抗冻蛋白及从谷朊粉中提取抗冻蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种抗冻蛋白及从谷朊粉中提取抗冻蛋白的方法，而提供一种操作简单，易于产业化大规模生产的抗冻蛋白及其提取方法。所述抗冻蛋白的分子量为43.14KDa，经差示扫描量热仪测定的热滞活性为0.08℃，采用下述方法制备：以谷朊粉为原料，经碱性溶液浸提后离心、透析除盐、冷冻干燥得到抗冻蛋白粗品；所述碱性溶液的浓度为0.01‑0.09mol/L、pH值为8‑11。本发明的以小麦淀粉生产的副产物谷朊粉为原料，谷朊粉来源广发、廉价易得、蛋白质含量丰富，能够降低抗冻蛋白的成本。制备过程中未添加任何有毒有害的物质，同时，谷朊粉本身就是一种可食用性的植物性原材料，所得抗冻蛋白为天然产品，因此可以以添加剂的形式应用于食品行业。

权利要求

1.一种抗冻蛋白，其特征在于，所述抗冻蛋白的分子量为43.14KDa，经差示扫描量热仪测定的热滞活性为0.08℃，采用下述方法制备：以谷朊粉为原料，经碱性溶液浸提后离心、透析除盐、冷冻干燥得到抗冻蛋白粗品；所述碱性溶液的浓度为0.01-0.09mol/L、pH值为8-

11；所得抗冻蛋白粗品经分离纯化得到高纯度的抗冻蛋白；所述抗冻蛋白粗品分离纯化的手段为凝胶层析；所述抗冻蛋白粗品分离纯化的具体工艺为：浸提的抗冻蛋白粗品利用SepHadex G-100凝胶色谱进行分离，一次上样量为100-300μL，洗脱液为含0.1-0.2mol/L的NaCl、浓度为5-15mmol/L、pH值为8-9的Tris-HcL缓冲液，流速为0.1-0.3ml/min，在检测波长为280nm的条件下收集洗脱峰，即可得到高纯度的抗冻蛋白。

2.一种从谷朊粉中提取权利要求1所述的抗冻蛋白的方法，其特征在于，包括下述步骤：以谷朊粉为原料，以碱性溶液作为浸提液浸提，再经离心、透析和冷冻干燥得到抗冻蛋白粗品；所述碱性溶液的浓度为0.01-0.09mol/L、pH值为8-11；所得抗冻蛋白粗品经分离纯化得到高纯度的抗冻蛋白；所述抗冻蛋白粗品分离纯化的手段为凝胶层析；所述抗冻蛋白粗品分离纯化的具体工艺为：浸提的抗冻蛋白粗品利用SepHadex G-100凝胶色谱进行分离，一次上样量为100-300μL，洗脱液为含0.1-0.2mol/L的NaCl、浓度为5-15mmol/L、pH值为

8-9的Tris-HcL缓冲液，流速为0.1-0.3ml/min，在检测波长为280nm的条件下收集洗脱峰，即可得到高纯度的抗冻蛋白。

3.根据权利要求2所述的从谷朊粉中提取抗冻蛋白的方法，其特征在于，所述碱性溶液为NaOH溶液。

4.根据权利要求2或3所述的从谷朊粉中提取抗冻蛋白的方法，其特征在于，浸提的温度为10-55℃。

5.根据权利要求4所述的从谷朊粉中提取抗冻蛋白的方法，其特征在于，浸提的提取时间为1-4h。

6.根据权利要求4所述的从谷朊粉中提取抗冻蛋白的方法，其特征在于，所述离心的条件为：4-10℃下以6000-10000r/min的速率离心10-30min。

7.根据权利要求4所述的从谷朊粉中提取抗冻蛋白的方法，其特征在于，谷朊粉的质量浓度为3-10％。

8.权利要求1所述的抗冻蛋白在农业、生物技术和食品领域的抗冻方面的应用。

9.权利要求2中制备得到的抗冻蛋白粗品在农业、生物技术和食品领域的抗冻方面的应用。

说明书

抗冻蛋白及从谷朊粉中提取抗冻蛋白的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及食品工程技术领域，特别是涉及一种抗冻蛋白及从谷朊粉中提取抗冻蛋白的方法。

背景技术

[0002] 低温胁迫是一种严重的自然灾害，它对大多数生物体都是致死性的，它导致细胞内环境脱水、结晶，造成细胞物理性的损害或死亡，每年因低温胁迫造成的损失高达数千亿美元。

