一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物

摘要

本发明公开了一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物，由浓度为100-200mg/mL鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽溶液与浓度为20μg/mL氟苯尼考溶液按照3-4:1的体积比复配形成的复配溶液。本发明通过鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽与抗生素氟苯尼考联用，协同发挥功效，对革兰氏阴性菌有较佳地抗菌抑菌活性，同时达到降低抗生素用药量，减少药物残留，避免或减少耐药菌株产生的目的，提高了鮟鱇鱼皮的经济附加值。

权利要求

1.一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物，其特征在于：所述鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗菌组合物为由浓度为100-200mg/mL鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽溶液与浓度为20 μg/mL氟苯尼考溶液按照3-4:1的体积比复配形成的复配溶液；

所述鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的分子量在2000D以下；

所述鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的制备方法步骤如下：

（1）选取鮟鱇鱼皮清洗沥干后，剪碎得鱼皮碎片；

（2）鱼皮碎片放在稀碱溶液中浸泡24-30 h后用水洗涤，再加入正丁醇溶液去脂肪，搅拌20-28 h后用水洗涤至pH为中性并沥干；

（3）将沥干的鱼皮碎片用捣碎机捣碎，置于稀酸溶液中，加热至45-90℃，并不断搅拌抽提6-9 h，过滤后得到胶原蛋白粗提液；

（4）向胶原蛋白粗提液中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶用量为鮟鱇鱼皮重量的1%-2%，在超声波辅助下，30-40℃温度下酶解2-6 h；然后加入风味蛋白酶，风味蛋白酶用量为鮟鱇鱼皮重量的0.1%-0.2%，调pH为6.5-7.5，在超声波辅助下，40-55℃温度下酶解5-7 h；

（5）酶解液灭酶，加活性炭搅拌后过滤，经真空浓缩后，喷雾干燥得鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽。

2.根据权利要求1所述的一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物，其特征在于：步骤（2）中所述的稀碱溶液为0.25%-0.45%的NaOH溶液，每克鮟鱇鱼皮加25-45 mL所述的稀碱溶液。

3.根据权利要求1所述的一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物，其特征在于：步骤（2）中所述的正丁醇溶液中正丁醇的体积百分含量为7-10%，每克鮟鱇鱼皮加

25-45 mL所述的正丁醇溶液。

4.根据权利要求1所述的一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物，其特征在于：步骤（3）中所述的稀酸溶液为质量分数为0.2-0.4%的柠檬酸溶液，每克鮟鱇鱼皮加

55-75 mL所述的稀酸溶液。

5.根据权利要求1所述的一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物，其特征在于：步骤（4）中超声条件为：超声波频率为25-40 kHz，功率为100-400 W。

6.根据权利要求1所述的一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物，其特征在于：步骤（5）中加入活性碳在40-60℃搅拌1-3 h。

说明书

一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抗菌组合物，特别涉及一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物。

背景技术

[0002] 在水产品加工过程中，下脚料约占原料鱼的30%~55%，鱼头、鱼皮、鱼骨及其残留鱼肉等下脚料中胶原蛋白含量达20%~50%不等。初步研究结果表明，水产胶原蛋白和多肽具有保护胃粘膜、抗溃疡作用、抗过敏、降血压、降胆固醇、抗衰老、促进伤口愈合、增强骨强度和预防骨质疏松、预防关节炎、促进角膜上皮创伤的修复和促进角膜上皮细胞的生长等多种生理活性功能（徐海菊, 蔡健, 陈江萍. 水产胶原蛋白质的基本特性及其在食品加工中的应用[J]. 浙江农业科学, 2010, (2): 324-327）。

[0003] 鮟鱇鱼属冷温性底层鱼类，常栖伏海底，分布于北太平洋西部，我国产于东海北部、黄海及渤海。在鮟鱇鱼的加工中，大量鱼皮被作为下脚料而废弃，这不仅污染了环境，而且也是资源的浪费，再加上目前水产胶原蛋白及多肽本身固有的特性和及其在医学、美容护肤、食品、化工及生物材料等方面的应用研究相对较少，限制其应用的范围。为了提高鮟鱇鱼皮的经济附加值，需要人们不断探索其新的生理活性，大力拓宽胶原蛋白肽的应用范围。迄今有研究表明，牛骨胶原蛋白肽、鲶鱼骨酶解物、低值鱼蛋白多肽-钙螯合物以及胶原蛋白金属配合物具有抗菌活性。而到目前为止还没有鮟鱇鱼多肽与抗生素协同的抗菌抑菌活性的研究报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物，通过鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽与抗生素联用，协同发挥功效，对革兰氏阳性菌有较佳地抗菌抑菌活性，同时达到降低抗生素用药量，减少药物残留, 避免或减少耐药菌株产生的目的，提高了鮟鱇鱼皮的经济附加值。

