表面改性的重金属纳米粒子、组合物及其用途

摘要

提供了表面改性的重金属纳米粒子，该表面改性的重金属纳米粒子包含重金属芯和包覆层，该包覆层包含共轭到聚乙二醇的至少一种配体，其中至少一种配体选自N‑乙酰半胱氨酸、白蛋白、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、氨基硫醇、硫代羧酸、氨、胺、二胺或其任何组合。还提供了包含表面改性的重金属纳米粒子的组合物及其在治疗和诊断各种病状中的用途。

权利要求

1.一种表面改性的重金属纳米粒子，包含：重金属芯和包覆层，所述包覆层包含共轭到聚乙二醇(PEG)的至少一种配体，其中所述至少一种配体是N-乙酰半胱氨酸(NAC)，所述N-乙酰半胱氨酸结合到所述重金属芯的表面，且其中所述表面改性的重金属纳米粒子在水中稳定达至少3个月。

2.根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子，其中所述至少一种配体共价结合到所述重金属芯的表面。

3.根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子，其中所述重金属选自金、金物质、银、铂、铁、铜、镍、钯、铱、钛或铅。

4.根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子，其中所述重金属是金物质。

5.根据权利要求3所述的表面改性的重金属纳米粒子，其中所述金物质是AuCl3、AuF3、AuBr3、HAuCl4或MAuCl4，其中M代表碱金属阳离子。

6.根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子，其中所述表面改性的重金属纳米粒子具有从0.5nm到400nm的尺寸。

7.根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子，实质上呈干粉形式。

8.一种分散在水中或缓冲液中的根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子的水分散体。

9.一种用于制备表面改性的重金属纳米粒子的工艺，包括以下步骤：将共轭到聚乙二醇(PEG)的至少一种配体添加到包含重金属纳米粒子的混合物中，其中所述至少一种配体结合到所述重金属纳米粒子芯的表面，产生表面改性的重金属纳米粒子，其中所述配体是N-乙酰半胱氨酸(NAC)，且其中所述表面改性的重金属纳米粒子在水中稳定达至少3个月。

10.根据权利要求9所述的工艺，其中通过以下来制备所述混合物：(a)将至少一种表面活性剂与至少一种有机溶剂混合在水溶液中以产生乳液；

(b)将重金属物质的溶液和至少一种还原剂添加到步骤(a)的所述乳液中，以产生还原的金属纳米粒子。

11.根据权利要求10所述的工艺，还包括分离包含所述表面改性的重金属纳米粒子的无机相与有机相。

12.根据权利要求9所述的工艺，其中所述重金属是金物质。

13.根据权利要求12所述的工艺，其中所述金物质是AuCl3、AuF3、AuBr3、HAuCl4或MAuCl4，其中M代表碱金属阳离子。

14.根据权利要求9所述的工艺，其中所述表面改性的重金属纳米粒子具有从0.5到

400nm的尺寸。

15.根据权利要求9所述的工艺，还包括干燥水相，产生呈干燥形式的表面改性的重金属纳米粒子。

16.根据权利要求9所述的工艺，包括将所述表面改性的重金属纳米粒子分散在水中或缓冲液中。

17.根据权利要求10所述的工艺，其中所述至少一种表面活性剂包括至少一种脂肪酸。

18.根据权利要求17所述的工艺，其中所述至少一种脂肪酸是油酸。

19.根据权利要求10所述的工艺，其中所述有机溶剂是乙醇。

20.根据权利要求10所述的工艺，其中所述至少一种还原剂是抗坏血酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸钠、硼氢化钠或硼氢化锂中的任一种。

21.根据权利要求10所述的工艺，其中所述还原剂是抗坏血酸。

22.根据权利要求10所述的工艺，还包括添加至少一种第二有机溶剂。

23.根据权利要求22所述的工艺，其中所述第二有机溶剂是己烷、环己烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯或甲苯。

24.通过根据权利要求9所述的工艺可获得的表面改性的重金属纳米粒子。

25.通过根据权利要求9所述的工艺可获得的表面改性的重金属纳米粒子的水分散体。

26.一种药物组合物，包含根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子。

27.根据权利要求26所述的药物组合物，还包含药学上可接受的添加剂、载体、缓冲液、稳定剂或赋形剂中的至少一种。

28.根据权利要求26所述的药物组合物，适合于口服施用、注射或输注。

29.根据权利要求26所述的药物组合物，用于医学治疗或医学诊断。

30.根据权利要求26所述的药物组合物，用于治疗恶性病症。

31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述恶性病症是癌症、肉瘤、胚细胞瘤或母细胞瘤中的任一种。

32.根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子在制备药物组合物中的用途。

33.根据权利要求32所述的表面改性的重金属纳米粒子的用途，其中所述药物组合物被用于治疗恶性病症。

34.根据权利要求33所述的表面改性的重金属纳米粒子的用途，其中所述恶性病症是癌症、肉瘤、胚细胞瘤或母细胞瘤中的任一种。

35.根据权利要求34所述的表面改性的重金属纳米粒子的用途，其中所述药物组合物被用于诊断恶性病症。

36.根据权利要求35所述的用途，其中所述治疗或诊断是在体外或在体内。

37.一种可注射溶液，包含根据权利要求26所述的药物组合物。

38.一种无菌注射器，包含根据权利要求37所述的可注射溶液。

39.一种试剂盒，包含：

(a)根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子的水分散体或包含所述水分散体的药物组合物，其中，所述水分散体包含水或在4.5到8之间的pH值下的缓冲液；

(b)用于向患者施用所述水分散体或所述药物组合物的装置；及(c)使用说明书。

40.一种试剂盒，包含：

(a)根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子，其呈干燥形式；

(b)用于分散所述表面改性的重金属纳米粒子的水溶液，其中所述水溶液包含水或在

4.5和8之间的pH值下的缓冲液；

(c)用于向患者施用所述水溶液的装置；及

(d)使用说明书。

41.根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子或包含所述表面改性的重金属纳米粒子的药物组合物在制备用于治疗或诊断恶性病症的药剂中的用途，其中所述药剂以治疗有效量施用至有需要的受试者。

42.根据权利要求41所述的用途，其中施用是口服、通过输注或通过注射。

43.一种用于金属纳米粒子的表面改性的N-乙酰半胱氨酸(NAC)-聚乙二醇(PEG)共轭物，其中所述N-乙酰半胱氨酸(NAC)能够结合到金属纳米粒子芯的表面，且其中所述N-乙酰半胱氨酸(NAC)-聚乙二醇(PEG)共轭物赋予所述金属纳米粒子在水中达至少3个月的稳定性。

44.根据权利要求43所述的共轭物，其中所述金属是金物质。

45.根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子或包含所述表面改性的重金属纳米粒子的药物组合物在制备用于在分子成像中使用的探针中的用途。

46.根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子或包含所述表面改性的重金属纳米粒子的药物组合物在制备用于在光学成像中使用的光活性剂中的用途。

47.根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子或包含所述表面改性的重金属纳米粒子的药物组合物在制备用于在计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)中使用的造影增强剂中的用途。

48.根据权利要求1所述的表面改性的重金属纳米粒子或包含所述表面改性的重金属纳米粒子的药物组合物在制备用于在药物递送中使用的载体中的用途。

说明书

表面改性的重金属纳米粒子、组合物及其用途

发明领域

[0001] 本发明涉及表面改性的金属纳米粒子以及它们在治疗和诊断各种健康相关的病状中的用途的领域。

[0002] 发明背景

[0003] 纳米粒子是纳米标度尺寸的小物体，纳米粒子在其运输和特性方面表现为整个单元。纳米粒子可以展示与在细小颗粒或粒状材料中观察到的那些特性显著不同的尺寸相关的特性。以前已经报道了用于制备金纳米粒子的方法(例如，J.Turkevich等人，Discuss.Faraday.Soc.1951，11，55-75；J.Kimling等人，J.Phys.Chem.B2006，110，15700-15707；G.Frens，Colloid&Polymer Science1972，250，736-741；G.Frens，Nature(London)，Phys.Sci.1973，241，20-22；M.Brust等人，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.1994，7，801-802；
Manna等人(2003)Chem.Mater.15(1)：20-28；S.D.Perrault；W.C.W.Chan(2009)J.Am.Chem.Soc.131(47)：17042；M.N.Martin等人，Langmuir26(10)：7410)。经常通过还原具有10±60nm直径的金卤化物单分散的颗粒来制备胶体金，由Frens使用用于还原HAuCl4的柠檬酸钠来描述。

[0004] 金水溶胶是典型的疏液胶体，其颗粒带有大量的负表面电荷(表面电势是～50mV)，且因此，它仅在非常低的离子强度的溶液中是稳定的。在疏液系统中，在化学组成和界面结构方面，分散介质和分散相实质上是不同的，因此未补偿在界面处的表面力。因此，这些系统是热力学上不稳定的且需要专门稳定。

[0005] 稳定金纳米粒子：金颗粒表面的强的负电荷提供了它们与高分子质量化合物的强吸附相互作用。已知硫原子和金原子形成配价键。烷烃硫醇连接体HS(CH2)nR(R＝COOH、OH或SO3H；n＝11±22)正被用于实现将生物分子更强地连接到金颗粒上。这些连接体与金的相互作用提供了在颗粒表面形成单层的硫醇盐。

[0006] 近年来，已经发现合成聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亚胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(乙酸乙烯酯)、聚酰胺胺(树枝状大分子)、聚二噻富烯、壳聚糖以及类似物，应用于单分散的胶体金(CG)的合成。在这些聚合物的存在下形成的颗粒以较高的尺寸和形状均一性为特征。不幸的是，已用于生产稳定的金纳米粒子的合成方法和稳定剂不提供用于医用的最佳金纳米粒子，这需要在水分散体中高度稳定且非常浓的金属纳米粒子。在如例如，美国专利第6,955,639号中已经提出了金属纳米粒子在医学应用中的用途，该美国专利涉及用金属纳米粒子增强辐射效应的方法。

