y1供试品与样品E很接近。其浓度为0.1μg/μl，可知样品Y1的800μl萃取液中含有80μg黄曲霉毒素；

[0068] Y2供试品相当于样品E的四分之一。其浓度为0.025μg/μl，可知样品Y2的800μl萃取液中含有20μg黄曲霉毒素；

[0069] Y3供试品相当于样品E的两倍。其浓度为0.2μg/μl，可知样品Y3的800μl萃取液中含有160μg黄曲霉毒素；

[0070] Y4供试品相当于样品E的两倍。其浓度为0.2μg/μl，可知样品Y4的800μl萃取液中含有160μg黄曲霉毒素；

[0071] 检测可知所产生的毒素产量：寄生曲霉生长在培养基上每cm3可以产生160μg黄3
曲霉毒素；而黄曲霉菌生长在培养基上每cm可以产生40μg黄曲霉毒素。发霉的1粒花生样品(0.5g)中含有160μg的黄曲霉毒素。