[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0006] 一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物，所述鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗菌组合物为由浓度为100-200mg/mL鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽溶液与浓度为20 μg/mL氟苯尼考溶液按照3-4:1的体积比复配形成的复配溶液。

[0007] 鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽具有的优点为：易于吸收，不易诱导耐药菌株的产生，还具有稳定、水溶性好，对高等动物正常细胞几乎无害，在体内无残留等特点，同时还具有较高的生物效价和营养价值。发明人研究发现，单纯的鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽对革兰氏阳性菌不具有抗菌抑菌活性，但是与特定的抗生素氟苯尼考复配，可以协同发挥功效，显著增强氟苯尼考对革兰氏阳性菌的抗菌抑菌活性，达到降低抗生素用药量，减少药物残留, 避免或减少耐药菌株产生的目的，提高了鮟鱇鱼皮的经济附加值。此外，由于氟苯尼考属于广谱抗菌药物，其本身对于革兰氏阳性菌也具有一定地抗菌抑菌活性，因此，本发明的产品主要用于革兰氏阴性菌的抗菌抑菌，同时也具有对于革兰氏阳性菌的抗菌抑菌活性。控制鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽与氟苯尼考的配比，在保证抗菌活性的前提在，能最大限度的起到协同增效作用。

[0008] 作为优选，所述鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的分子量在2000D以下。鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的分子量在2000D以下，不但易于被人体吸收利用，且其本身的活性也会更强，尤其是清除羟自由基的活性，与氟苯尼考配合，协同增效作用佳，产品的抗菌抑菌活性佳。

[0009] 作为优选，所述鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的制备方法步骤如下：

[0010] （1）选取鮟鱇鱼皮清洗沥干后，剪碎得鱼皮碎片。

[0011] （2）鱼皮碎片放在稀碱溶液中浸泡24-30 h后用水洗涤，再加入正丁醇溶液去脂肪，搅拌20-28 h后用水洗涤至pH为中性并沥干。

[0012] （3）将沥干的鱼皮碎片用捣碎机捣碎，置于稀酸溶液中，加热至45-90℃，并不断搅拌抽提6-9 h，过滤后得到胶原蛋白粗提液。

[0013] （4）向胶原蛋白粗提液中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶用量为鮟鱇鱼皮重量的1%-2%，在超声波辅助下，30-40℃温度下酶解2-6 h；然后加入风味蛋白酶，风味蛋白酶用量为鮟鱇鱼皮重量的0.1%-0.2%，调pH为6.5-7.5，在超声波辅助下，40-55℃温度下酶解5-7 h。

[0014] 采用双酶酶解，胃蛋白酶和风味蛋白酶作用于肽键的切割位点不同，两者能协同作用即可切断芳香族氨基酸的羧基形成的肽键又可内切和外切以除去苦味和保证释放寡肽，其释放的高F值胶原蛋白肽的相对分子量较小，更能被人体吸收。超声波可以起到乳化效应，能使双酶和胶原蛋白之间均匀地充分的混合和接触，可以提高酶解速度和胶原蛋白肽的提取率。

[0015] （5）酶解液灭酶，加活性炭搅拌后过滤，经真空浓缩后，喷雾干燥得鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽。用活性炭吸附进行脱苦脱色，不仅操作简单，成本较低，而且效果好。

[0016] 通过上述优选的鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的制备方法获得的产品，具有高F值的特点，无异味、色泽均一、易于人体吸收，具有较高的生物效价和营养价值。与氟苯尼考配合，协同增效作用佳。