[0007] 针对它们在治疗和诊断各种健康相关的病状中的用途，在本领域仍然还有对制备显示增强的特性，如改进的稳定性和溶解度、降低的毒性、改进的生物利用度、改进的药代动力学的金属纳米粒子的需求。

[0008] 发明概述

[0009] 本发明提供了新型的表面改性的重金属纳米粒子、包含该表面改性的重金属纳米粒子的组合物及其用途。与其他金属纳米粒子制剂相比，本发明的新型的表面改性的重金属纳米粒子展示了改进的特性。尤其，本发明提供了展示改进的和增强的特性的新型的聚乙二醇(PEG)-N-乙酰半胱氨酸(NAC)表面改性的金纳米粒子。还提供了用于制备可以用于癌症治疗或癌症诊断的表面改性的重金属纳米粒子的稳定水分散体的方法。

[0010] 在一些实施方案中，本发明基于惊人的且出乎意料的发现：通过诸如烷烃硫醇连接体HS(CH2)nR的含有硫醇的基团来修饰的金属纳米粒子在含有蛋白的溶液以及其他生理溶液中是不稳定的，因为纳米粒子形成了聚集体且失去了它们的纳米粒子形式和结构。出乎意料地，本发明人发现用于金属纳米粒子的表面改性的新型PEG-NAC组合物，使这样的纳米粒子能够在含有蛋白的溶液以及其他生理溶液诸如例如血液和血浆中分散和溶解。与单独通过含有硫醇的基团(如NAC)的表面改性相比，使用NAC-PEG来表面改性提供了优良的结果，单独通过含有硫醇的基团(如NAC)的表面改性不允许纳米粒子在含有蛋白的溶液以及其他生理介质中的分散和溶解。根据另外的实施方案，本发明的新型PEG-NAC表面改性的重金属纳米粒子展示了改进的/增强的特性，诸如，例如改进的水溶性(即是高度亲水性的)；改进的稳定性(超过6个月的长时间内稳定以及在生理条件下稳定)；降低的毒性；改进的生物利用度(需要较低剂量的表面改性的重金属纳米粒子以获得生物效应)；改进的药代动力学特性(如通过血液中较高的半衰期来例示)；是可生物降解的；生产容易且有成本效率(甚至以较大的工业规模)；以及类似特性。在另外的实施方案中，所述新型的表面改性的重金属纳米粒子的改进特性允许制备包覆的重金属纳米粒子的高浓制剂且还允许以粉末形式生产它们。在另外的实施方案中，本发明的新型的表面改性的重金属纳米粒子允许各种药物附着于其，其还可以被用作载体以将药物或其他物质递送到期望的位置。因此，与含有其他金属的纳米粒子相比，具有降低的毒性和增强的生物效应的本发明的新型的表面改性的重金属纳米粒子使得能够使用较高量的重金属。

[0011] 因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含重金属芯和包覆层的表面改性的重金属纳米粒子，该包覆层包含至少一种配体，其中所述至少一种配体结合到重金属纳米粒子芯的表面，且其中所述至少一种配体共轭到聚合物。

[0012] 根据一些实施方案，提供了包含以下的表面改性的重金属纳米粒子：重金属芯和包覆层，所述包覆层包含共轭到聚乙二醇(PEG)的至少一种配体，其中所述至少一种配体选自N-乙酰半胱氨酸(NAC)、白蛋白、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、氨基硫醇、硫代羧酸、氨、胺、二胺或其任何组合；且其中所述至少一种配体结合到重金属纳米粒子芯的表面。在一些实施方案中，配体是N-乙酰半胱氨酸(NAC)。在一些实施方案中，所述至少一种配体共价结合到重金属纳米粒子芯的表面。

[0013] 在一些实施方案中，重金属选自金、金物质(gold species)、银、铂、铁、铜、镍、钯、铱、钛或铅。在一些实施方案中，重金属是金物质。在另外的实施方案中，金物质可以选自AuCl3、AuF3、AuBr3、HAuCl4或MAuCl4，其中M代表碱金属阳离子。

[0014] 在另外的实施方案中，纳米粒子具有从约0.5nm到约400nm的尺寸。

[0015] 在一些实施方案中，表面改性的重金属纳米粒子呈实质上干粉的形式。

[0016] 在一些实施方案中，还提供了表面改性的重金属纳米粒子的水分散体。颗粒可以被分散在水中或缓冲液中。在一些实施方案中，缓冲液可以是在约4.5到约8之间的pH值下。

[0017] 在一些实施方案中，提供了包含以下的表面改性的金纳米粒子：金物质金属芯和包覆层，包覆层包含共轭到聚乙二醇(PEG)的N-乙酰半胱氨酸(NAC)配体，其中N-乙酰半胱氨酸(NAC)配体结合到金物质纳米粒子芯的表面。

[0018] 根据一些实施方案，提供了包含共轭到聚乙二醇(PEG)的N-乙酰半胱氨酸(NAC)的组合物，用于金属纳米粒子的表面改性。

[0019] 根据一些实施方案，提供了用于制备表面改性的重金属纳米粒子的工艺，该工艺包括以下步骤：

[0020] 将共轭到聚乙二醇(PEG)的至少一种配体添加到包含金属纳米粒子的混合物中，其中所述至少一种配体结合到所述重金属纳米粒子芯的表面，产生表面改性的重金属纳米粒子，其中所述配体选自N-乙酰半胱氨酸(NAC)、白蛋白、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、氨基硫醇、硫代羧酸、氨、胺、二胺或其任何组合。在一些实施方案中，所述配体是N-乙酰半胱氨酸(NAC)。在一些实施方案中，通过以下来制备所述混合物：

[0021] (a)将至少一种表面活性剂与至少一种有机溶剂混合在水溶液中以产生乳液；及[0022] (b)将重金属物质的溶液和至少一种还原剂添加到步骤(a)的乳液中，以产生还原的金属纳米粒子。

[0023] 在一些实施方案中，所述重金属是金物质，选自AuCl3、AuF3、AuBr3、HAuCl4或MAuCl4，其中M代表碱金属阳离子。在一些实施方案中，重金属纳米粒子具有从约0.5到约400nm的尺寸。

[0024] 在一些实施方案中，工艺还包括干燥水相，产生呈干燥形式的表面改性的重金属纳米粒子。

[0025] 在一些实施方案中，工艺包括将重金属纳米粒子分散在水中或缓冲液中。缓冲液可以在约4.5到约8之间的pH下。

[0026] 在一些实施方案中，所述至少一种表面活性剂包括至少一种脂肪酸。在一些实施方案中，所述至少一种脂肪酸是油酸。

[0027] 在一些实施方案中，所述有机溶剂是乙醇。在一些实施方案中，所述至少一种还原剂是抗坏血酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸钠、硼氢化钠或硼氢化锂中的任一种。在一些实施方案中，所述还原剂是抗坏血酸。

[0028] 在一些实施方案中，工艺还包括添加至少一种第二有机溶剂。在一些实施方案中，所述第二有机溶剂选自己烷、环己烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯和甲苯。

[0029] 在一些实施方案中，提供了包含表面改性的重金属纳米粒子的药物组合物。所述药物组合物还可以包含药学上可接受的添加剂、载体、缓冲液、稳定剂或赋形剂中的至少一种。在一些实施方案中，所述药物组合物适合于口服施用、注射或输注。在一些实施方案中，所述药物组合物用于医学治疗或医学诊断。在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗或诊断恶性病症，其中所述恶性病症是癌症、肉瘤、胚细胞瘤或母细胞瘤中的任一种。在另外的实施方案中，所述治疗或诊断是在体外或在体内。

[0030] 在另外的实施方案中，提供了包含所述药物组合物的可注射溶液，所述药物组合物包含表面改性的重金属纳米粒子。在另外的实施方案中，提供了包含所述可注射溶液的无菌注射器。

[0031] 在一些实施方案中，提供了包含表面改性的重金属纳米粒子的水分散体的试剂盒。在一些实施方案中，所述分散体包含水或在约4.5到约8之间的pH值下的缓冲液，或包含所述分散体的药物组合物；用于向患者施用所述水分散体或药物组合物的装置；以及使用说明书。

[0032] 在一些实施方案中，提供了包含以下的试剂盒：呈干燥形式的所述表面改性的重金属纳米粒子；用于分散所述表面改性的重金属纳米粒子的水溶液。在一些实施方案中，所述分散体包含水或在4.5和8之间的pH值下的缓冲液；用于向患者施用所述水分散体的装置；以及使用说明书。

[0033] 在另外的实施方案中，提供了治疗或诊断恶性病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述表面改性的重金属纳米粒子或包含所述表面改性的重金属纳米粒子的药物组合物的步骤。可以通过口服、输注或注射施用途径进行施用。

[0034] 在另外的实施方案中，提供了用于金属纳米粒子的表面改性的N-乙酰半胱氨酸(NAC)-聚乙二醇(PEG)共轭物，其中N-乙酰半胱氨酸(NAC)能够结合到金属纳米粒子芯的表面。在一些实施方案中，所述金属是金物质。

[0035] 附图简述

[0036] 为了理解本发明并了解如何可以在实践中进行本发明，现在将仅仅通过非限制性实例的方式，参考附图来描述实施方案，在附图中：

[0037] 图1A-1B是透射电子显微镜(TEM)图像，该图像显示如通过在100nm(图1A)和50nn(图1B)放大率下黑点的出现所指示的表面包覆的金纳米粒子的水分散体的场(field)。图像指示，纳米粒子是分开的且具有小于或等于10nm的尺寸。