[0003] 另一方面，目前的冰淇淋等速冻食品在凝结、冷冻、运输、储存及销售的过程中，冷量消耗的越多，产品的冰晶体才能保证越小，即使冷量供应很大，但是温度的上下波动照样会造成冰晶体的长大以致口感粗糙。如果有种物质能将水分子的流动性从开始就控制住，并且随温度的波动，水分子的运动难以进行则不但保证了产品的质量，而且能降低耗冷量，减少用电，降低能耗，节约成本，符合低碳经济的发展。

[0004] 抗冻蛋白（anti-freezing proteins,AFP）是一类具有特殊功能的蛋白质，其存在于各种生命体中。它通过与冰晶结合来降低冰晶生长的温度和改变冰晶形成的大小和形态，从而起到重结晶抑制效应；而且它能以非依数性形式降低水溶液的冰点而对其熔点影响甚微，于是导致水溶液的熔点(melting point,MP)和冰点(freezing point,FP)之间出现一定的热滞活性(thermal hysteresis activity,THA)而产生热滞效应，从而帮助各种生物体抵御寒冷的环境。

[0005] 抗冻蛋白以其独特的功能在低温冷链的众多食品加工和运输过程中、在医学器官移植等各个领域都发挥着重要作用。

[0006] 已有植物性抗冻蛋白的提取主要集中在高山高寒地区的高山雪莲、黑麦草、内蒙古沙冬青等植物性原材料，但这些原材料不易得到，并且其提取方法以“冰手指法”为主，不适合大规模的生产。

发明内容

[0007] 本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种操作简单，易于产业化大规模生产的抗冻蛋白及其提取方法。

[0008] 为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

[0009] 一种抗冻蛋白，所述抗冻蛋白的分子量为43.14KDa，经差示扫描量热仪测定的热滞活性为0.08℃，采用下述方法制备：以谷朊粉为原料，经碱性溶液浸提后离心、透析除盐、冷冻干燥得到抗冻蛋白粗品；所述碱性溶液的浓度为0.01-0.09mol/L、pH值为8-11。

[0010] 一种从谷朊粉中提取抗冻蛋白的方法，其特征在于，包括下述步骤：以谷朊粉为原料，以碱性溶液作为浸提液浸提，再经离心、透析和冷冻干燥得到抗冻蛋白粗品；所述碱性溶液的浓度为0.01-0.09mol/L、pH值为8-11。

[0011] 所述碱性溶液为NaOH溶液。

[0012] 浸提的温度为10-55℃。

[0013] 浸提的提取时间为1-4h。

[0014] 所得抗冻蛋白粗品经分离纯化得到高纯度的抗冻蛋白；所述抗冻蛋白粗品分离纯化的手段为凝胶层析。

[0015] 抗冻蛋白粗品分离纯化的具体工艺为：浸提的抗冻蛋白粗品利用SepHadex G-100凝胶色谱进行分离，一次上样量为100-300μL，洗脱液为含0.1-0.2mol/L的NaCl、浓度为5-15mmol/L、pH值为8-9的Tris-HcL缓冲液，流速为0.1-0.3ml/min，在检测波长为280nm的条件下收集洗脱峰，即可得到高纯度的抗冻蛋白。

[0016] 所述离心的条件为：4-10℃下以6000-10000r/min的速率离心10-30min。

[0017] 谷朊粉的质量浓度为3-10%。

[0018] 上述的抗冻蛋白在农业、医学、生物技术和食品领域的抗冻方面的应用。

[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0020] 1、本发明的抗冻蛋白以小麦淀粉生产的副产物谷朊粉为原料，与其它植物性抗冻蛋白提取的原材料相比，谷朊粉来源广发、廉价易得、蛋白质含量丰富，能够降低抗冻蛋白的成本。

[0021] 2、本发明的抗冻蛋白的制备过程中未添加任何有毒有害的物质，同时，谷朊粉本身就是一种可食用性的植物性原材料，所得抗冻蛋白为天然产品，因此可以以添加剂的形式大规模的应用于食品行业。

[0022] 3、本发明通过碱液粗提、凝胶层析纯化、透析除盐、冷冻干燥等方法从谷朊粉中将抗冻蛋白提取出来，操作过程简单，易于实现大规模生产。而且，显著的提高了谷朊粉的利用价值，为小麦谷朊粉的深加工提供了新的途径。

[0023] 4、本发明的抗冻蛋白的提取方法通过合理确定碱性溶液的浓度为0.01-0.09mol/L、pH值为8-11时，使得抗冻蛋白能够最大程度的保留其原有活性。