[0017] 高F 值寡肽是一类由不高于9个氨基酸残基所组成、支链氨基酸(Val、Leu、Ile)与芳香族氨基酸(Tyr、Phe、Trp)含量的物质的量之比即F值≥20的混合寡聚短肽聚合物。从现代营养学角度，与游离氨基酸相比，短肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。有研究报道高F 值寡肽产品具有改善肝性脑病、醒酒、护肝等生理功能，生理功能，也可用于改善手术后和卧床病人的蛋白质营养状况和运动后的营养补充剂。

[0018] 作为优选，步骤（2）中所述的稀碱溶液为0.25%-0.45%的NaOH溶液，每克鮟鱇鱼皮加25-45 mL所述的稀碱溶液。

[0019] 作为优选，步骤（2）中所述的正丁醇溶液中正丁醇的体积百分含量为7-10%，每克鮟鱇鱼皮加25-45 mL所述的正丁醇溶液。

[0020] 作为优选，步骤（3）中所述的稀酸溶液的质量分数为0.2-0.4%的者柠檬酸溶液，每克鮟鱇鱼皮加55-75 mL所述的稀酸溶液。

[0021] 作为优选，步骤（4）中超声条件为：超声波频率为25-40 kHz，功率为100-400 W。

[0022] 作为优选，步骤（5）中加入活性碳在40-60℃搅拌1-3 h。

[0023] 本发明的有益效果是：

[0024] 1、通过鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽与抗生素氟苯尼考联用，协同发挥功效，对革兰氏阳性菌有较佳地抗菌抑菌活性，同时达到降低抗生素用药量，减少药物残留, 避免或减少耐药菌株产生的目的，提高了鮟鱇鱼皮的经济附加值。

[0025] 2、由于氟苯尼考属于广谱抗菌药物，其本身对于革兰氏阳性菌也具有一定地抗菌抑菌活性，因此，本发明的产品主要用于革兰氏阴性菌的抗菌抑菌，同时也具有对于革兰氏阳性菌的抗菌抑菌活性。

[0026] 3、鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽具有易于吸收，不易诱导耐药菌株的产生，还具有稳定、水溶性好，对高等动物正常细胞几乎无害，在体内无残留等特点，同时还具有较高的生物效价和营养价值。

附图说明

[0027] 图1是鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽及协同抗生素以不同配比方式配制的复配液的抗菌效果比较。

[0028] 图2是大肠杆菌正常生长曲线和复配液抑制曲线对比。

具体实施方式

[0029] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

[0030] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

[0031] 实施例1：

[0032] 一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物，所述鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗菌组合物为由浓度为100mg/mL鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽溶液与浓度为20 μg/mL氟苯尼考溶液按照3:1的体积比复配形成的复配溶液。

[0033] 实施例2：

[0034] 一种鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗革兰氏阴性菌组合物，所述鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽抗菌组合物为由浓度为200mg/mL鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽溶液与浓度为20 μg/mL氟苯尼考溶液按照4:1的体积比复配形成的复配溶液。鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的分子量在2000D以下。

[0035] 鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的制备方法如下：

[0036] 方法1：

[0037] 取洗净后的鮟鱇鱼皮1000 g用剪刀剪切成约长宽为2 cm×2 cm碎片（鱼皮能充分接触溶液又保证了碎片不易过小而导致流失）后。

[0038] 在鮟鱇鱼皮碎片中加入25L 质量分数为0.45% NaOH溶液，浸泡24 h 后用水洗涤至pH为中性，再加入35 L体积百分含量为9%的正丁醇溶液，搅拌28 h 后用水洗涤至 pH 为中性并沥干（提高了胶原蛋白的品质）。

[0039] 将已沥干的鮟鱇鱼皮碎片捣碎（捣碎鱼皮碎片以使胶原蛋白能充分溶于提取液，提高鱼皮的提取率），加入55 L质量分数为0.4%的柠檬酸溶液，加热至55℃，并不断搅拌抽提6 h，过滤后得到胶原蛋白粗提液。

[0040] 向胶原蛋白粗提液中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶加入量为鮟鱇鱼皮重量1%，在超声波频率为40 kHz，功率为100 W，温度为35℃下进行酶解4 h；调pH为6.5，加入风味蛋白酶量为鮟鱇鱼皮重量0.15%，在超声波辅助下（超声波频率为40 kHz，功率为100 W）设置温度为50℃酶解6 h。