[0038] 图2.显示用作重金属纳米粒子的表面涂层的PEG-NAC分子(共轭物/化合物)的1H-NMR光谱。

[0039] 图3A-D显示多次静脉内(IV)注射不同浓度的金纳米粒子后小鼠组的平均体重变化(g)随时间(注射后的天数)的图。图3A-I组小鼠的体重变化(每隔一天用100mg/kg金纳米粒子治疗，持续6天)。图3B-II组小鼠的体重变化(用100mg/kg金纳米粒子iv治疗5天，停2天并继续5天(5/2/5))。图3C-III组小鼠的体重变化(用150mg/kg金纳米粒子iv治疗，5/2/5)。图3D-IV组小鼠的体重变化(用200mg/kg金纳米粒子iv治疗，5/2/5)。在给药后进行26天的预定终止前，用GNP治疗的动物中没有出现死亡率；

[0040] 图3E.多次i.v.给药单独的200mg/ml PEG-NAC-金纳米粒子(G1)或与照射组合的200mg/ml PEG-NAC-金纳米粒子(G2)后，健康雌性裸鼠中体重变化百分比随时间的图。

[0041] 图4.容纳PEG-NAC表面包覆的金纳米粒子的细胞培养基皿(左手皿)或容纳NAC表面包覆的金纳米粒子的细胞培养基皿(右手皿)的象形图。与在其中观察到GNP-蛋白共轭物的形成的容纳相同浓度的NAC表面包覆的金纳米粒子的细胞培养基相比，容纳PEG-NAC表面包覆的金纳米粒子的细胞培养基皿显得澄清。

[0042] 图5A.NAC-金纳米粒子在人血液中的象形图，显示形成了蛋白-GNP共轭物。

[0043] 图5B.PEG-NAC-黄金纳米粒子在人血液中的象形图，显示没有形成蛋白-GNP共轭物。

[0044] 图6A.显示NAC表面改性的金纳米粒子在具有肿瘤的小鼠的血浆中或肿瘤中的药代动力学的图。该图显示金在用NAC表面改性的金纳米粒子注射的小鼠的血浆中或肿瘤中的浓度(注射后的小时数)。

[0045] 图6B.显示PEG-NAC表面改性的金纳米粒子在具有肿瘤的小鼠的血浆中或肿瘤中的药代动力学的图。该图显示金在用PEG-NAC表面改性的金纳米粒子注射的具有肿瘤的小鼠的血浆中或肿瘤中的浓度(注射后的小时数)；

[0046] 图6C.显示PEG-NAC表面改性的金纳米粒子(肿瘤AuPEG-GNP)或NAC表面改性的金纳米粒子(“常规GNP”)在肿瘤中每克肿瘤注射剂量百分比(％)随时间(注射后的天数)的图。

[0047] 图6D.显示PEG-NAC表面改性的金纳米粒子(AuPEG-GNP)或NAC表面改性的金纳米粒子(“常规GNP”)在血浆中每克血浆注射剂量百分比(％)随时间(注射后的天数)的图。

[0048] 详述

[0049] 本公开内容基于研究结果：意外地提供了表面改性的重金属纳米粒子的稳定的且无毒的水分散体，该纳米粒子以高浓度存在于水分散体中，水分散体可以向受试者全身施用，并可以展示改进的特性，如降低的毒性、改进的稳定性、增强的生物利用度、改进的药代动力学以及类似特性。

[0050] 发明人已经开发了表面改性的金属纳米粒子的新型水分散体和允许制备这些水分散体的方法学。尤其，发明人已经开发了新型表面改性的金纳米粒子，其中表面改性包含共轭到聚乙二醇(PEG)的N-乙酰半胱氨酸(NAC)配体，其中N-乙酰半胱氨酸(NAC)配体结合到金物质纳米粒子芯的表面。出乎意料地，这样的改性向纳米粒子提供改进的和增强的特性。如本文中所例示的，改进的特性包括这样的特性如，但不限于：改进的水溶性(即是高度亲水性的)；改进的稳定性(超过6个月的长时间内稳定并在生理条件下稳定)；降低的毒性；改进的生物利用度(需要较低剂量的表面改性的重金属纳米粒子以获得生物效应)；改进的药代动力学特性(如通过在血液中较高的半衰期来例示)；是可生物降解的；生产容易且有成本效率(甚至以较大的工业规模)；以及类似特性。

[0051] 发明人已经发现，在添加包覆配体从而获得表面改性的金纳米粒子之前，通过在乳液环境中制备中间态化合物，即还原的金纳米粒子来形成表面改性的金纳米粒子的稳定水分散体是可能的。经由上面提到的中间步骤制备金纳米粒子的水分散体有助于获得稳定的金纳米粒子，该金纳米粒子可以被稳定地分散在水溶液中，尤其以相当大的浓度。

[0052] 本文中所公开的表面改性的金属纳米粒子以高浓度存在于本发明的水分散体中，并在7.3-7.4的生理pH下，或在活细胞、组织、器官中，以及在体内或在体外环境中是稳定的。此外，纳米粒子可以通过全身施用，用作治疗工具或用于诊断目的。

[0053] 例如，以高浓度被包含的表面改性的金属纳米粒子的水分散体，可以通过金纳米粒子比围绕它们的其他轻原子显著吸收更多的治疗辐射的能力以及它们以电子和低能光子形式发射二次辐射的能力，而可能显著地改进恶性病症的辐射疗法，该二次辐射在破坏癌细胞方面是非常有效的。

[0054] 通过如下面所描述的新型制备方法来生产表面改性的金纳米粒子的水分散体。

[0055] 本发明包括如将在下面所描述的几个方面，且可以概括如下：表面改性的金属纳米粒子、表面改性的金属纳米粒子的水分散体、它们的制备方法、包含它们的药物组合物及其在医学治疗或诊断中的用途。

[0056] 因此，根据一个方面，提供了包含重金属芯和包覆层的表面改性的重金属纳米粒子，该包覆层包含至少一种配体，其中至少一种配体通过共价键结合到重金属纳米粒子芯的表面。

[0057] 术语“纳米粒子”在本文用于表示直径小于约400nm的任何微观颗粒，其中每个纳米粒子在运输特性和物理性质以及化学性质方面表现为完整单元。

[0058] 如本文中所用的，术语“约”是指指示值的±10％。

[0059] 术语“重金属”在本文用于表示展示金属特性的元素的子集的成员，其可以包括过渡金属、类金属、镧系元素或锕系元素。

[0060] 在一些实施方案中，重金属可以是，例如金、铂、银、铁、铜、镍、钯、铱、钛或任何其他重金属中的任一种。根据一个实施方案，金属是铁。

[0061] 根据一些实施方案，金属是金。根据另外的实施方案，金是选自AuCl3、AuF3、AuBr3、HAuCl4或MAuCl4的金物质，其中M代表碱金属阳离子。

[0062] 如本文中所用的，术语“表面改性的重金属纳米粒子”是指包含在它们的表面上的包覆层的金属纳米粒子，由此包覆层改性纳米粒子表面，且其中包覆层包含至少一种配体。在一些实施方案中，配体还可以共轭到聚合物。

[0063] 如本文中所用的，术语“PEG-NAC表面改性的重金属纳米粒子”涉及重金属芯纳米粒子和包覆层，包覆层包含共轭到聚乙二醇(PEG)的N-乙酰半胱氨酸(NAC)配体，其中N-乙酰半胱氨酸(NAC)配体结合(共价或非共价)到重金属纳米粒子芯的表面。在示例性实施方案中，重金属是金物质。

[0064] 如本文中所用的，术语“PEG-NAC化合物”、“PEG-NAC共轭物或“PEG-NAC分子”可以被互换使用，并涉及包含共轭到N-乙酰半胱氨酸(NAC)的聚乙二醇(PEG)的化合物。

[0065] 如本文中所用的，术语“NAC表面改性的重金属纳米粒子”涉及重金属芯纳米粒子和包覆层，该包覆层包含不共轭到聚乙二醇(PEG)的N-乙酰半胱氨酸(NAC)配体。N-乙酰半胱氨酸(NAC)配体结合(共价或非共价)到重金属纳米粒子芯的表面。在示例性实施方案中，重金属是金物质。

[0066] 如本文中所用的，术语“GNP”是指金纳米粒子。

[0067] 如本文中所用的，具有至少一种配体的纳米粒子表面的包覆是例如包覆纳米粒子的芯的外表面的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

[0068] 如本文中所用的术语“配体”是可溶于水，并能够结合(共价或非共价)金属纳米粒子芯的表面，且因此通过包覆表面来改性纳米粒子的表面从而形成表面改性的金属纳米粒子的任何有机配体。

[0069] 在一些实施方案中，配体是N-乙酰半胱氨酸、白蛋白或氨基酸(如例如，但不限于半胱氨酸、甲硫氨酸和谷胱甘肽)、氨基硫醇、硫代羧酸、氨和胺、二胺或其任何组合，或能够结合金纳米粒子的任何配体中的至少一种。

[0070] 在一个实施方案中，配体可以是N-乙酰半胱氨酸。在一个实施方案中，配体可以是半胱氨酸。

[0071] 根据本公开内容，配体可以具有至少一个游离巯基，该巯基可以例如经由配体的任一种硫基和金属原子的相互作用而结合到金属纳米粒子。

[0072] 根据一些实施方案，配体可以共轭到聚合物上。在一个实施方案中，该聚合物是聚乙二醇(PEG)。

[0073] 根据一个实施方案，表面改性的金属纳米粒子具有约0.5nm到约400nm的尺寸。

[0074] 在一些实施方案中，尺寸小于100nm，例如小于90nm，小于80nm，小于70nm，小于60nm，小于50nm，小于40nm，小于30nm，小于20nm，或小于10nm。在一些实施方案中，纳米粒子具有小于10nm的尺寸。

[0075] 在一些实施方案中，表面改性的重金属纳米粒子可以呈实质上干粉形式。在适当条件下，例如在真空条件下，在约2℃到约8℃之间的温度下，干粉可被长时间储存，可能直到进一步使用。