附图说明

[0024] 图1所示为本发明实施例1中的抗冻蛋白粗品经SepHadex G-100凝胶色谱分离的图谱；

[0025] 图2所示为本发明实施例1中经纯化的抗冻蛋白各组分的SDS-PAGE电泳图谱；

[0026] 图3所示为本发明实施例1中纯化的抗冻蛋白P2组分的熔点扫描图谱；

[0027] 图4所示为本发明实施例1中纯化的抗冻蛋白P2组分当保留温度为-0.83℃时的冰点扫描图谱。

具体实施方式

[0028] 以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

[0029] 实施例1

[0030] （1）抗冻蛋白粗品的提取制备

[0031] 称取10g谷朊粉溶解于150ml的0.09mol/L、pH值为11的NaOH溶液中，在水浴锅中保持提取温度55℃的条件下恒温搅拌2h，然后在7500r/min、4℃的条件下离心15min，取上清液，在7Ku的透析袋内透析过夜，冷冻干燥24h，得抗冻蛋白粗品1.837g，抗冻蛋白粗品的得率为18.37%。

[0032] （2）抗冻蛋白粗品的纯化

[0033] 将提取分离的抗冻蛋白粗品复溶于10mmol/L、pH值为8.5的Tris-Hcl缓冲液中配制成20mg/ml的粗蛋白溶液，采用SepHadex G-100凝胶色谱进行层析分离，凝胶色谱分离图谱如图1所示，层析所采用的层析柱规格为φ1.0cm×10cm，用10mmol/L、pH值为8.5的Tris-Hcl缓冲液进行预平衡，上样200μL，洗脱液为10mmol/L、pH=8.5的Tris-Hcl缓冲液（含0.15mol/L的NaCl），流速为0.3ml/min，检测波长为280nm，收集洗脱峰P1、P2，进行冷冻干燥得到P1组分和P2组分。

[0034] （3）抗冻活性的鉴定

[0035] 将P1组分和P2组分分别配制成10mg/ml的蛋白溶液，取10μl置于铝制液体坩埚中，按照设定的温控程序进行热滞活性的测定：

[0036] a、以5℃/min的速率由室温降至-30℃，保持5min；

[0037] b、以1℃/min的速率由-30℃升至20℃，记录样品熔点Tm；

[0038] c、以1℃/min的速率由20℃降至-30℃，保持5min；

[0039] d、以1℃/min的速率由-30℃升至固液混合态（保留温度Th），保留2min；

[0040] e、以1℃/min的速率由Th降至-30℃，记录样品体系开始结晶的温度T0；计算热滞活性THA=Th-T0。

[0041] 按照上述设定的温控程序进行P2组分的热滞活性的测定，P2组分的熔点扫描图谱如图3所示，测得P2组分的熔点Tm=-0.19℃，当确定其保留温度Th=-0.83℃时，P2组分的冰点扫描图谱如图4所示，冰点T0=-0.91℃，经计算得：抗冻蛋白P2组分热滞活性THA=Th-T0=0.08℃，因此，P2组分即为高纯度的抗冻蛋白。

[0042] 采用同样方法进行P1组分的热滞活性的测定，经计算P1组分的热滞活性为0℃，因此，P1组分不具有抗冻活性。

[0043] 所得高纯度的抗冻蛋白（即P2组分）为0.865g，经微量凯式定氮法测定氮和总蛋白的含量为0.746g，高纯度的抗冻蛋白得率为8.65%，其相对纯度为86.24%。

[0044] （4）SDS-PAGE电泳测定纯化的抗冻蛋白分子量

[0045] 将所得高纯度的抗冻蛋白（即P2组分）配制成1mg/ml的溶液，经SDS-PAGE电泳测定，SDS-PAGE电泳图谱如图2所示，其分子量为43.16KDa。

[0046] 实施例2

[0047] （1）抗冻蛋白粗品的提取制备

[0048] 称取5g谷朊粉溶解于100ml的0.07mol/L、pH值为8.2的Tris-Hcl缓冲液中，在水浴锅中保持提取温度30℃的条件下恒温搅拌2.5h，然后在8000r/min、4℃的条件下离心20min，取上清液，在7Ku的透析袋内透析过夜，冷冻干燥24h，得抗冻蛋白粗品0.972g，抗冻蛋白粗品的得率为9.72%。