[0041] 对所得的酶解液加热至95℃，并保持7 min灭酶，灭酶所得酶解液中加入活性碳脱苦脱色，并在40℃搅拌1 h后过滤除去活性碳，再将脱苦脱色后的滤液置于真空旋转蒸发器中进行真空浓缩，最后喷雾干燥，所得到的鮟鱇鱼皮高F 值胶原蛋白肽的重量、纯度及F 值如表1所示。

[0042] 对比方法1：制备条件与方法1完全一致，不同之处在于，未在超声波条件下进行酶解，所得到的鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的重量、纯度及F 值如表1所示。

[0043] 方法2：

[0044] 取洗净后的鮟鱇鱼皮1000 g用剪刀剪切成约长宽为2 cm×2 cm碎片后。

[0045] 在鮟鱇鱼皮碎片中加入45 L质量分数为0.25% NaOH溶液，浸泡30 h后用水洗涤至pH为中性，再加入45L体积百分含量为7%的正丁醇溶液，搅拌20 h后用水洗涤至pH为中性并沥干。

[0046] 将已沥干的鮟鱇鱼皮碎片捣碎，加入75 L质量分数为0.2%的柠檬酸溶液，加热至90℃，并不断搅拌抽提9 h，过滤后得到胶原蛋白粗提液。

[0047] 向胶原蛋白粗提液中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶加入量为鮟鱇鱼皮重量1.5%，在超声波频率为25 kHz，功率为400 W，温度为40℃下进行酶解2 h；调pH为7，加入风味蛋白酶量为鮟鱇鱼皮重量0.2%，在超声波辅助下（超声波频率为25 kHz，功率为400 W）设置温度为55℃酶解5 h。

[0048] 对所得的酶解液加热至95℃，并保持7 min灭酶，灭酶所得酶解液中加入活性碳脱苦脱色，并在60℃搅2 h后过滤除去活性碳，再将脱苦脱色后的滤液置于真空旋转蒸发器中进行真空浓缩，最后喷雾干燥，所得到的鮟鱇鱼皮高F 值胶原蛋白肽的重量、纯度及F值如表1所示。

[0049] 对比方法2：制备条件与方法2完全一致，不同之处在于，未在超声波条件下进行酶解，所得到的鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的重量、纯度及F 值如表 1 所示。

[0050] 方法3：

[0051] 取洗净后的鮟鱇鱼皮1000 g用剪刀剪切成约剪成长宽为2 cm×2 cm碎片后。

[0052] 在鮟鱇鱼皮碎片中加入35 L质量分数为 0.35% NaOH溶液，浸泡30 h后用水洗涤至pH为中性，再加入25L体积百分含量为10%的正丁醇溶液，搅拌26 h后用水洗涤至pH为中性并沥干。

[0053] 将已沥干的鮟鱇鱼皮碎片捣碎，中加入60 L质量分数为0.3%的柠檬酸溶液，加热至45℃，并不断搅拌抽提7h，过滤后得到胶原蛋白粗提液。

[0054] 向胶原蛋白粗提液中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶加入量为鮟鱇鱼皮重量2%，在超声波频率为40kHz，功率为100 W，温度为30℃下进行酶解6 h；调pH为7.5，加入风味蛋白酶量为鮟鱇鱼皮重量0.1%，在超声波辅助下（超声波频率为40 kHz，功率为100 W）设置温度为40℃酶解7h。

[0055] 对所得的酶解液加热至95℃，并保持7 min灭酶，灭酶所得酶解液中加入活性碳脱苦脱色，并在50℃搅拌3 h 后过滤除去活性碳，再将脱苦脱色后的滤液置于真空旋转蒸发器中进行真空浓缩，最后喷雾干燥，获得鮟鱇鱼皮高F 值胶原蛋白肽的重量、纯度及F 值如表1所示。

[0056] 对比方法3：制备条件与方法例3完全一致，不同之处在于，未在超声波条件下进行酶解，所得到的鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的重量、纯度及F 值如表1 所示。

[0057]