[0076] 在一些实施方案中，本发明提供了分散在水中或在约4.5到约8之间的pH下的缓冲液中，例如，在约7.3到约7.4之间的pH的生理缓冲液中的表面改性的重金属纳米粒子的水分散体。

[0077] 根据一些实施方案，可以通过将包含表面改性的重金属纳米粒子的干粉溶解在水中或在约4.5到约8之间的pH下，例如在约7.3到约7.4的生理pH下的缓冲溶液中来获得表面改性的重金属纳米粒子的水分散体。

[0078] 当在2℃-8℃的适当的储存条件下储存时，本发明的表面改性的纳米粒子分散体在化学上和物理学上稳定储存至少3个月，且甚至6个月的时间。

[0079] 本公开内容的上下文中的“稳定性”可以通过各种化学方法和/或物理方法来确定，且应被视为意指没有观察到聚集体或沉淀的显著形成。在这些储存条件下，没有观察到聚集体或沉淀的形成。在一些实施方案中，“稳定性”是指保持粒子的纳米尺寸。

[0080] 一般来说，可以理解，稳定取决于配体在分散介质中的溶解性、纳米粒子将配体结合在它们表面上的能力以及通过配体的表面覆盖度。

[0081] 本发明的表面改性的金属纳米粒子的水分散体可以用于癌症治疗。如示例性实施方案中所示的，当将癌细胞在包含金纳米粒子的水分散体的介质中温育时，金纳米粒子以一定的量被递送入癌细胞中且没有观察到毒性副作用，该一定的量取决于在温育培养基中的纳米粒子浓度，和取决于温育时间。

[0082] 本公开内容提供了制备表面改性的重金属纳米粒子的方法，该方法包括以下步骤：

[0083] (a)将至少一种表面活性剂与至少一种有机溶剂混合在水溶液中以产生乳液；

[0084] (b)将重金属物质的溶液和至少一种还原剂添加到步骤(a)的乳液中，以产生还原的金属纳米粒子；

[0085] (c)将至少一种配体添加到步骤(b)的混合物中，其中至少一种配体结合重金属纳米粒子芯的表面，产生表面改性的重金属纳米粒子。

[0086] 该方法还可以包括额外的步骤(d)，该步骤(d)包括分离包含重金属纳米粒子的无机相与有机相。

[0087] 在一些实施方案中，步骤(a)的至少一种有机溶剂是水溶性的有机溶剂。在一些实施方案中，在步骤(a)将至少一种表面活性剂与至少一种第一水溶性的有机溶剂混合在水溶液中以产生乳液。

[0088] 术语“表面改性的重金属纳米粒子”是指包覆有配体的重金属纳米粒子，其中配体结合到金属纳米粒子的表面，从而改性了所述表面，且其中“重金属”可以是金、铂、银、铁、铜、镍、钯、铱、钛或任何其他重金属中的任一种。在一个实施方案中，金属是金。在一些实施方案中，配体还可以共轭到另一种物质，如聚合物。

[0089] 根据工艺(a)的第一步骤，当在碱性碱溶液或水溶液中将至少一种表面活性剂和至少一种第一水溶性的有机溶剂混合后获得乳液。

[0090] 在本发明的上下文中，术语“乳液”应理解为两种或更多种不可混溶的(不可混合的)液体的混合物。乳液由分散且连续的相组成；这些相之间的边界被称为界面。由于分散相的小尺寸，微乳液往往显得澄清。

[0091] 在本发明的上下文中，术语“表面活性剂”可以是指降低液体的表面张力的化合物。

[0092] 在一些实施方案中，表面活性剂可以包括脂肪酸，其中脂肪酸可以是，例如长链的饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸。

[0093] 在一些实施方案中，脂肪酸可以选自例如油酸、亚油酸或芥酸、棕榈油酸、十六碳烯酸(sapienic acid)、肉豆蔻烯酸。根据一些实施方案，脂肪酸是油酸。

[0094] 根据一些实施方案，至少一种表面活性剂可以包括脂肪酸的混合物。根据一些其他实施方案，脂肪酸的混合物可以主要包括油酸。在一些特定的实施方案中，脂肪酸的混合物包含65％wt.的油酸。

[0095] 在该发明的上下文中，至少一种“第一水溶性的有机溶剂”应是指与水混合时形成基本均匀的混合物的任何有机溶剂。根据本发明的水溶性的有机溶剂可以是乙醇或丙酮。根据一些实施方案，水溶性的有机溶剂可以是乙醇。

[0096] 在本发明的上下文中，术语“碱性溶液”应是指可溶碱的溶液，其中，由一般的化学定义来定义“碱”，其中碱是能接受水合氢离子的物质。

[0097] 根据本发明所用的碱可以是任何碱性碱，例如氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液或任何其他碱性金属氢氧化物，但其他碱也可能是合适的，包括例如氨。在一些实施方案中，碱是氢氧化钠。

[0098] 包含至少一种表面活性剂，其中表面活性剂可以是例如脂肪酸或脂肪酸混合物；至少一种第一水溶性的有机溶剂的溶液可以在部分溶解脂肪酸的条件下在碱性溶液中混合以形成乳液。

[0099] 在如室温的温度下，可以例如使用磁力搅拌器混合合适的时间量，例如约5分钟。

[0100] 根据工艺(b)的第二步骤，将重金属物质的溶液和至少一种还原剂添加到上面所详述的乳液中以产生还原的金属纳米粒子。

[0101] 在一些实施方案中，“重金属”可以是如上面所定义和所详述的任何金属物质。在一些实施方案中，金属是金。

[0102] 如本文中所用的“离子金属物质”被认为是含有或可以产生(且因此是前体)金属离子的任何物质或化学实体。

[0103] 根据一些实施方案，其中金属是金，“离子金物质”可以选自AuCl3、AuF3、AuBr3、HAuCl4或MAuCl4，其中M代表碱金属阳离子，例如钠阳离子或钾阳离子。根据一些其他实施方案，离子金物质是HAuCl4。因此，HAuCl4是产生[AuCl3]-离子的前体离子物质。

[0104] 根据一些其他实施方案，“离子金属物质”可以选自FeCl2、FeSO4、FeCl3。

[0105] 本文中所用的至少一种“还原剂”是能够还原乳液内的离子金属物质的试剂。在一些实施方案中，还原剂是有机的或无机的。这样的还原剂的非限制性实例可以是例如抗坏血酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、存在或缺乏丹宁酸的柠檬酸钠、硼氢化钠、具有柠檬酸钠或EDTA和氰基硼氢化物的混合物中的硼氢化物、肼、二苯基氨基磺酸钠或硼氢化锂及其任何组合中的任一种。

[0106] 根据一些其他实施方案，还原剂是抗坏血酸。

[0107] 在金属是金的实施方案中，可以以相对于离子金物质的2∶1的摩尔比添加还原剂。

[0108] 可以根据本发明使用的可选择的还原方法可以是例如照射方法，如超声波、UV照射或脉冲或激光辐解。

[0109] 在金属是金的实施方案中，在混合过程中可以添加离子金属物质，并可以任选地产生淡黄色的溶液。在添加包含至少一种还原剂的溶液之后，溶液颜色可以变成红葡萄酒的紫色，可能表明离子金物质的还原的完成。

[0110] 在本申请的上下文中，应该理解，在乳液中添加金属物质可以提供控制所形成的纳米粒子的尺寸且因此能够形成预定尺寸的纳米粒子的方法。

[0111] 根据工艺(c)的第三步骤，至少一种配体被添加到上面的混合物中。

[0112] 如本文中所用的术语“配体”是如上面所详述的，且可以是溶于水且能够通过结合(共价或非共价)到金属来包覆金属纳米粒子的表面从而形成表面改性的金属纳米粒子的任何有机配体。

[0113] 至少一种具有至少一个游离硫基的配体的共价结合，可以是例如经由配体的任一种硫基和金属原子的相互作用。

[0114] 在一些实施方案中，配体是N-乙酰半胱氨酸、白蛋白和氨基酸(例如，半胱氨酸和甲硫氨酸、谷胱甘肽)、氨基硫醇、硫代羧酸、氨和胺、二胺或其任何组合，或能够结合金属纳米粒子的任何配体中的至少一种。

[0115] 在一些实施方案中，配体是N-乙酰半胱氨酸。在一些实施方案中，配体是半胱氨酸。金属和配体之间的摩尔比可以是1∶4，优选1∶6，更优选1∶8。

[0116] 根据本发明，配体可以共轭到聚合物上。根据本公开内容的聚合物是惰性且无毒的聚合物。通常使用的聚合物包括，不限于此：聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亚胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(乙酸乙烯酯)、聚酰胺胺(树枝状大分子)、聚二噻富烯、壳聚糖。

[0117] 在一些实施方案中，聚合物可以是线性聚合物，例如PEG。

[0118] 根据本公开内容，在将至少一种配体添加到如上面所详述的混合物中前，可以进行PEG与至少一种配体的共轭。

[0119] 根据一些实施方案，金属纳米粒子的表面改性是共轭到聚乙二醇(PEG)的N-乙酰半胱氨酸(NAC)的化合物。在一些实施方案中，金属纳米粒子和NAC-PEG化合物之间的摩尔比可以是在约1∶1到1∶20的范围内。例如，在一些实施方案中，金属纳米粒子和NAC-PEG化合物之间的摩尔比可以是1∶1。例如，在一些实施方案中，金属纳米粒子和NAC-PEG化合物之间的摩尔比可以是1∶2。例如，在一些实施方案中，金属纳米粒子和NAC-PEG化合物之间的摩尔比可以是1∶4。例如，在一些实施方案中，金属纳米粒子和NAC-PEG化合物之间的摩尔比可以是1∶8。例如，在一些实施方案中，金属纳米粒子和NAC-PEG化合物之间的摩尔比可以是1∶10。例如，在一些实施方案中，金属纳米粒子和NAC-PEG化合物之间的摩尔比可以是1∶20。