[0049] （2）抗冻蛋白粗品的纯化

[0050] 将提取分离的抗冻蛋白粗品复溶于10mmol/L、pH=8.0的Tris-Hcl缓冲液中配制成20mg/ml的粗蛋白溶液，采用SepHadex G-100凝胶色谱进行层析分离，凝胶色谱分离图谱与图1基本相同，层析所采用的层析柱规格为φ1.0cm×10cm，用10mmol/L、pH=8.0的Tris-Hcl缓冲液进行预平衡，上样150μL，洗脱液为10mmol/L、pH=8.0的Tris-Hcl缓冲液（含0.1mol/L的NaCl），流速为0.2ml/min，检测波长为280nm，收集洗脱峰P1和P2。将洗脱峰P2冷冻干燥得到纯化的抗冻蛋白P2组分为0.326g，经微量凯式定氮法测定氮和总蛋白的含量为0.378g，高纯度的抗冻蛋白的得率为3.26%，其相对纯度为86.32%。

[0051] （3）SDS-PAGE电泳测定纯化的抗冻蛋白分子量

[0052] 将所述高纯度的抗冻蛋白P2组分配制成1mg/ml的溶液，经SDS-PAGE电泳测定，SDS-PAGE电泳图谱与图2基本相同，其分子量为43.21KDa。

[0053] （4）经纯化的抗冻蛋白组分进行抗冻活性的鉴定

[0054] 将经纯化的谷朊粉抗冻蛋白组分P2配制成10mg/ml的蛋白质溶液，取10μl置于铝制液体坩埚中，按照设定的温控程序进行热滞活性的测定，熔点扫描图谱与图3基本相同，测得P2组分的熔点Tm=-0.19℃，当确定其保留温度Th=-0.51℃时，冰点扫描图谱与图4相似，冰点T0=-0.59℃，经计算得：抗冻蛋白P2组分热滞活性THA=Th-T0=0.08℃，P2组分即为抗冻蛋白。

[0055] 实施例3

[0056] （1）抗冻蛋白粗品的提取制备

[0057] 称取15g谷朊粉溶解于150ml的0.01mol/L、pH值为8.9的PBS缓冲液中，在水浴锅中保持提取温度25℃的条件下恒温搅拌4h，然后在8500r/min、4℃的条件下离心10min，取上清液，在7Ku的透析袋内透析过夜，冷冻干燥24h，得抗冻蛋白粗品0.863g，抗冻蛋白粗品的得率为8.63%。

[0058] （2）抗冻蛋白粗品的纯化

[0059] 将提取分离的抗冻蛋白粗品复溶于10mmol/L、pH=8.2的Tris-Hcl缓冲液中配制成20mg/ml的粗蛋白溶液，采用SepHadex G-100凝胶色谱进行层析分离，凝胶色谱分离图谱与图1基本相同，层析所采用的层析柱规格为φ1.0cm×10cm，用10mmol/L、pH=8.2的Tris-Hcl缓冲液进行预平衡，上样180μL，洗脱液为10mmol/L、pH=8.2的Tris-Hcl缓冲液（含0.1mol/L的NaCl），流速为0.25ml/min，检测波长为280nm，收集洗脱峰P1和P2。将洗脱峰P2冷冻干燥得到纯化的抗冻蛋白P2组分为0.313g，经微量凯式定氮法测定氮和总蛋白的含量为0.365g，高纯度的抗冻蛋白的得率为3.13%，其相对纯度为85.87%。

[0060] （3）SDS-PAGE电泳测定纯化的抗冻蛋白分子量

[0061] 将所述高纯度的谷朊粉抗冻蛋白P2组分配制成1mg/ml的溶液，经SDS-PAGE电泳测定，SDS-PAGE电泳图谱与图2基本相同，其分子量为43.18KDa。

[0062] （4）经纯化的抗冻蛋白组分进行抗冻活性的鉴定

[0063] 将经纯化的抗冻蛋白组分P2配制成10mg/ml的蛋白质溶液，取10μl置于铝制液体坩埚中，按照设定的温控程序进行热滞活性的测定，熔点扫描图谱与图3基本相同，测得P2组分的熔点Tm=-0.19℃，当确定其保留温度Th=-0.21℃时，冰点扫描图谱与图4相似，冰点T0=-0.29℃，经计算得：抗冻蛋白P2组分热滞活性THA=Th-T0=0.08℃，P2组分即为抗冻蛋白。

[0064] 本发明采用单一廉价的碱性溶液浸提以及易于扩大制备规模的凝胶层析技术分离纯化抗冻蛋白，整个工艺操作过程简单有效，所得产品纯度较高，所得谷朊粉抗冻蛋白产品可作为添加剂应用于冰淇淋等速冻冷饮行业以及农业、医学、生物技术等领域，从而实现谷朊粉的高效利用，为植物性抗冻蛋白的提取提供新的途径。

[0065] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。