[0058] 抗菌实验

[0059] 1 材料与方法

[0060] 1.1 实验材料与试剂

[0061] 鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽分子量在2000D以下。氟苯尼考，购于上海生物工程有限公司，其它试剂均为分析纯。大肠杆菌（革兰氏阴性菌）购于广东省微生物种质资源库。营养肉汤培养基、MH培养基，购于北京陆桥技术有限公司。

[0062] 1.2 仪器设备

[0063] Micct-Q型超纯水器：日本Milli-por LIMITED公司；AL-104电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；UV-2102 C型紫外分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；SN-CS-2D单人净化工作台：苏州净化设备厂；HZQ-X100A型恒温振荡培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；HVE-50高温高压灭菌锅：日本HIRAYAMA，海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司；

[0064] 1.3 实验方法

[0065] 1.3.1 供试菌株培养和样品配置

[0066] （1）将供测试的第一代菌接入相对应的试管斜面培养基上，大肠杆菌种置37℃恒温箱内均培养24 h，得到二代菌株，置于4℃冰箱中冷藏备用。

[0067] （2）以鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽mg/mL+抗生素（氟苯尼考） μg/mL以体积比3:1的比例配置不同复配液：见表2，其中，0 μg/mL 抗生素、0 mg/mL肽液用超纯水代替，进行抗菌效果研究。

[0068] 表2 供试样品配置表

[0069]样品序号 肽液浓度 抗生素浓度 肽液:抗生素（v:v）
1# 100mg/mL 0μg/mL 3:1
2# 200mg/mL 0μg/mL 3:1
3# 100mg/mL 20μg/mL 3:1
4# 200mg/mL 20μg/mL 3:1
5# 0mg/mL 20μg/mL 3:1

[0070] 1.3.2 抑菌圈测定

[0071] 采用牛津杯法，以氟苯尼考为阳性对照。大肠杆菌采用固体营养琼脂平板，接入对数生长期的受试菌(OD值为1.0左右)150 μL，涂布棒均匀涂抹，待菌液充分吸收后，分别加入1#~5#复配液各100 μL。

[0072] 将大肠杆菌置于37℃培养箱中培养24 h，游标卡尺测量各抑菌圈直径(抑菌圈直径mm以计)，拍照记录。

[0073] 1.3.3 抑菌曲线的测定

[0074] 分别取对数期受试菌菌液(OD为1.0)20 mL于培养瓶中，每种受试菌种取5个培养瓶，每个培养瓶中分别添加1#~5#复配液各10 mL，设置正常对照，培养26 h。用不加菌液和样品的培养基调零，每隔两个小时取样于600 nm处测定吸光度。

[0075] 2 结果与分析

[0076] 2.1 鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽和抗生素协同抑菌效果

[0077] 研究鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽及协同抗生素以不同配比方式配制的复配液的抗菌效果，测量抑菌圈的直径和拍摄照片，见图1和表3所示。

[0078] 由图1和表3可知，鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽液对受试菌没有抑制作用；协同抗生素作用于受试菌时，3#、4#复配液对大肠杆菌的抑菌圈分别是21.9 mm、20.8 mm，具有明显的抑制作用。与阳性对照组比，4#复配液对大肠杆菌的抑制作用显著提高。

[0079] 由此可以看出，鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽能够协同氟苯尼考作用抑制大肠杆菌，3#、4#复配液对大肠杆菌的抑制作用菌明显高于阳性对照。

[0080]

[0081] 2.2 复配液抑菌曲线测定

[0082] 以培养时间为横坐标，不同培养时间细菌悬浊液在600 nm下的OD值为纵坐标，用比浊法测定受试菌（大肠杆菌）的正常生长曲线和不同配制的复配液对受试菌的抑菌曲线，如图2所示。

[0083] 由图2可知，受试菌的生长曲线均体现延迟期、对数期、稳定期和衰亡期4个阶段，而添加了不同配制的复配液的抑菌曲线根据3种受试菌的菌种和复配液配置的不同而不同。图2中，1#和2#复配液的抑菌生长曲线和正常的细菌生长曲线形状相近，3#、4#和5#复配液的抑菌曲线明显不同程度的低于细菌的正常生长曲线，3#和4#复配液的抑菌曲线明显低于5#复配液。由此可证明：3#和4#复配液对大肠杆菌有明显的抑菌作用，且抑菌作用明显高于单用抗生素。

[0084] 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。