[0120] 根据一些实施方案，提供了NAC-PEG化合物。在一些实施方案中，NAC-PEG化合物可以用于金属纳米粒子的表面改性。

[0121] 根据本发明，表面改性的重金属纳米粒子的水分散体可以共轭到第二分子例如抗体，其中抗体可以有助于将金属纳米粒子例如靶向到如例如诊断中所关注的位点。此外，本发明的纳米粒子可以共轭到在视觉上或以其他方式可检测的部分，例如发色团或荧光团。

[0122] 添加至少一种配体后，可以混合溶液合适的时间段，例如，但不限于约30分钟，更优选多于1小时。

[0123] 将至少一种配体添加到含有还原的金属纳米粒子的混合物中可以导致水溶性的表面改性的金属纳米粒子的形成。

[0124] 根据一些实施方案，在添加至少一种配体的过程中，可以将pH调节到碱性的pH，优选高于9、9.5、10的pH的pH值，优选高于pH9的pH值。这可以允许大部分脂肪酸被转变成脂肪酸盐，这又允许配体结合金纳米粒子。

[0125] 根据本发明，可以使用例如通过用任何碱性碱，可能氢氧化钠或氢氧化钾的滴定来调节pH。

[0126] 根据一些另外的实施方案，可以将至少一种第二有机溶剂添加到含有水溶性的表面改性的金纳米粒子的溶液中，且其后可以将pH调节到酸性pH。可以搅拌溶液例如至少一小时。

[0127] 根据本发明，“第二有机溶剂”是与在酸性pH下溶解脂肪酸的与水不溶混的任何有机溶剂。添加该溶剂往往导致两相分离成未乳化的性质不同的相，从而分离有机相与水相。

[0128] 在一些实施方案中，第二有机溶剂是己烷、环己烷、乙醚、戊烷、环戊烷、氯仿、乙酸乙酯或甲苯。根据一些实施方案，第二有机溶剂是己烷。

[0129] 根据一些实施方案，添加第二有机溶剂并将pH调节到酸性pH，例如，低于pH7、低于pH6.5、低于pH6、低于pH5.5、低于pH5，低于pH4.5，低于4、低于pH3的酸性pH。在一些实施方案中，pH低于pH6.5。可以使用任何酸，例如盐酸来调节pH。

[0130] 添加第二有机溶剂并将pH调节到酸性pH使相分离成为可能，其中将乳液分离成水相和有机相。

[0131] 水相可以包含表面包覆的金属纳米粒子，其中有机相可以包含有机溶剂和脂肪酸。

[0132] 根据一些实施方案，添加第二有机溶剂后，还可以将至少一种配体添加到反应混合物中。根据一些实施方案，至少一种配体将结合金属纳米粒子的表面上的游离位点。根据该实施方案，配体可以是例如白蛋白，该白蛋白可以被添加并可以允许将混合物在磁力搅拌器上搅拌例如30分钟。

[0133] 相分离后，可以例如通过合适的装置，如例如，通过使用分液漏斗来分离有机相与水相。

[0134] 根据本发明，还可以干燥水相。根据本发明，干燥水相可以是，例如通过蒸发、真空干燥、冷冻干燥(冻干法)、干燥或去除水残留物或水分并获得例如呈粉末形式的固体的产物的任何其它合适的技术。

[0135] 在一些实施方案中，干燥可以包括蒸发微量的第一水溶性的有机溶剂，产生表面改性的金属纳米粒子的干粉。

[0136] 在一些实施方案中，可以将干粉溶解在水中或在约4.5到约8之间的pH下，优选7.3-7.4的生理pH下的缓冲液中。溶解干粉产生表面改性的重金属纳米粒子的水分散体。

[0137] 在一些实施方案中，金属纳米粒子的水分散体包含以从约1nm到约100nm，从约1nm到10nm，从约10nm到20nm，从约20nm到30nm，从约30nm到40nm，从约40nm到50nm，从约50nm到60nm，从约60nm到70nm，从约70nm到80nm，从约80nm到90nm，从约90nm到100nm的尺寸的金属纳米粒子。在一些实施方案中，金属纳米粒子具有小于10nm的尺寸。

[0138] 将本发明的金属纳米粒子以0.001μM-1M的浓度，例如以大于0.005M，大于0.01M，大于0.05M，大于0.1M，或有时大于0.5M的浓度分散在水溶液中。

[0139] 可以通过使用两相微乳液方法来进行金属纳米粒子的制备(例如，如由M.Burst等人，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.S，1994，7，801-802所描述的)。因此，将含有金属的试剂从水相转移到有机相。添加表面活性剂溶液后，形成了微乳液。还原反应在分散相中进行，该分散相中液滴尺寸是至多100nm。因此，实际上形成了单分散的纳米粒子。在合成纳米粒子的微乳液方法中，经常将烷烃硫醇添加到反应溶液中，用于稳定颗粒。将最终的金纳米粒子分散在有机相中，用烷烃硫醇稳定。

[0140] 在另一方面，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含如本文中所公开的表面改性的重金属纳米粒子。在一些实施方案中，药物组合物和制剂可以包含无菌水溶液，其还可以包含至少一种药学上可接受的添加剂，如但不限于渗透增强剂、载体化合物、缓冲液、稳定剂、稀释剂或其它药学上可接受的载体或赋形剂。

[0141] 根据一些实施方案，药物组合物可用于医学治疗或医学诊断。

[0142] 本公开内容的药物组合物可例如用于恶性病症的医学诊断。如本文中所用的“医学诊断”是指确定可能的疾病或病症的特性。诊断可以基于迹象、症状和测试结果的组合。根据本公开内容，药物组合物可以例如在癌症检测中用作例如用于分子成像的探针、用于光学成像的光活性剂、在计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)或能够检测癌症且另外提供评价的任何方法中的造影增强剂。

[0143] 本发明的药物组合物还可以包含额外的治疗活性剂。

[0144] 根据一些实施方案，药物组合物可以适合于口服施用、注射或输注。

[0145] 本公开内容的药物组合物可用于例如，治疗恶性病症或细胞增殖性病症，如，例如，可以是例如实体肿瘤或非实体肿瘤的恶性肿瘤。在一些实施方案中，本公开内容的药物组合物可用于例如，治疗与细胞的增加的、增强的或异常的增殖相关联的非恶性病症。

[0146] 在一些实施方案中，恶性病症可以是，例如，实体肿瘤如癌症、肉瘤、黑色素瘤、胚细胞瘤或母细胞瘤。

[0147] 在一些实施方案中，恶性病症可以是，例如在嘴唇和口腔、咽、喉、鼻旁窦、大唾液腺、甲状腺、食道、胃、小肠、结肠、结肠直肠、肛管、肝、胆囊、肝外胆管、法特氏壶腹、外分泌胰腺、肺、胸膜间皮瘤、骨、软组织肉瘤的肿瘤；皮肤、乳房、外阴、阴道、子宫颈、子宫体、卵巢、输卵管、妊娠滋养细胞肿瘤、阴茎、前列腺、睾丸、肾、肾盂、输尿管、膀胱、尿道的癌症和恶性黑色素瘤；眼睑癌、结膜癌、结膜的恶性黑色素瘤、血管膜的恶性黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、泪腺癌；眼窝、脑、脊髓、血管系统的肉瘤；血管肉瘤和卡波济氏肉瘤。

[0148] 在一些实施方案中，恶性病症可以包括，例如，非实体肿瘤，如白血病或淋巴瘤。

[0149] 在一些实施方案中，医学治疗可以是，例如，恶性病症的辐射治疗或与辐射治疗组合的任何治疗。因此，包含金属纳米粒子的水分散体的药物组合物可用于辐射治疗以增强恶性病症的治疗中的选择性。

[0150] 辐射治疗应理解为使用高能辐射源的治疗，高能辐射源例如但不限于X射线、γ射线，以及通过影响癌细胞生活力用于癌症治疗的带电颗粒。

[0151] 可以通过外部光束辐射源装置、同步加速器辐射源或可选择地通过内部辐射源如身体内递送的放射性物质将辐射递送到接近癌细胞的位置，如短程治疗。

[0152] 在其他实施方案中，本发明的药物组合物可以与任何过热治疗组合，例如与激光、UV、RF、超声波以及所用的任何其他过热源组合使用。

[0153] 应当理解，表面改性的金属纳米粒子的水分散体本身可以在治疗上用于医学治疗或医学诊断或者可选择地与辐射组合或与常规使用的任何治疗方法组合使用。

[0154] 根据一些实施方案，可以例如通过全身施用或局部施用向患者施用药物组合物。

[0155] 术语“全身施用”应是指包括肠内施用的施用途径，包括例如口服、直肠、舌下或含服施用或肠胃外施用，肠胃外施用可以包括例如刺穿皮肤或粘膜。

[0156] 术语“局部施用”应是指包括应用到身体部分的表面的施用途径。

[0157] 在一些实施方案中，施用途径可以包括，例如，静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、透皮、经粘膜、瘤内、胃内、鼻内或例如通过片剂、胶囊、锭剂或滴剂口服或例如通过霜剂、皮肤贴片以及类似物的局部施用，或其任何组合。

[0158] 在一些实施方案中，可以经由胃内施用或口服施用通过消化系统将药物组合物递送入循环。

[0159] 在一些实施方案中，可以通过注射或输注施用药物组合物。

[0160] 在一些实施方案中，可以给所关注的目标直接施用药物组合物，例如，用于辐射治疗。在一些实施方案中，例如，通过注射，施用可以接近待治疗的肿瘤。

[0161] 应理解，表面改性的金属纳米粒子的水分散体本身可以如上面对药物组合物所描述的来施用。

[0162] 如本文中可以理解的，可以通过使用有效量的表面改性的金属纳米粒子的水分散体或含有该水分散体的组合物来实现如根据本发明所描述的治疗。

[0163] 术语“有效量”、“治疗有效量”或“剂量”在本文中可交换地使用，且意指达到所选结果所需要的任何量，其现在可以包括用于治疗癌症或增殖的恶性或非恶性的病症尤其是杀死癌细胞或其他不正常的细胞所需的金属纳米粒子的量。

[0164] 治疗有效量或剂量取决于待治疗的疾病状态的严重性和应答性，疗程持续一个小时到几个小时，或直到实现治愈，或实现疾病状态的减少。可以以包括每天一次施用或每天多次施用剂量的方案向有需要的人提供剂量。

[0165] 普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、剂量方法学和重复率。最佳剂量可以根据本发明的表面改性的金纳米粒子的水分散体或包含该水分散体的组合物的相对效力而变化，且通常可以根据EC50来估计，发现在体外细胞模型、体外器官或组织模型以及在体内动物模型中是有效的。本领域的普通技术人员可以容易地根据测量的停留时间、可以例如受有需要的受试者的年龄、性别和体重影响的浓度，来估计剂量的重复率。

[0166] 根据本公开内容，当在组合治疗例如辐射治疗或所用的任何另外的治疗中使用时，可以相应地调节剂量。

[0167] 在本文中可以互换使用术语“疾病”、“病症”和“病状”。

[0168] 如本文中用来描述本发明的，“恶性肿瘤(malignant)”、“癌症”、“肿瘤”、“恶性肿瘤(malignancy)”、“恶性增殖”、“过度增殖”全部等效地涉及组织或器官的增生。

[0169] 如本文中所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指改善了具有癌症或恶性增殖或非恶性疾病的患者体内的疾病活动的一个或多个临床征象。本文中“治疗”是指治疗学治疗。

[0170] 在一些实施方案中，在体外或体内可以使用表面改性的金属纳米粒子的水分散体或包含该水分散体的药物组合物进行恶性病症的治疗或诊断。

[0171] 如本文中所用的，术语“在体内”可以是指体内治疗或体内诊断，且应理解为在活的有机体中发生的过程。当是指在体内的诊断时，术语在体内还应理解为可以在活的有机体中以侵入的或非侵入的方式来进行的任何诊断，例如但不限于MRI、CT。

[0172] 术语“体外”包括对可以从有需要的患者提取的体液如血液、尿、唾液或脑脊液(CSF)、器官或组织进行的任何治疗或诊断。

[0173] 在本发明的另一方面，提供了如上面所描述的表面改性的重金属纳米粒子在制备药物组合物中的用途。

[0174] 在一些实施方案中，药物组合物可用于如上面所描述的医学治疗或医学诊断。

[0175] 在本发明的又一方面，提供了包含表面改性的重金属纳米粒子的水分散体或包含如上面所描述的水分散体的药物组合物的可注射溶液。在一些实施方案中，提供了包含该溶液的无菌注射器。该注射器可以例如是一次性的且从而使用一次或被制造用于多次使用程序。

[0176] 在本发明的又一方面，提供了可以包含分散在水中或在水溶液中的表面改性的重金属纳米粒子的水分散体的试剂盒。在一些实施方案中，水溶液包含在4.5和8之间的pH值下；例如在约7.3到7.4的生理pH值下的缓冲液，或包含水分散体的组合物；用于向患者施用水分散体或组合物的装置；及使用说明书。

[0177] 在本发明的另一方面，提供了可以包含呈干燥形式的表面改性的重金属纳米粒子、用于分散表面改性的重金属纳米粒子的水溶液的试剂盒。在一些实施方案中，水分散体包含水或在4.5和8之间的pH值下，例如，在约7.3到7.4的生理pH值下的缓冲液，用于向患者施用水分散体的装置；及使用说明书。

[0178] 分散表面改性的重金属纳米粒子或含有表面改性的重金属纳米粒子的药物组合物的水溶液，可以包括另外的组分，只要组分与分散体是相容的，其中相容应理解为例如不引起沉淀或不引起聚集的组分。

[0179] 应理解，通过本文中所公开的制备方法制备的并在本文中所公开的治疗方法中使用的表面改性的重金属纳米粒子分散体以及组合物的有利的稳定性提供了使表面改性的重金属纳米粒子维持在水分散体中达延长的时间段或可选择地维持在干燥的形式的方式和可能性。

[0180] 因此，本文中所公开的试剂盒可以包含重金属纳米粒子的水分散体和用于施用该水分散体的装置，例如无菌注射器。在可选择的实施方案中，无菌注射器可以整体包含呈即时使用形式的药物组合物，该药物组合物包含重金属纳米粒子的水分散体。

[0181] 本发明的试剂盒可以包含例如在瓶子、小瓶或安瓿中呈干燥形式的表面改性的重金属纳米粒子；以及用于分散它们且从而在水或在4.5和8之间的pH值下，优选在约7.3到7.4的生理pH值下的缓冲液中原位制备水分散体的水溶液；用于注射组合物的装置，如无菌注射器。

[0182] 试剂盒可以包含无菌注射器，该无菌注射器可以包含呈干燥形式的表面改性的重金属纳米粒子，一旦使用，呈干燥形式的表面改性的重金属纳米粒子被分散，并从而在水或在例如4.5和8之间的pH值下；例如，在约7.3到7.4的生理pH值下的缓冲液中制备纳米粒子的分散体，它们全部在注射器中。

[0183] 本发明还提供了治疗或诊断恶性病症的方法。本发明的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如上面所描述的表面改性的重金属纳米粒子或包含表面改性的重金属纳米粒子的药物组合物。应理解，本发明的方法可以任选地使用如由本发明所定义的试剂盒。治疗或诊断的方法可以包括借助于例如口服施用、输注或注射来施用。

[0184] 下面呈现用金作为纳米粒子的重金属芯的本发明的实施方案，作为本发明的实践的非限制性实例，其还可以在根据本发明的纳米粒子组合物和分散体中利用其他金属芯。

[0185] 如说明书和所附权利要求中所用的且根据长期存在的专利法实践，除非上下文清楚地规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”通常是指“至少一个”、“一个或多个”以及其他复数指代物。因此，例如“一个细胞”和“一个纳米粒子”包括细胞的混合物和一个或多个所描述类型的纳米粒子。

[0186] 在整个该说明书和随后的权利要求中，除非上下文要求，否则单词“包含(comprise)”及变化形式例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解意指包含所述整数或步骤、或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤、或整数或步骤的组。实施例

[0187] 材料和方法：

[0188] 油酸-65.0-88.0％(GC)(Aldrich)

[0189] 乙醇-Frutarom(绝对化学纯)

[0190] HAuCl4·3H2O-ACS试剂，Sigma Aldrich

[0191] 抗坏血酸-测试的细胞培养，Sigma Aldrich

[0192] N-乙酰半胱氨酸-Sigma级，Sigma Aldrich

[0193] 半胱氨酸-≥97％(Aldrich)，Sigma Aldrich

[0194] NaOH-SigmaUltra，Sigma Aldrich

[0195] 正己烷-化学纯，Frutarom

[0196] EMT-6癌细胞-小鼠乳腺癌细胞系[Technion，Israel]

[0197] DMEM、D-葡萄糖、FBS、L-谷氨酰胺溶液、Pen-Strep溶液-Biological Industries[0198] 胰蛋白酶-EDTA溶液-Biological Industries

[0199] 王水-王水是通常以各自3∶1的摩尔比的盐酸和硝酸的混合物

[0200] HCl-TraceSelect，Fluka Analytical

[0201] HNO3-TraceSelect，Fluka Analytical

[0202] 实施例1：制备包覆有N-乙酰半胱氨酸(NAC)的金纳米粒子

[0203] 将脂肪酸的混合物(3.75ml，65％油酸，亚油酸18％，棕榈酸16％)、NaOH200mg和乙醇(15ml)添加到30ml的水(Milli-Q，Millipore)中，并且允许溶液在磁力搅拌器上搅拌5分钟。

[0204] 然后，搅拌同时添加HAuCl4(50mg)，产生了淡黄色的溶液，接着缓慢地将5ml0.05M抗坏血酸添加到溶液中。当完成金物质的还原时(如通过溶液的颜色变成酒红色所指示的)，将N-乙酰半胱氨酸(124mg)缓慢地添加到溶液中。允许溶液搅拌30分钟。

[0205] 然后用NaOH2M将pH缓慢调节到pH＝9，并允许所得溶液在磁力搅拌器上进一步搅拌至少一个小时。

[0206] 之后，添加正己烷(20ml)，并将溶液继续在磁力搅拌器上搅拌至少另外的一小时。

[0207] 然后，用HCl溶液(37％)将所得的反应混合物的pH调到pH＝7。

[0208] 使用分液漏斗将混合物分成两相，即有机相和水相。在真空下蒸发水相以去除微量的有机溶剂。将包含表面改性的金纳米粒子的干粉溶解在5ml水(Milli-Q，Millipore)中，产生表面改性的金纳米粒子的水分散体。使用渗析管渗析水分散体以去除不需要的产物。

[0209] 按照本文所描述的制备的表面改性的金纳米粒子的水分散体以如图1A和1B中所阐明的单独的纳米粒子存在。如在图1A和1B中所示，显示为黑“点”的纳米粒子是分离的，并不形成聚集体。此外，可以看出，金纳米粒子以等于或小于10nm的尺寸存在。

[0210] 实施例2-制备包覆有N-乙酰半胱氨酸(NAC)和白蛋白的金纳米粒子

[0211] 将油酸(3.75ml)、NaOH200mg和乙醇(15ml)添加到30ml水(Milli-Q，Millipore)中，允许溶液在磁力搅拌器上搅拌5分钟。

[0212] 然后，添加HAuCl4(50mg)产生浅黄色溶液，搅拌同时，将5ml0.05M抗坏血酸缓慢添加到溶液中。当完成Au的还原时(溶液的颜色变为酒红色)，将N-乙酰半胱氨酸(111.6mg，在5ml水中)缓慢添加到溶液中。允许溶液搅拌30分钟。

[0213] 然后使用NaOH2M将pH慢慢调节到pH＝9，并允许所得的溶液在磁力搅拌器上搅拌至少一小时。之后，添加正己烷(20ml)，在磁力搅拌器上继续搅拌溶液至少另外的一小时。

[0214] 用HCl溶液(37％)将所得的反应混合物的pH调节到pH＝7。

[0215] 然后，添加过量的白蛋白，并允许混合物在磁力搅拌器上搅拌30分钟。

[0216] 用分液漏斗将混合物分成两相，即有机相和水相。在真空下蒸发水相，以去除微量的有机溶剂。将包含表面改性的金纳米粒子的干粉溶解在5ml水(Milli-Q，Millipore)中。

[0217] 实施例3-制备N-乙酰半胱氨酸(NAC)和聚乙二醇(PEG)衍生物

[0218] 材料和方法：合成前体(N-乙酰-L-半胱氨酸＞99％，及对甲苯磺酸一水合物＞98.5％，和聚(乙二醇)-600)均购自Sigma-Aldrich，没有进行进一步纯化。溶剂(甲苯＞
99.5％，甲醇“分析的(analytical)”，和二氯甲烷“Ar”＞99.9％)分别购自Frutarom和Gadot，且没有进行进一步纯化就被使用。用于NMR测量的氘化溶剂(DMSO-d6和D2O)购自Sigma-Aldrich。用于色谱法的溶剂是分析等级。碳酸钠(Na2CO3)＞99.8％，及硫酸钠(Na2SO4)＞99％购自Frutarom。分析薄层色谱法(TLC)用F-254的指示器在硅胶板上进行，通过用UV光照射显像。用硅胶(Grace)0.040-0.063mm(Merck)进行柱色谱法。在Bruker Avance400(400MHz1H NMR)上记录1H NMR光谱。以ppm报告化学位移值(δ)(对于1H，TMSδ＝
0ppm；对于1H，残留的DMSO-d6δ＝2.5ppm)。质子光谱被报告为以下δ(多重性、耦合常数J、质子数、部分)。通过s(单峰)、t(三重峰)、m(多重峰)等等，来指示多重性。

[0219] 制备NAC：PEG分子：250ml单颈圆底烧瓶配备有磁力搅拌器、迪安-斯达克榻分水器和回流冷凝器。用甲苯(150ml)中的N-乙酰半胱氨酸(“NAC”3.26g，20mmol)和聚(乙二醇)-600(“PEG-600”，12.0g，20mmol))装载烧瓶。添加对甲苯磺酸一水合物(“p-TSA”，4.0g，
21mmol)，并将搅拌的混合物在油浴(约140℃)中在回流下加热2-3小时(用TLC监测反应)。
允许混合物冷却至环境温度，并观察到两相。通过添加碳酸钠(2g)来中和混合物，并搅拌2小时(气体冒泡)。在减压下蒸发溶剂并将残余物溶解在二氯甲烷中，过滤沉淀物，将有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并用旋转蒸发器浓缩以产生粘性油。

[0220] 通过硅胶柱色谱法(洗脱液：CH2Cl2∶CH3OH，95∶5)来纯化产物。收集适当的部分，并用旋转蒸发器浓缩，以产生作为黄色粘性油的7.4g(9.7mmol，48.5％)的产物。1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ：1.82(s，1H，SH)，2.13(s，3H，CH3)，3.34-3.60(m，56H，PEG-CH2O)，4.13-4.22(m，2H，CH2S)，5.05(t，J＝8.1Hz，1H，CH)，5.69(s，1H，NH)。

[0221] NAC-PEG的1H-NMR光谱被显示于图2中。

[0222] 为了制备NAC-PEG包覆的纳米粒子，在25℃下用PEG-NAC溶液(按照上面所描述的制备)以1∶1摩尔比温育10mg/ml的金纳米粒子24小时。

[0223] 实施例4-制备包覆有半胱氨酸的金纳米粒子

[0224] 将油酸(3.75ml)、NaOH200mg和乙醇(15ml)添加到30ml水(Milli-Q，Millipore)中，并允许溶液在磁力搅拌器上搅拌5分钟。

[0225] 然后，添加HAuCl4(50mg)以产生浅黄色溶液，搅拌同时，将5ml0.05M的抗坏血酸缓慢添加到溶液中。当完成Au的还原时(溶液的颜色变为酒红色)，将半胱氨酸(5ml水中，92.6mg)缓慢添加到溶液中。允许溶液搅拌30分钟。

[0226] 然后使用NaOH2M将pH慢慢调节到pH＝9，并允许所得的溶液在磁力搅拌器上搅拌至少一小时。之后，添加正己烷(20ml)，在磁力搅拌器上继续搅拌溶液至少另外的一小时。

[0227] 用HCl溶液(37％)将所得的反应混合物的pH调节到pH＝7。

[0228] 使用分液漏斗将混合物分成两相，即有机相和水相。在真空下蒸发水相以去除微量的有机溶剂。将包含表面改性的金纳米粒子的干粉溶解在5ml水(Milli-Q，Millipore)中。

[0229] 实施例5-具有含有90％半胱氨酸和10％白蛋白的涂层的金纳米粒子

[0230] 将油酸(3.75ml)、NaOH200mg和乙醇(15ml)添加到30ml水(Milli-Q，Millipore)中，并允许溶液在磁力搅拌器上搅拌5分钟。

[0231] 然后，添加HAuCl4(50mg)以产生浅黄色溶液，搅拌同时，将5ml0.05M抗坏血酸缓慢添加到溶液中。当完成Au的还原时(溶液的颜色变为酒红色)，将半胱氨酸(5ml水中，83.34mg)缓慢添加到溶液中。允许溶液搅拌30分钟。

[0232] 然后使用NaOH2M将pH慢慢调节到pH＝9，并允许所得的溶液在磁力搅拌器上搅拌至少一小时。之后，添加正己烷(20ml)，在磁力搅拌器上继续搅拌溶液至少另外的一小时。

[0233] 使用HCl溶液(37％)将所得的反应混合物的pH调节到pH＝7。

[0234] 然后添加白蛋白，并允许在磁力搅拌器上搅拌混合物30分钟。

[0235] 使用分液漏斗将混合物分成两相，即有机相和水相。在真空下蒸发水相以去除微量的有机溶剂。将包含表面改性的金纳米粒子的干粉溶解在5ml水(Milli-Q，Millipore)中。

[0236] 实施例6：NAC表面改性的金纳米粒子或PEG-NAC表面改性的金纳米粒子在含有蛋白的溶液中的稳定性。

[0237] 在生长培养基(DMEM)中测试NAC表面改性的金纳米粒子或PEG-NAC表面改性的金纳米粒子的稳定性。用9.5ml DMEM和500μl NAC表面改性的金纳米粒子或PEG-NAC表面改性的金纳米粒子温育培养板24小时。

[0238] 结果被呈现于图4中，该图显示了容纳PEG-NAC表面包覆的金纳米粒子的细胞培养基皿(左手皿)或容纳NAC表面包覆的金纳米粒子的细胞培养基皿(右手皿)的象形图。如在图4中所示，与其中观察到GNP-蛋白共轭物的形成的容纳相同浓度的NAC表面包覆的金纳米粒子的细胞培养基(右手皿)相比，容纳PEG-NAC表面改性的金纳米粒子的细胞培养基皿显得澄清(左手皿)。因此，与通过单独的NAC的表面改性相比，PEG-NAC表面改性给金纳米粒子提供了增强的溶解性和稳定性。

[0239] 同样，在下列介质中测试金纳米粒子或PEG-NAC表面改性的金纳米粒子的稳定性：血液、生长培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS)溶液。

[0240] 用500μl金纳米粒子或PEG-NAC表面改性的金纳米粒子来温育容纳9.5ml DMEM或FBS的培养板并跟踪24小时。用300μl金纳米粒子或PEG-NAC表面改性的金纳米粒子温育容纳2.5ml血液的管。

[0241] 结果显示，用金纳米粒子温育的板显示形成聚集体并确定出黑色沉积物，该黑色沉积物是不稳定的纳米粒子的指示物。相反地，用PEG-NAC表面改性的金纳米粒子温育的板显示澄清的溶液，没有形成聚集体或其他沉积物，表明表面改性的金纳米粒子在这样的溶液中是稳定的。

[0242] 图5A-B中呈现的结果是用300μl金纳米粒子或NAC-PEG表面改性的金纳米粒子温育的血液样品的光学显微镜图像。图5A-5B中显示的结果表明在用300μl金纳米粒子温育的血液中形成了聚集体(图5A)，然而在用300μl PEG-NAC表面改性的金纳米粒子温育的血液中没有检测到聚集且血溶液仍然是澄清的(图5B)。

[0243] 实施例7：体外测定-将金纳米粒子引入癌细胞

[0244] 在常规生长条件：5％CO2和37.6℃下，EMT-6癌细胞在补充有10％FBS、2％L-谷氨酰胺溶液(200mM)和2％Pen-Strep溶液(Biological Industries)以及4.5m/l D-葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中生长。

[0245] 将根据实施例1的程序制备的表面改性的金纳米粒子的水分散体以0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.127mg/ml或0.253mg/ml的最终浓度中的一个添加到细胞中，在培养箱中持续
2小时或4小时的温育时间，除了添加金纳米粒子之外，将对照细胞保持在相同的条件下。

[0246] 在2小时或4小时的温育时间后，用PBS洗涤细胞，使用胰蛋白酶-EDTA溶液(Biological Industries)收获细胞，使用显微镜计数室(血细胞计数器)在显微镜下计数，并用王水消化用于ICP(电感耦合等离子体光谱法)分析，其中阈值被设置为1ppb。

[0247] 使用Varian720-ES ICP仪器确定每种样品中的金浓度。

[0248] 计算1g细胞中的Au量。也分析对照组的金，结果表明对照样品中没有金。

[0249] 用表面改性的金纳米粒子的水分散体温育细胞后，使用Varian720-ES(电感耦合等离子体质谱法)ICP-MS仪器确定金浓度。ICP-MS是高度敏感的并能确定金属浓度的质谱法仪器。

[0250] 如在表1和表2中可以看出，在测试的浓度和时间段下，表面改性的金纳米粒子的水分散体结合到细胞中。

[0251] 如在表1中可以看出，金纳米粒子结合到癌细胞取决于生长培养基中的金纳米粒子的浓度，以及取决于温育时间。如通过比较经处理的细胞的数量和对照细胞的数量所表明的，在金纳米粒子温育期间在细胞中没有观察到毒性。

[0252] 在另外的研究中，使用了较高浓度的金纳米粒子，如在表2中可以看出，保持了对金纳米粒子浓度和温育时间的依赖性。

[0253] 更重要地，即使在较高浓度下，没有观察到对细胞的毒性作用。因此，表明了表面改性的金纳米粒子的水分散体在体内研究中的安全使用。

[0254] 表1：细胞中的金浓度

[0255]细胞培养基中的金浓度 0.02mg/ml 0.04mg/ml
温育时间 细胞中计算的Au(mg)/g 细胞中计算的Au(mg)/g
2小时-1 1.53 2.68
2小时-2 1.72 3.05
4小时-1 2.70 4.66
4小时-2 1.17 4.00

[0256] 表2：细胞中的金浓度

[0257]细胞培养基中的金浓度 0.127mg/ml 0.253mg/ml
温育时间 细胞中计算的Au(mg)/g 细胞中计算的Au(mg)/g
5.5 5.19 7.12
0.5小时-2 5.02 5.41
1小时-1 5.99 13.2
1小时-2 5.39 17.8
3小时-1 18 32.9
3小时-2 16.4 33.2

[0258] 实施例8：将金纳米粒子递送到肿瘤和各种组织。

[0259] 在这些实验中使用在它们的大腿中具有肿瘤(KHJJ线，小鼠乳腺癌)的Balb/C小鼠(3组，每组15只小鼠)，以显示将金纳米粒子递送到肿瘤和各种组织中。

[0260] 第一实验组是具有诱导的肿瘤的对照组小鼠，用生理溶液(盐水)静脉(i.v.)注射。用50mg/kg根据实施例1到4制备的表面改性的金纳米粒子的水分散体i.v.注射第二实验组中的小鼠。用50mg/kg用N-乙酰半胱氨酸和PEG-半胱氨酸改性的表面改性的金纳米粒子的水分散体i.v.注射第三实验组中的小鼠。

[0261] 在注射后4小时、8小时、24小时、48小时和72小时，使用ICP仪器来分析来自不同组的组织样品(肾、肝、脾、肺、心脏和大脑)的金的存在。

[0262] 实施例9：确定PEG-NAC表面改性的金纳米粒子的最大耐受剂量(MTD)

[0263] 用增加剂量的PEG-NAC表面改性的金纳米粒子的水分散体反复注射(qd)小鼠，并观察一般毒性迹象12-14天的时间段：

[0264] I.多剂量(IV)注射后的MTD评估-多剂量静脉内(IV)注射5只8-12周龄，体重18-22g的雌性裸鼠后，评估金纳米粒子(GNP)的MTD(最大耐受剂量)的确定。100、150和200mg/kg的日剂量，治疗时间表如下面详述的。10mL/kg(0.2mL/20g小鼠)的给药体积。研究的终点是组平均重量减轻超过20％或组中的动物的死亡＞10％。研究终点26天。

[0265] 实验组如下：

[0266] 组1-每隔一天持续6天用100mg/kg金纳米粒子注射(i.v.)的5只雌性裸鼠(qodX6)。

[0267] 组2-用100mg/kg金纳米粒子注射(i.V.)5天，停2天并继续5天的5只雌性裸鼠(5/2/5)。

[0268] 组3-用150mg/kg金纳米粒子注射(i.v.)5天，停2天并继续5天的5只雌性裸鼠(5/2/5)。

[0269] 组4-用200mg/kg金纳米粒子注射(i.v.)5天，停2天并继续5天的5只雌性裸鼠(5/2/5)。

[0270] 结果：

[0271] 结果被呈现于图3A-D中，其显示了各治疗组的平均体重变化(g)随时间(注射后的天数)的图。图3A-I组小鼠的体重变化(每隔一天用100mg/kg金纳米粒子治疗，持续6天)。图3B-II组小鼠的体重变化(用100mg/kg金纳米粒子iv治疗5天，停2天并继续5天(5/2/5))。图
3C-III组小鼠的体重变化(用150mg/kg金纳米粒子iv治疗，5/2/5)。图3D-IV组小鼠的体重变化(用200mg/kg金纳米粒子iv治疗，5/2/5)。在给药后进行26天的预定终止前，用GNP治疗的动物中没有出现死亡率。

[0272] 结果表明，平均体重的统计学上显著的损失不限于任何GNP治疗组。

[0273] II.与辐射组合的多剂量(IV)注射后的MTD评估-与外部辐射组合多剂量静脉内(IV)注射5只雌性裸鼠(8-12周龄，体重18-22g)后评估金纳米粒子的MTD(最大耐受剂量)的确定。

[0274] 日剂量100、150和200mg/kg与2Gy的辐射日剂量组合，治疗时间表5/2/5。10mL/kg(0.2mL/20g小鼠)的给药体积。研究的终点是组平均重量减轻超过20％或组中的动物的死亡＞10％。研究终点26天。

[0275] 结果：

[0276] 结果被呈现于图3E中，该图显示了用单独的200mg/kg PEG-NAC表面改性的金纳米粒子(G1)或与照射组合的200mg/kg PEG-NAC表面改性的金纳米粒子(G2)测试的组的体重(g)变化百分比随时间(注射后的天数)的图。

[0277] 给药后进行26天的预计终止前，用GNP治疗的动物中没有出现死亡率。

[0278] 平均体重的统计学上显著的损失不限于任何GNP治疗组。

[0279] 结果表明，200mg/kg及以下的剂量是安全剂量。

[0280] 实施例10：毒性研究

[0281] 用表面改性的金纳米粒子的水分散体治疗小鼠，并确定CBC和血液化学。

[0282] 血液化学参数包括：ALKP、淀粉酶、胆红素、BUN、钙，胆固醇、ALT、磷ALB、肌酸、蛋白、NH3、AST、Gk、GCT、葡萄糖、LDH、脂肪酶、镁、甘油三酯和尿酸。

[0283] CBC分析：经由Forcyte CBC分析仪分析，提取后不超过4小时测量样品。参数包括：血细胞比容(HCT)、血红蛋白(HGB)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞体积(MCV)、血小板、红细胞计数(RBC)、以及白细胞计数(WBC)的测量。

[0284] 实施例11：药代动力学(PK)研究

[0285] 从具有H460人非小细胞肺癌(NSCLC)动物中收集肿瘤和血液样品，用200mg/kg非表面改性的金纳米粒子或200mg/kg的PEG-NAC表面改性的金纳米粒子来处理。

[0286] 用1×107H460肿瘤细胞侧面皮下注射8到12周龄的CR雌性NCrnu/nu小鼠。细胞注射体积为0.2ml/小鼠。当肿瘤达到250-350mg的平均大小时，进行配对并开始治疗。将PEG-NAC表面改性的金纳米粒子以10mL/kg(0.200mL/20g小鼠)的给药体积注射到1组小鼠中，且将PEG-NAC组合物以10mL/kg(0.200mL/20g小鼠)的给药体积注射到第二组中。根据体重，调节体积。金纳米粒子剂量是200mg/Kg。

[0287] 结果被呈现于图6A-D中。图6A是显示NAC表面改性的金纳米粒子在具有肿瘤的小鼠的血浆中或肿瘤中的药代动力学的图。该图显示了在用NAC表面改性的金纳米粒子注射的小鼠的血浆中或肿瘤中的金的浓度(注射后的小时数)。图6B是显示了PEG-NAC表面改性的金纳米粒子在具有肿瘤的小鼠的血浆中或肿瘤中的药代动力学的图。该图显示了在用PEG-NAC表面改性的金纳米粒子注射的具有肿瘤的小鼠的血浆中或肿瘤中的金的浓度(注射后的小时数)。

[0288] 图6C-D，分别显示了每克肿瘤注射剂量百分比或每克血浆注射剂量百分比。图6C是显示了PEG-NAC表面改性的金纳米粒子(肿瘤AuPEG-GNP)或NAC表面改性的金纳米粒子(“常规GNP”)在肿瘤中每克肿瘤注射剂量百分比(％)随时间(注射后的天数)的图。图6D是显示了PEG-NAC表面改性的金纳米粒子(AuPEG-GNP)或NAC表面改性的金纳米粒子(“常规GNP”)在血浆中每克血浆注射剂量百分比(％)随时间(注射后的天数)的图。

[0289] 结果表明，从PEG-NAC表面改性的金纳米粒子获得较高的肿瘤水平。对于PEG-NAC表面改性的金纳米粒子，金水平在注射纳米粒子后24-72小时达到最大。

[0290] 获得了针对PEG-GNP的长循环时间(如通过在血液中的半衰期确定)。

[0291] 总之，结果表明，使用PEG-NAC的新型表面改性改进了金纳米粒子的药代动力学。